Summary
En steg-för-steg-protokoll för interpositions placering av vävnadstekniska Fartyg (TEVS) in i halspulsådern av ett får med hjälp av end-to-end anastomos och realtids digitala bedömning in vivo tills djuroffer.
Abstract
Utvecklingen av vävnadstekniska Fartyg (TEVS) är avancerad med förmågan att rutinmässigt och effektivt implantat TEVS (4-5 mm i diameter) i en stor djurmodell. En steg för steg-protokoll för interpositionella placeringen av TEV och realtid digitala bedömning av TEV och nativa karotidartärema beskrivs här. In vivo övervakning möjliggörs genom implantation av flödessonder, katetrar och ultraljuds kristaller (kapabel inspelnings förändringar dynamiska diameter av implanterade TEVS och infödda halspulsåder) vid tiden för operationen. När implanteras, forskare kan beräkna arteriella blodflödesmönster, invasiva blodtryck och artär diameter som ger parametrar såsom pulsvågshastigheten, augmentation index, pulstryck och efterlevnad. Datainsamling åstadkommes med användning av ett enda datorprogram för analys under hela varaktigheten av experimentet. Sådan ovärderlig data ger inblick i TEV matrix remodeling, dess resemblance till infödda / skenkontroller och övergripande TEV prestanda in vivo.
Introduction
Det primära fokus för utvecklingen av TEVS har varit att ge en ersättning för autologa transplantat byte när autologa fartyg inte är tillgängliga och att begränsa donator sikte sjuklighet. Till exempel har antalet kranskärlsoperationer per år översteg 350.000 i USA, och den ideala källan för lämpliga transplantat förblir den vänstra inre bröstartären, vänster främre nedåtgående kransartären och saphenusvenen 1. Eftersom många personer som lider av kärlsjukdomar kanske inte har lämpliga artärer och vener för autologa transplantat ersättare, har utvecklingen av TEVS därmed blivit ett intensivt forskningsområde i årtionden 1-6. Medan teknik och optimering av nya TEVS har genomgått många framsteg, rapportering om de kirurgiska tekniker som används för att implantera TEVS själva har inte varit ett ämne för en sådan intensiv diskussion. Snarare är protokoll rörande implantation av TEVS i djurmodeller till stor del kvarupp till forskning undersökare.
Följande manuskriptet visar hur du implantera TEVS genom att utnyttja en end-to-end anastomos tillvägagångssätt. Detta förfarande optimerades genom användning av en specifik anastomotisk suture mönster, stabiliserande suturen tekniken, optimerar longitudinell spänning och tillägg av in vivo övervakning instrumentering. Denna metod står i kontrast med några av de många variationer som tidigare har använts. Vidare beskriver denna procedur hur jag ska få parametrar såsom blodtryck, TEV diameter / efterlevnad och flödeshastigheten genom TEV efter operationen fram till explantation. Denna insamling av data ger en oumbärlig analys av TEV medan den är i färd med ombyggnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll har godkänts av Animal Care och användning kommittén vid State University of New York at Buffalo.
1. Förhands kirurgisk Förberedelse
- Använd får (Dorset kors, kvinna, cirka 1-3 år gammal med en vikt på 40-60 kg) för följande studie. Administrera cyklosporin A (200 mg / dag), acetylsalicylsyra (975 mg / dag), och Waran (20-30 mg / dag) genom munnen, med start 3 dagar innan operationen och fortsätta under hela alla studier.
- Se till fåren har fastat 12 timmar före operation (normal matning = 1,8 kg hö och 0,4 kg korn).
- Sterilisera alla kirurgiska utrustning finns med en ångautoklav vid 121 ° C och 15 psi under 30 minuter.
- Placera följande poster i en paraformaldehyd exsickator 48 h före operation: 4 mm Doppler flödessonder, 1 mm ultraljud kristaller, kvarliggande artärkatetrar, förlängningslang och 42 "Tygonrör.
OBS: En tabell av relevant medicinsk utrustning som behövs förkirurgi och för sterilisering är listad i tabell 1. Pre-placering av instrumentering i Tygon-slang i detta steg kommer att hjälpa till att spara tid under kirurgi.- Märk varje ände av sonder, katetrar och kristaller som vänster och höger, om tillämpligt.
2. Kirurgisk Operation
- Inducera får för anestesi med diazepam (0,5 mg / kg) och ketamin (4 mg / kg) intravenöst (IV). Alternativt kan du använda Telazol (4 mg / kg) IV.
- Utför orotracheal intubation med en 8,5-10,0 mm innerdiameter kuffad endotrakealtub 7.
- Administrera inhalant anestesi genom en andningskrets med en tidalvolym ventilator (7-10 ml / kg) eller en tryckreglerad ventilator (15-20 cm H2O). Använd en precisions Vaporizer att administrera isofluran eller sevofluran vid en lämplig mängd (3% -4% initialt) att nå ett medium till djupt kirurgisk narkos skede. Den minsta alveolära koncentration förfåren är 1,4% eller 1,9% respektive 8.
- Bedöm narkosdjup genom att observera motor respons på stimuli, ögonlocksreflexer, ögonläge och hjärtfrekvens. Övervaka blodets syremättnad (95% -100%) med hjälp av pulsoximetri, CO 2 koncentration (45-55 mmHg) i utandningsgaser med hjälp kapnografi och upprätthålla kroppstemperaturen under förfarandet (38,5-39,5 ° C) med hjälp av en automatisk reglerad värmande filt.
- Raka ull från hela halsen av fåren, och över en cefalvenen, med hjälp av en # 40 blad på standard Clippers. Förbered huden på båda platserna för kirurgi med användning av 70% isopropylalkohol och 7,5% Betadine scrub mättad gasväv. Börja med alkohol gasväv för att underlätta avlägsnandet av hudfett. Växla mellan Betadine gasväv och alkohol gasväv tre gånger.
- Placera fåren på operationsbordet i ryggliggande ovanpå en värmande filt. Passera en medelstor orogastric röret för att möjliggöra passiv utvisning av maginnehållet. Förlängfåra hals och använda stödjande dämpning som behövs för att upprätthålla placeringen.
- Utför en slutlig aseptisk scrub med användning 7,5% Betadine indränkt gasbinda och låt stå i 5 minuter före operation.
- Administrera IV vätskor (Ringer-laktat lösning eller 0,9% saltlösning) vid 10 ml / kg / h genom en angiokat placerad i cefalvenen. Administrera intraoperativa antibiotika och smärtlindring: penicillin G prokain 6,600 U / kg intramuskulärt (IM), Gentamicin 1,6 mg / kg IM, och buprenorfin 0,005-0,01 mg iv eller im.
- Gör en ~ 12 cm snitt på längden över den ventrala mittlinjen halsen med hjälp electro diatermi. Isolera vänster och höger halspulsåder (~ 6 cm) genom att ta bort bindväv med hjälp av en dissektion teknik. Knyt upp och bränna mikro fartyg förgrenar från halspulsåder för att minimera blödning.
- Behåll sterilitet genom att använda (en icke-steril) kirurgisk sjuksköterska att hjälpa till med att gräva alla ledningar och slangar (flödessond, ultraljudskristalltrådaroch kateterrör) i den subkutana hudlagret. Använd en trubbig trocar, vilket går ut genom den kirurgiskt prepped snitt vid dorsolaterala halsen.
- Nå under steril duk och vrid huvudet av fåren så att sidan av halsen kan visualiseras under lakanet.
- Använd en 8 cm böjd hemostat till tunnel genom det subkutana utrymmet mellan den ventrala mittlinjen hals snitt och den sidan av halsen. Öppna och stänga hemostat att rent ut dissekera ett utrymme för slangen ~ 1,5 cm bred. Spetsarna av hemostat bör uppe halvvägs mellan huvud och axlar, ca 10 cm kaudalt till höger eller vänster öra. Vrid hemostat så att spetsarna pekar mot den ytliga huden.
- Nå under steril duk och göra en 1,5 cm snitt genom huden, över spetsarna på hemostat med en steril # 11 blad. Visualisera spetsarna på hemostat för att bekräfta en tydlig exit genom huden.
- Passera Tygon rör innehållande enll ledningar och slangar genom subkutana tunneln. Håll trådarna och slangar ovanför steril duk.
- Nå under lakanet för att ta bort det yttre Tygonrör från halsen, utsätta den implanterade ledningar som den lämnar halsen av fåren. Drag enskilda linjer ut att minimera eventuella slack i den subkutana utrymmet. Lämna tillräckligt avstånd för att ordentligt fästa instrumentering till artären.
- Placera 4 mm Doppler flödessonder på båda halspulsådrorna och uppnå en initial avläsning (Figur 1). Administrera 100 U / kg heparin iv 30 minuter innan fastspänning artären.
- Fortsätt heparin administration vid 100 U / kg / timme fram till slutet av operationen. Kläm halspulsådern med hjälp av icke-kross vaskulära klämmor och skära en del (ca 4 cm långa). Den kontralaterala karotis flödeshastighet kommer att öka 50% -100% för att upprätthålla blodflödet till hjärnan.
OBS: Det är möjligt att begränsa longitudinell sträckning genom rekylen av infödda kärl genom att ta bortkortare segment än ersätts och / eller sträcka den infödda artären med kärlklämmor att förkorta gapet till dess att full anastomotisk förfarande är avslutat. Detta kommer att bidra till att begränsa spänningen på enskilda innehav suturer och implanterade transplantat. - Sutur TEV på plats med hjälp av enkla avbrutna stygn med 7-0 prolin ethalloy dubbel väpnad monofilamentsutur. Om så är nödvändigt, applicera vaskulära glatta muskelavslappnande såsom Papaverin (15 mg / ml) eller nikardipin (1,25 mg / ml) topiskt till den nativa vaskulaturen i syfte att förhindra vasokonstriktion vilket skulle kunna hämma anastomotisk suturering.
OBS: Börja placera suturer med ca 1 mm mellanrum. Detta kan i hög grad variera från fall till fall. Sammansättningen och TEV tjocklek kommer att påverka effektiva avståndet mellan suturer. Eftersom tjockleken av den nativa vävnaden eller TEV minskar, kan det vara nödvändigt att placera suturerna närmare varandra.- Första ankare fyra punkter i TEV till infödda artär genom att placera två motsatta stitches på både proximala och distala ändar (figur 2 -di). Håll varje ankare visas med hjälp peanger.
OBS: proximala och distala beskrivningar är i referens till riktningen för blodflödet i hela papperet. - Lägg 5-6 ytterligare suturer på den ytliga sidan av både de proximala och distala ändarna för att påbörja anastomos. (Figur 2-Pr). Samtidigt rotera kärlklämmor 180 grader.
- Återupprätta spänning på förankrings suturer. Tillsätt ytterligare (5-6) avbruten suturer att proximala och distala ändar på roterad sida av TEV.
- Första ankare fyra punkter i TEV till infödda artär genom att placera två motsatta stitches på både proximala och distala ändar (figur 2 -di). Håll varje ankare visas med hjälp peanger.
- När TEV är ordentligt sys på plats, vrid den tillbaka till ursprungsläget och ta bort kärlklämmor en i taget, distal klämma först. Lätt blödning vid anastomosen platser är vanligt. Detta kan naturligtvis lösa efter flera minuter av kläm release och reclamping eller kräva placeringen av ytterligare suturer. Placera Doppler flödessond (figur 3-Fl) Tillbaka på infödda artär proximalt till blodflödet in i TEV och monitor flöde.
OBS: Räkna flödeshastigheterna för de vänstra och högra hals att jämvikta efter ca 15 min. Om flödet på halspulsådern med implanterade TEV tappar stadigt, är det möjligt TEV är koagulering. Andra möjliga avvikelser rörande flöde kan tillskrivas sammandragning av den nativa artärer proximalt eller distalt till TEV. Om detta inträffar, kan användningen av ytterligare vaskulär glatt muskelavslappnande tillämpas, och personen fartyget bör återgå till en basal ton efter 30-60 min efter stängningen av vävnad över transplantationsstället.- Om så önskas, skära den kontrahalspulsådern och sutur den på plats som en "Sham" kontroll. Detta är mer kliniskt relevant än att låta den högra halspulsådern ensam och bara fästa flödessond, ultraljudskristaller och kateter. Om en bluff kontroll önskas, utföra denna innan du fortsätter till steg 2.11.
- Sutur 1 mm ultraljuds kristaller (Figur 3 -cr1 CR2) till motstående sidor av TEV använder 7-0 Proline. Tråd sutur genom ultraljuds kristall huvudet och sy endast ytliga lagret av TEV.
- ANVÄNDA KATETER artären med hjälp av en modifierad 18 G kateter med en teflon vävd knappslå (Figur 3 Ca & Figur 4A). Placera kateterns distala till TEV på nativt arteriell vävnad.
- Sutur knappslå till artärväggen med 5/0 Ethibond att kontrollera eventuella blödningar. Använd cyklohexanon att fästa microslangen till katetern som har spolats med saltlösning. Använd slangen som en förlängning linje.
- Använd en 20 G Luer Stub Adapter med en Surflo Injection Plug att täta exterioriserades slutet av slangen (Figur 4B). För att bibehålla öppenheten hos katetern, få grundvolym av linjen och spola den med 10 ml koksaltlösning och sedan 5000 U / ml heparin natrium injektion var 2-3 dagar.
- Anteckna avståndet mellan flödessond och ultraljud kristaller, liksom avståndet mellan flödessond och katetern. Detta kommer att möjliggöra pulsvågshastigheten skall beräknas i samband med mjukvaran. Om sådana beräkningar inte behövs, inte implantera en kateter.
- Skaffa en intraoperativ läsning om så önskas för att säkerställa alla implantat hårdvara är funktionella (se avsnitt 3).
- Säkra implanterade linjer och kablar till närliggande muskulatur använder 2/0 Silk och en konisk nål (Figur 3).
- Placera vaskulära flödet sondtråd parallellt med fartyget, med sonden caudal och tråden sträcker cranially, och sedan göra en "U-Turn" mot den laterala muskulaturen. Fäst kabeln till intilliggande muskulatur, med hjälp 2-0 silke på en kona nål på två ställen, så att tråden eller flödessond kan inte placera någon belastning på fartyget. Glöm suturer ordentligt men inte för hårt och STRYPA musculaTure (Figur 3).
- Sutur kristall ledningar och arteriell kateter linje till den laterala muskulaturen, vilket möjliggör ~ 1,5 cm av slack, liknande tidigare steg för att säkra flödet sond (figur 3).
- Grupp alla ledningar och linjer tillsammans och förankra dem till muskulaturen strax innan du avslutar ut genom subkutan tunnel, liknar föregående steg.
- Stäng operationsområdet med en 2-0 Vicryl sutur i skikt med en kör sutur mönster på facia och subdermal, rinnande madrass sy på huden (facia, icke-skärande nål, hud, skärande nål). Stäng 1,5 cm snitt vid ryggens halsen runt exterioriserades ledningar och ledningar med hjälp av 2/0 Vicryl och en skär nål.
- Place flödessond trådar, kateter linjer, och ultraljudskristall kablarna i en påse (10 cm x 10 cm) som är säkert suture på huden hos fåret (figur 5 - efter återvinning).
- Gradvis avvänja fåret från anestesioch tidalvolym respirator extubera sedan fåren när spontanandning återupptas. Avlägsna angiokat insatt i cefalvenen och bandage om det behövs.
- Bandage halsen med hjälp trippel antibiotisk salva på snitten, en Telfa pad, stretch rulle gasbinda och elasticon.
- Administrera postoperativ analgesi: flunixinmeglumin 2,2 mg / kg im en gång under återhämtning, därefter 1,1 mg / kg im en gång om dagen under två dagar, buprenorfin 0,005-0,01 mg IV eller IM två gånger dagligen under en dag.
3. In vivo-övervakning
- Placera fåren i mobila vagn för att säkerställa korrekt återhållsamhet. Detta gör att fåren att behålla lugnet och medveten utan att kompromissa med hårdvaran. Kan behöva vänja fåren till i varukorgen 2 eller 3 gånger i 30 minuter innan man erhållit instrumentering inspelningar.
- Ta bort alla kablar och ledningar från påsen och ansluta till övervakningsutrustning. Anslut flödes sonden till en flödesmätare, 1 mm ultraljudskristaller anslutna till TRB-USB Box, och kateter linjer till tryckgivare. Ett flödesschema för denna installation är anordnad (fig 6).
- Kalibrera flödes sonder och tryckgivare före datainsamling.
OBS: På grund av potentiella variabilitet mellan programversioner och skillnader i utrustning som används, kalibreringar och inställningar kommer att variera från fall till fall. - Utnyttja ett oscilloskop att finjustera Sonometrics kristall mätning, enligt tillverkarens protokoll.
- Rekord data med hjälp av datorprogram (Figur 7). Spår i den övre halvan av figur 7 i vit färg motsvarar den implanterade TEV, medan spår i den nedre halvan i röd färg motsvarar Sham / Native. För både TEV och Sham flödeshastigheten (ml / min), arteriellt blodtryck (mm Hg) och diameter (mm) in live.
- Spela in i minst 1 minut utan störningar. Exportera dessa data för mer detaljerad analys. Efter inspelningen DISCONNect alla ledningar och plats tillbaka i påsen sys på halsen av fåren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mer än 30 fåren har genomgått kirurgisk teknik som beskrivs i denna rapport för implantation av TEVS (under tryckning) 9. En tabell som sammanfattar de senaste får verksamheten efter protokolloptimering visas i tabell 2. Alla får återvunna efter TEV implantation utan livshotande komplikationer. I vissa djur, ades fibros observerats i native artär nära spetsen av den inneboende arteriell kateter. En betydande ökning av inflammation med förekomsten av tillsatt instrumentering har inte observerats. Sällan (1 av 18 katetrar), har katetern orsakat hinder för blodflödet genom TEV. Här en obstruktion inträffade efter en månad. Mindre komplikationer från katetern inkluderar dämpning av arteriella signalen och oförmåga att aspirera blod. De vanligaste rapporterade data när bedriver forskning i TEV utveckling är typiskt öppna kärl, flöden och efterlevnad. Detta protokoll visar att det är möjlosynligt att erhålla sådana värdefulla data under hela experimentet. Även om denna rapport fokuserar på förvärv av flödet, diameter och artärtryck; efterlevnad, augmentation index och puls-våghastighet kan också beräknas.
Figur 1. Isolerade halspulsådern. Isolerade halspulsådern visas med bifogade flödessond. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Implantation av TEV. Figur 2-Di illustrerar den distala sidan av TEV med två av de ursprungliga fyra ankarpunkter som används för att förankra TEV på plats. När TEV är förankrad, lägga Addit ional stygn som visas i figur 2-Pr, som betecknar den proximala sidan av TEV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Instrumentering TEV. 1 mm ultraljudskristaller sys på varje sida av den implanterade TEV (CR1 och CR2). Di betecknar den distala sidan av TEV medan Pr betecknar proximalt. Den flowprobe (Fl) är placerad proximalt från TEV medan katetern (Ca) är placerad distalt. Flödes sond och kateter sys till närliggande muskulatur (streckad oval). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
en "src =" / filer / ftp_upload / 52.354 / 52354fig4.jpg "/>
Figur 4A. Kateter används för instrumentering av TEV. Kateter i kombination med en teflon plaquet innan de släpps distalt TEV på naturliga vävnaden. Figur 4B. Slutmontering av kateter före implantation. Kateter utökas med Tygonrör (betecknas med kvadrat) tillsammans med 20 G Luer Stub Adapter med Surflo injektionsplugg (betecknas med oval). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Påse fäst till huden hos får. Pouch är fäst vid halsen av får för att skydda ledningar av en mm ultraljuds kristaller, flödessond och katetern när den inte används. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Flödesschema av elektronik som används för att spela in ultraljudskristall avstånd, blodflödet och arteriell tryck. Flödesschema för installation som används för att spela in avstånd mellan ultraljuds kristaller, arteriellt blodflöde och artärtryck. * Använda ett oscilloskop kan hjälpa till tydligheten i de signaler som tas emot från de 1 mm ultraljuds kristaller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Registrering av realtids ultraljud kristall avstånd, blodflöde och arteriella trycket på datorprogram. Vit färgade spår indicate inspelningar från TEV. T01 R02 och T02 R01 indikerar kommunikation mellan ultraljudskristall CR1 att CR2 och CR2 till CR1 respektive. ARP indikerar inspelade artärtrycket medan ABF indikerar arteriella blodflödet. Samma beteckningar används för rödfärgade spår som är den infödda / bluff halspulsådern. Den inspelade avståndet mellan ultraljuds kristallerna under den inspelade pulstrycket artärtrycket indikerar procent överensstämmelse TEV / Sham. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Medicinsk utrustning | ||||
| Utrustning | Tillverkare | Serial / Catalog # | Kvantitet | Anmärkningar |
| Tryck TransdUCER | Becton Dickinson | P23XL-1 | 1+ (1 för varje artär) | Används med vattenfyllda membran kupoler |
| Förstärkare och givar box | Gould | 5900 Signal Condi Cage | 1 | Två givare och förstärkare bör ingå i bur. Även om detta specifika enheten kan avbrytas, kommer andra kommersiellt tillgängliga tryckgivare med BNC / analog utgång kommunicera med Sonometrics utrustningen. |
| T403 Console med TS420 perivaskulär flödesmätare modul (x2) | Transonic Systems | T403-modul och TS420 (x2) | 1 | Flödes sonder som mäter flödet genom varje halspulsåder kommer att ansluta till var och en av TS420 enheterna. |
| Digital ultraljud mätenhet | Sonometrics | TR-USB | ||
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | 2 | ||
| 1 mm Sonometrics Kristaller | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | 2-4 (2 för varje artär) | |
| Kateter för implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | 1+ (1 för varje artär) | Kateter kapas och fäst mikrobor slang, är stylette utnyttjas för insättning. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulering S-54-HL | NA (Kapas till önskad längd om förlängning set) | |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 G) | 1+ (En för varje arteriell kateter) | |
| Surflo Injicerbara Plug | Terumo SR-IP2 | 1+ (En för varje arteriell kateter) | ||
| Meadox | PTFE (Teflon) Filt | 019306 | NA (Skära till) | PTFE kände används i våra studier avbröts. Men jämförbara företag som "Kirurgisk Mesh" erbjuda produkter som är likvärdiga. |
Tabell 1. Tabell över all relevant utrustning som används för kirurgiska ingrepp.
| Kirurgiskt ingrepp Resultat | ||||
| Instrumentering | TEV | Sham | Antalet får | Procedur (timmar) |
| Ingen | Ja | Ingen | 8 | 2,61 ± 0,25 |
| Ingen | Ja | Ja | 3 | 4,17 ± 0,28 |
| Ja | Ja | Ja | 10 | 6,26 ± 0,75 |
Tabell 2. Sammanfattande tabell senaste fåren som har genomgått TEV och / eller Sham implantation. Följande tabell sammanfattar våra senaste TEV implantat. Alla fåren upplevt operation och hade inga komplikationer posta återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna rapport är att ge ett tillförlitligt och reproducerbart sätt för att implantat TEVS av intresse i får halspulsådern. De infödda halspulsåder av de djur som används i denna modell var 0,5-0,75 mm i tjocklek och 4,5-5 mm i ytterdiameter. Den kirurgiska tekniken som beskrivs här har varit framgångsrikt för implantering TEVS av varierande geometrier mäter 0,25-1 mm i tjocklek, 4-5 mm ytterdiameter och 4 cm i längd med stor framgång bevisar effektivt upp till 3 månader, den avsedda slutpunkten. Användningen av detta kirurgiska tekniken har gjort det möjligt att förvärva data för att vara lättare att samla in och mer konsekvent.
Dessutom har möjligheten att mäta realtidsparametrar för in vivo ombyggnad beskrivits. Olika diametrar kan användas med framgång i denna modell beroende på önskad rad obalans och design av implanterad TEV, liksom, kan tidsåtgången för implantation utvidgas till eller efter den 1 jar.
En av de största framstegen inom optimering av detta protokoll är användningen av end-to-end anastomoser använder en avbruten sutur teknik. Den nuvarande TEV designen används vid utarbetandet av denna rapport användes ursprungligen end-to-end-anastomoser med hjälp av en kör sutur teknik som resulterade i en hög felfrekvens (n = 3). Den exakta orsaken till detta är okänd, men det kunde ha potentiellt berott på den lilla stenotisk eller inte uppfyller kraven effekten av en löpande sutur på anastomotic platsen. I letar efter alternativa metoder för att optimera det kirurgiska ingreppet fann man att tidigare redovisade kirurgiska tekniker som beskrivs i litteraturen är något vaga. Detta beror främst på ord begränsningar som tidskrifter tvingar forskarna att rapportera sina kirurgiska tekniker i en kort och obskyr mode. Vissa rapporter uppger helt enkelt att djuren genomgick TEV implantation 10-12. Andra rapporterar användning av ände-till-sida 3,5,13,14, ellerend-to-end 4,6 anastomos. Slutligen andra specifikt ange användningen av avbrutna 4, eller kontinuerlig drift sutur 15. Denna brist på detaljer gör det svårt att reproducera eller förbättra kärlforskning kräver operation, speciellt på stora djurmodeller. Det finns ingen signifikant skillnad redovisas i öppenhet mellan ände mot ände och end-to-side teknik 16, i den stora djurmodell rapporteras här, är fördelaktigt end-to-end vid drift på halspulsådern på grund av anatomi och längden på TEVS utvärderas vanligen. Om emellertid en stor obalans mellan den nativa artären och TEV är närvarande, kan det vara idealiskt att anta en teknik ände-till-sida, som har visat lovande resultat i råttor 17.
Att se till att den kirurgiska tekniken är inte en orsak till TEV misslyckande ger forskare möjlighet att fokusera på andra möjliga förklaringar till ocklusion. Om korttids öppenhet och exponering för fysiologiska förhållanden såsom blodoch trycket är det enda intresset, en tidigare rapporterat manuskript finns tillgängligt. Här, har användningen av en anläggning för får ex vivo arteriovenös shuntmodell utformad för att utvärdera TEV implantability optimerats 18. Denna modell har visat sig vara mycket effektiv i snabbt testa flera TEVS med ett djur innan de bestämmer sig för att implantera en TEV för långtidsstudier.
Om utvärdera integriteten för ett implanterat TEV önskas tyvärr konventionella tekniker har nackdelar. För närvarande ultraljud eller angiografi avbildning är de enda metoder som används för att utvärdera integritet TEV in vivo 3,5,6,10-14. Ultraljudsundersökningar normalt inte ger upplösningen som krävs för att följa förändringar i TEV efterlevnad. Angiografi är invasiv, kostsamt och kräver bedövning av djuret. Men genom implanterar flödessonder, arteriella katetrar och ultraljudskristaller mycket av dessa data kan förvärvas på ett enklare sätt. Detta i sinstrumentation av den implanterade TEV möjliggör också parametrar såsom puls-våghastigheten och augmentation index som ska beräknas.
Fördelen med att använda får för TEV implantation lånar också styrka för översättning av TEVS in i en klinisk miljö. Små djurmodeller såsom möss, råttor och kaniner erbjuder inte en realistisk parallella med en klinisk miljö och därmed stora djurmodeller måste undersökas 19. Men medan en stor djurmodell är en mer tillförlitlig och kliniskt relevant modell, det finns oro för de arter som används för TEV implantationer. Hundar och grisar till exempel, medan ofta används i vaskulär forskning, endothelialize mycket snabbt. Får däremot endast endothelialize nära anastomosen platserna, och inte spontant inom TEV. Detta liknar närmare läkning av människor 14,19-22.
För att ytterligare förstå vad som skett med avseende på värd ombyggnad, denTEV måste explanteras och undersökas, för att beskriva cellmigration, immobilisering och differentiering. Tidigare arbete har visat att tillägg av lipofila färgämne, såsom Dil samt användningen av GFP + endotelceller är tillförlitliga metoder för att bedöma öde implanterade celler på TEV 5,6. Vår grupp har också visat att SRY färgning (Sex bestämmande region Y-protein) mot manligt kromosom Y är en effektiv metod för att spåra manliga implanterade celler i en kvinnlig värd (in press). Kollagen och elastin innehåll kan också mätas efter vävnad explanterad, sprider mer ljus på omfattningen av in vivo ombyggnad. Det är också möjligt att bestämma huruvida pre-implantat samt explanterade vävnader kan svara på kärlsammandragande och kärlvidgande när de placeras i ett organvävnad bad. Slutligen kan TEVS också testas för att bestämma deras mekaniska egenskaper såsom Youngs modul, brottgräns och dragpåkänning 6,9,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Heart och Lung Institute (R01 HL086582) och New York Stem Cell Science Fund (NYSTEM, Kontrakts # C024316) till STA och DDS illustrationer som används i JUPITER video fördes av John Nyquist; Medicinsk Illustrator från State University of New York at Buffalo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure Transducer | Becton Dickinson | P23XL-1 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes. |
| Amplifier and transducer box | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment. |
| T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module and TS420 (x2) | Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units. |
| Digital ultrasonic measurement unit | Sonometrics | TR-USB | Quantity: 1 |
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm | Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | Quantity: 2 |
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | Quantity: 2-4 (2 for each artery) |
| Catheter for implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | Cut to length for an extension set |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 gauge) | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Surflo Injection Plug | Terumo | SR-IP2 | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 19306 | Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent. |
References
- Goldman, S., et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).
- Achouh, P., et al. Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting. The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).
- Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics. 24, 173-183 (2002).
- Zhu, C., et al. Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).
- Kaushal, S., et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).
- Galatos, A. D. Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).
- Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep. J Anesth. 23, 392-398 (2009).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).
- Niklason, L. E., et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Dahl, S. L. M., et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).
- Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery. Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).
- Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. The fate of an endothelium layer after preconditioning. Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).
- Ueberrueck, T., et al. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).
- Labbé, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).
- Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis. Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).
- Huang, H., et al. A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels. European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).
- Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability. Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).
- Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing. Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).
- Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness. Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).
- Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Animal models for vascular tissue-engineering. Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).
- Liang, M. -S., Andreadis, S. T. Engineering fibrin-binding TGF-β1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs. Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).
- Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).
