Summary
الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole ونظائره فريبيس تظهر منخفضة السمية لخلايا مكرومولي. توضح هذه المخطوطة على رد فعل النسخ RNA، RNA التصوير مع إيثيديوم بروميد ملطخة هلام، وقياس RNA مع الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من أجل تقييم النسخ تثبيط من قبل corroles وتبين طريقة واضحة لتقييم الخصائص المضادة للسرطان مرشح.
Abstract
غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع العديد من الآثار الجانبية واستهداف محدود. Corroles هي فئة من macrocycles tetrapyrrolic التي تظهر خصائص التفاضلية تثبيط الخلايا والسامة للخلايا في خطوط خلية معينة، اعتمادا على هويات المعادن بالكلاب والمجموعات الوظيفية. سلوك فريد من corroles بين functionalized نحو خطوط معينة من الخلايا يقدم إمكانية العلاج الكيميائي المستهدفة.
يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لRNA النسخ في وجود مثبطات المعروفة والمحتملة. تقييم المنتجات RNA من رد فعل النسخ التي كتبها الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي يوفر معلومات عن خصائص مثبطة للمرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات و، مع تعديلات على الفحص، أكثر حول آلية عملها.
القليلومن المعروف عن الآلية الجزيئية عمل السمسة corrole. في هذه التجربة، ونحن نعتبر مجمعين corrole: الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc). واستخدمت مقايسة RNA النسخ لدراسة خصائص مثبطة للcorroles. وقد أعدت خمسة ردود الفعل النسخ: DNA تعامل مع أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، جورجيا (tpfc)، tpfc في [معقدة]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01، على التوالي، وعنصر تحكم غير المعالجة.
وقد تم تحليل ردود الفعل النسخ بعد 4 ساعات باستخدام الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. هناك تثبيط واضح من قبل جورجيا (tpfc)، أكتينوميسين D، وتريبتوليد triptolide.
يمكن تعديل هذا الاختبار RNA النسخ لتقديم المزيد من التفاصيل الآلية من خلال تغيير تركيزات مجمع المضادة للسرطان، DNA، أو إنزيم البلمرة، أو التي يحتضنها DNA أو البلمرة مع مجمعاتXES قبل RNA النسخ؛ ان هذه التعديلات يفرق بين آلية تثبيط تنطوي على DNA أو الانزيم. واضاف ان المجمع بعد RNA النسخ يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان المجمعات تتحلل أو يتحلل الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن هذا الاختبار أن تستخدم لدراسة المرشحين المضادة للسرطان إضافية.
Introduction
غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع آثار جانبية غير مرغوب فيها واستهداف محدود، ولكن مع مزيد من الفهم بيولوجيا السرطان، هناك الطلب المتزايد على وكلاء المضادة للسرطان مع ارتفاع فعالية استهداف السرطان وآثار جانبية أقل. 1 الخلايا السرطانية البشرية أصبحت في كثير من الأحيان تعتمد على الجين الورمي واحد المنشط أو overexpressed من أجل البقاء 2 وهكذا.، يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. العلاجات التي تمنع التعبير عن هذه الجينات تحويل فعالة في القضاء على الخلايا السرطانية وتؤدي إلى موت الخلايا. 3 خلايا تحولت هي أكثر حساسية للاضطرابات في RNA النسخ من والمقابلة الخلايا الطبيعية. 4 الأدوية المضادة للسرطان التي تمنع النسخ من المتوقع أن تمنع بشكل انتقائي التعبير عن الجينات المسرطنة والتي هي ضرورية للخلية السرطانية إلى البقاء على قيد الحياة. 5 وبالتالي، RNA النسخ طnhibition هو وسيلة مفيدة لتحديد المرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات ومعرفة المزيد عن آلية عملها. يوضح هذا البروتوكول الذي الجا (tpfc) يمنع النسخ RNA على نفس الترتيب كما أدوية العلاج الكيميائي أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. مقارنات مماثلة يمكن إجراؤها باستخدام هذا البروتوكول مع غيرها من المرشحين المضادة للسرطان المخدرات. أكتينوميسين D هو النسخ مثبط RNA التي تستخدم عادة لعلاج السرطان الحمل الأرومة الغاذية، وسرطان الخصية، ورم WILM، وrhabdomyosacoma، وساركوما 6 في يوينغ. تم أكتينوميسين D المستخدمة في علاج السرطان منذ ما يقرب من خمسين عاما منذ أن تم الموافقة عليها من أول مرة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في 1964.Triptolide هو المانع النسخ الانتقائي التي تم التحقيق فيها في التجارب المختبرية ومختلف النماذج الحيوانية الحاملة للورم لمدة 30 عاما. 7
طبيعة macrocyclic محبة للجهتين من corroles يضفي مزايا هامة على أصناف الأدوية الأخرى مثل جزيئات صغيرة أو البيولوجيةالصورة. يسمح 8-14 الحرف macrocyclic لنفاذية الخلوية أكبر من المتوقع لمثل هذه الجزيئات الكبيرة، وكانت كبيرة بما يكفي للتفاعل مع أسطح الجزيئات، مثل تلك البروتينات. ومن المعروف 8 Corroles على شكل مجمعات noncovalent ضيقة مع الجزيئات الحيوية والمخدرات. 10 وبالإضافة إلى سمية الخلايا الكامنة في إطار corrole، لقد أثبتنا أن أعمال corrole المسلفنة كما جزيء الناقل عن وكلاء العلاج الكيميائي، وتحديدا أنثراسيكلين دوكسوروبيسين المخدرات الإقحام DNA. عندما تعطى معه في corrole المسلفنة مع دوكسوروبيسين، لوحظ وجود زيادة 3 أضعاف في IC 50 من دوكسوروبيسين لDU-145 الخلايا. 9 الإطار corrole مستقر ولديه الكامنة الامتصاصية ومضان الخصائص التي، عندما بين functionalized، الخضوع لتحولات الامتصاصية فريدة والتي يمكن استخدامها لتوصيف 10 Functionalization من السقالة لا affec بطبيعتهار خصائص photophysical من corrole، 9-15 ولكن، كما رأينا مع corrole المسلفنة، وتعديل انتقائي إطار corrole يمكن أن تتغير بشكل كبير خصائصه البيولوجية (16). ونحن تقييمها من قبل ستة metallocorroles ضد سبعة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. وتشير النتائج إلى أن سمية تجاه الخلايا السرطانية البشرية تعتمد على أيون الفلز محددة، فضلا عن استبدال مجموعة وظيفية. على سبيل المثال، corroles الغاليوم المسلفنة شهدت امتصاص الخلوية عالية وتوغلت بشكل انتقائي في نواة الدماغ خلايا سرطان البروستاتا النقيلي (DU-145)؛ الخلايا نفسها corrole، على الرغم من أنها لا تخترق نواة من خطوط الخلايا الأخرى، يسلك أكبر سمية الخلايا لسرطان الثدي (MDA-MB-231)، سرطان الجلد (SK-MEL-28)، والمبيض (OVCAR-3) السرطان من ل سرطان البروستاتا. 9
المقايسات خلية القاعدة الأولية تشير إلى أن هذه المركبات تظهر الوعد كما المضادة للسرطان العوامل العلاجية، والتي تستحق فورثالتحقيق إيه في آلية العمل. ويلاحظ النسخ تثبيط مع بعض المجمعات الفلزية العضوية 17-27 وسعينا لدراسة هذه العملية كآلية محتملة لسلوك السامة للخلايا من عائلة corrole. يوفر هذا الاختبار النسخ طريقة واضحة وغير مكلفة، وسطحي لتقييم تثبيط النسخ، الأمر الذي سيؤدي إلى مزيد من المعلومات التفصيلية حول آثار هذه الجزيئات في الخلايا الحية.
هنا، وتثبيط النسخ من الغاليوم (III) 5،10،15- يتم اختبار (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس لها 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (الشكل 1). وخلافا لبعض المجمعات المعدن الانتقالية، الغاليوم (III) غير نشط الأكسدة ويست متورطة مباشرة في عملية الأكسدة من المسارات الأيضية القائم على الأكسدة وبالتالي 28 بغض النظر، الغاليوم (III) لا يحمل خصائص السامة للخلايا، وقد تم التحقيق لأغراض علاجية. الغاليوم هو ثاني أكثر المعادن واعد للعلاجات المضادة للسرطان بعد البلاتين وشهدت العديد من الدراسات والتحقيقات؛ وقد تم تقييم النترات والأملاح كلوريد الغاليوم في التجارب السريرية ضد الكبدي، سرطان الغدد الليمفاوية، سرطان المثانة، وأمراض أخرى. 29-34 الغاليوم (III) هو بالتالي مثالية للالمضادة للسرطان دراسات corrole. وتشير البيانات الأولية جورجيا (tpfc) وtpfc لديهم انخفاض GI 50، وتركيز الدواء الضروري لمنع 50٪ من تكاثر الخلايا القصوى، مع مختلف خطوط الخلايا السرطانية (انظر الشكل 2)؛ هذا يؤكد صحة مزيد من التجارب على هذين المركبين لتحديد خصائصها مثبطة. قارنا هذه المركبات مع الأدوية المضادة للسرطان شيوعا أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. أكتينوميسين D intercalates DNA، RNA يمنع استطالة، ويدفع الخلايا في خلية خط معين في تركيزات بيكو مولي أظهرت 6،35-37 تريبتوليد triptolide لمنع نمو الورم؛ فإنه يلزم لXPB البشرية / ERCC3، وس فرعيةعامل و النسخ TFIIH، مما يؤدي إلى تثبيط RNA البلمرة II النشاط. 6-7،38-40
بينما هو معلوم أن corroles يحمل خصائص السامة للخلايا، هناك القليل من المعلومات عن مختلف آليات الناشئة عن functionalization. أن تثبيط Corrole من الحمض النووي الريبي النسخ تقديم مزيد من التبصر في تفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. المجمعات الأخرى المعروفة لربط الحمض النووي، مثل dirhodium (II، II) المجمعات والكروم (III) المجمعات، الروثينيوم (II) المجمعات polypyridyl، الروديوم (III) المجمعات، وغيرها مختلف، تعرضوا لفحوصات الحمض النووي الريبي النسخ، 18- 27 مما أدى إلى فهم أكبر لتفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. هذه التجربة السهلة والمتاحة على نطاق واسع هي أيضا اختبار أولي جيد لتقييم خصائص سمية الخلايا من جزيء معين، وتحديد ما إذا كانت مزايا الاختبار مزيد البيولوجي. الفحص RNA النسخ يسمح أيضا للعديد من التعديلات، مثل varyinز كمية من مركب أو الإنزيمات المستخدمة؛ متفاوتة فترة الحضانة وفترة رد الفعل ونقاط الوقت عينة. ومتفاوتة DNA طول قالب وتسلسل، وبين المتغيرات الأخرى ذات الاهتمام، وبالتالي يحتمل توفير كمية كبيرة من البيانات. هذا الاختبار النسخ هو أيضا متاحة بسهولة إلى مجموعات بأسعار معقولة مع جميع المكونات رد فعل الضرورية المقدمة، على الرغم من أن مكونات يمكن شراء وأعد بشكل فردي. في هذه التجارب، ونحن نستخدم مجموعة المتاحة تجاريا المعروف أن ارتفاع العائد. 41
لتقييم النسخ تثبيط، ونحن نستخدم طريقتين: الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة بسيطة وفعالة لفصل وتحديد، وتنقية 0.5- إلى DNA و RNA شظايا 25 كيلو بايت. يمكن استخدام 42 UV-فيس التحليل الطيفي لتحديد التركيز والنقاء من الحمض النووي الريبي. 43
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: عند العمل مع RNA الحفاظ على بيئة عمل نظيفة لتجنب التلوث الدناز وريبونوكلياز الإنزيمات التي تحط من DNA و RNA. ضمان نصائح ماصة والأنابيب هي الدناز وريبونوكلياز الحرة. ومن المفيد أيضا لمسح أسفل الأسطح المختبر والمعدات مثل الماصات، وأصحاب أنبوب، وما إلى ذلك مع حل إزالة التلوث.
1. RNA النسخ مع العلاج Corrole
- إعداد corrole والمانع المركبات في 0.01: 1 نسبة ضرس [مجمع]: [DNA].
ملاحظة: في حالتنا، بلغت هذه النسبة 4.3 مجمع fmol: 0.43 DNA بمول، حيث كان القالب DNA تستخدم ناقلات APET-28C مع الاسباني الجينات من E. القولونية تحت سيطرة المروج T7. DNA الآخر مع المروج T7 أيضا المرشحين صالحة للتشغيل فحص النسخ.- حل أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، وجورجيا (tpfc) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في نظيفة، حاويات منفصلة. الحصول على التركيز النهائي من 0.01: 1 نسبة ضرس [جomplex]: [DNA] باستخدام التخفيفات المسلسل مع nuclease خالية من المياه.
- حل 1 ملغ أكتينوميسين D في 1.8 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1/100 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف.
ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من أكتينوميسين D هي 4.3 fmol. - حل 1 ملغ تريبتوليد triptolide في 0.64 مل DMSO. قسامة 1 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق الثاني 1 / 1،000 التخفيف.
ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من تريبتوليد triptolide هي 4.3 fmol. - حل 1 ملغ tpfc في 2.9 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع nuclease خالية من المياه لإنشاء 1/100 دilution. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف.
ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من tpfc هي 4.3 fmol. - حل 1 ملغ جورجيا (tpfc) في 2.6 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1/100 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف.
ملاحظة: تركيز المحلول النهائي من جورجيا (tpfc) هي 4.3 fmol.
ملاحظة: هذه corroles ومثبطات ليست قابلة للذوبان في الماء، ويجب أن يكون قبل حله في DMSO. كميات صغيرة من DMSO (أقل من 1٪) لا يستحث السمية الخلوية في الخلايا (بيانات غير منشورة).
- حل 1 ملغ أكتينوميسين D في 1.8 مل DMSO. قسامة 10 ميكرولتر إلى حاوية منفصلة وتضعف إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1/100 التخفيف. قسامة 1 ميكرولتر من التخفيف إلى حاوية منفصلة وتمييع إلى 1 مل مع الماء nuclease خالية لخلق 1 / 1،000 التخفيف.
- حل أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، وجورجيا (tpfc) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) في نظيفة، حاويات منفصلة. الحصول على التركيز النهائي من 0.01: 1 نسبة ضرس [جomplex]: [DNA] باستخدام التخفيفات المسلسل مع nuclease خالية من المياه.
- قبل البدء في رد فعل النسخ، وإعداد الكواشف اللازمة بشكل فردي أو شرائها من بائع التجاري.
- ذوبان الجليد على الجليد كل جمدتن الكواشف (الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على قائمة الكواشف المجمدة).
- السماح للتفاعل العازلة 10X وريبونوكليوتيد 4 (ATP، CTP، GTP، وUTP) حلول الوقت لخلط حتى يتم حلها تماما أنهم في الحل.
- أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عن الكواشف لمنع فقدان المواد على حافة الأنبوب. إذابة مرة واحدة، وتخزين ribonucleotides على الجليد مع الحفاظ على رد الفعل 10X العازلة في RT.
- الجمع بين الكواشف لرد فعل النسخ في RT (راجع الجدول 2 للحصول على قائمة الكواشف).
ملاحظة: سبيرمدين في 10X رد فعل العازلة يمكن coprecipitate الحمض النووي القالب إذا تم تجميعها رد فعل على الجليد وليس في RT. - مزيج دقيق من قبل عبها الأنبوب أو pipetting لالخليط بلطف صعودا وهبوطا. بعد الاختلاط، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع خليط التفاعل في الجزء السفلي من الأنبوب.
- احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ما مجموعه 2-4 ساعة.
ملاحظة: تختلف أوقات رد الفعل الضروريةمع حجم القالب الحمض النووي والتسلسل. قد تتطلب هذه الخطوة الأمثل لمتواليات محددة. قد تتطلب قوالب أقصر أوقات رد الفعل أطول لارتفاع العائد من إجمالي RNA. - إزالة 4 مكل من كل رد فعل بعد كل ساعة وتخزينها في -20 ° C. تعديل حسب الحاجة لtimepoints المطلوب.
2. RNA سبين العمود
- وبعد رد فعل النسخ، وتنقية RNA باستخدام الأعمدة اللوني ميكروسنتريفوج متوافق.
ملاحظة: استخدام الأعمدة RNA تدور لتنقية RNA مع أكبر من 20 قواعد النتائج في انتعاش أكبر من 80٪ 44
ملاحظة: اللوني العمود هو طريقة شائعة ومريحة لتنقية RNA. توجد أساليب تنقية أخرى أيضا مثل كلوريد الليثيوم هطول الأمطار، والفينول: استخراج الكلوروفورم، الأيزوبروبانول هطول الأمطار، فضلا عن غيرها من مجموعات المتاحة تجاريا.- بالتساوي resuspend ومصفوفة Sephadex في المخزن المؤقت عمود بواسطة قلب بقوةالعمود ثلاث مرات أو أكثر. القيام بذلك عن طريق عبها العمود بشكل حاد.
- إزالة الغطاء العلوي من العمود. سيكون هناك بعض مصفوفة Sephadex المتبقية في الحد الأقصى. إذا يتم تعبئة الغطاء مع المصفوفة، واستبدال الغطاء على العمود، وتكرار الخطوة السابقة حتى غالبية المصفوفة في العمود.
- المفاجئة قبالة الطرف السفلي من العمود.
ملاحظة: بعض السائل قد يفلت من العمود. - حزمة العمود.
- وضع عمود في العقيمة (ريبونوكلياز والدناز الحرة) أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في جهاز للطرد المركزي الطاولة في 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع العازلة مزال من العمود.
- وضع على الفور العمود في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge جديد وماصة العينة إلى مركز السرير العمود. استخدام 20-50 ميكرولتر من عينة لتجنب الحمولة الزائدة العمود.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في جهاز للطرد المركزي الطاولة في 1،000 x جلمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: إن شاطف هو عينة الحمض النووي الريبي المنقى.
3. الاغاروز جل الكهربائي (1٪ الاغاروز جل) 42
ملاحظة: بروميد إيثيديوم تتفلور على ملزم لDNA و RNA، لذلك هذه الجزيئات الحيوية يمكن تصور مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تفرخ لهم مع 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد الحل.
- يعد حل 1،000x الأسهم بروميد إيثيديوم (0.5 ملغ / مل) عن طريق إذابة 5 ملغ إيثيديوم بروميد في 10 مل من الماء.
- إعداد تريس خلات EDTA (تاي) عازلة لتشغيل الكهربائي للهلام. لجعل منطقة عازلة 50X TAE الجمع بين 2.0 M تريس، خلات مع 0.05 حمض M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) وضبط درجة الحموضة إلى 8.5.
- إعداد 1٪ (وزن / حجم) agarose هلام عن طريق إذابة 10 جم عالى النقاء الاغاروز في 1 L 1X TAE العازلة وذوبان الاغاروز مع فرن الميكروويف التقليدي. وبمجرد أن يبرد إلى 50 درجة مئوية، إضافة 1 مل من 1،000x إيثيديوم بروميد إلى 1٪ هلام الاغاروز المحاليلنشوئها، مزيج من قبل يحوم بلطف أو بواسطة قلب في حاوية مغلقة، ثم صب الحل الاغاروز إلى منصة الصب جل والسماح للهلام ليصلب في RT.
ملاحظة: بروميد إيثيديوم هو المغير ومسرطنة محتملة. ارتداء قفازات والتعامل مع الحلول بعناية. للحصول على إجراءات السليمة للتعامل معها من بروميد إيثيديوم، يرجى الاطلاع على: http://www.sciencelab.com/msds.php؟msdsId=9927667 . - بعد أن عزز الجل، ووضع هلام مجموعة في الخزان الكهربائي. إضافة المخزن ما يكفي من TAE لتغطية هلام حتى يتم المغمورة الآبار. تحقق من أن مستوى المخزن المؤقت تاي هو حوالي 1 مم فوق مستوى هلام. إزالة مشط هلام.
ملاحظة: إزالة المشط بعد المغمورة الآبار يمنع جيوب الهواء من الوقوع في الآبار. - تحضير عينات الحمض النووي الريبي. الجمع بين 1 ميكرولتر من كل عينة قسامة المنقى مع جل 1 ميكرولتر تحميل العازلة (أو مع 1 ميكرولتر 10X العازلة تحميل ومخففإد إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه) ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ممص مكروى.
يحتوي 10X العازلة تحميل 20٪ Ficoll 400، 0.1 M نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 1.0٪ SDS، 0.25٪ برموفينول الأزرق: ملاحظة. ويمكن أيضا أن يضاف 0.25٪ سيانول زايلين إلى المخزن المؤقت التحميل، كما أنها تدير ~ 50٪ بأسرع برموفينول الأزرق ويمكن أن تكون مفيدة لرصد المسافات الطويلة جدا (42). - تحميل الجل مع كل عينة من قبل pipetting بعناية الحل في الجزء السفلي من كل بئر. والحرص على عدم ترك أي فقاعات هواء أو مزيج بين عينات الآبار.
ملاحظة: يمكن أن تستخدم أيضا سلم RNA لتحديد حجم النص. - إرفاق يؤدي بحيث DNA سوف يهاجر إلى هلام نحو قيادة إيجابية. تعيين الجهد إلى المستوى المطلوب، وعادة 1 إلى 10 V / سم من هلام. تشغيل هلام لفترة طويلة ولكن غير كاف للانفصال كبير بين شظايا الحمض النووي الريبي، وذلك باستخدام الهجرة من الأصباغ لرصد التقدم المحرز في الانفصال.
NOTE: وهناك 23 سم × 25 سم هلام في 250 V تأخذ حوالي 1 ساعة، في حين أن 8 سم × 8 سم هلام في 150 V سيستغرق حوالي 20 دقيقة. شظايا الحمض النووي الريبي الصغيرة لديها أفضل قرار عند تشغيله في الفولتية أعلى. - إيقاف التيار الكهربائي عند الصبغة من العازلة تحميل وهاجر مسافة كافية ليحكم الفصل بين شظايا الحمض النووي الريبي.
- الصورة فإن RNA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مثل بروميد إيثيديوم يتألق.
- التقاط صورة من الصورة ومقارنة شدة مضان من الحمض النووي الريبي تنقيته من كل شرط.
4. RNA الكمي عن طريق الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي
- ضع 2 ميكرولتر H 2 O على معمل NanoDrop عام 2000، أو آلة مماثلة، وقياس فارغة.
- التالي، ضع 2 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي الريبي، وبعد التنقية، على معمل وقياس الأشعة فوق البنفسجية فيس من نطاق الطول الموجي من 200 نانومتر إلى 800 نانومتر.
ملاحظة: لقراءة 260 من 1.0 ما يعادل حوالي 40 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي،وRNA النقي لديه A 260 / A نسبة 280 2.1 (45). - في حالة أن الامتصاصية هو أعلى من 1 OD، يخفف من العينات في nuclease خالية من المياه للحصول على OD أقل من 1.
- استخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم العينات المختلفة ومقارنة OD في 260 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA النسخ نوعيا المقررة من قبل الاغاروز جل الكهربائي
ويستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام لصورة RNA كتب. إيثيديوم بروميد تتفلور على ملزمة (λ م = 605 نانومتر، λ = 210 نانومتر السابق، 285 نانومتر) 46 التصوير السماح من الحمض النووي الريبي. عصابات قتامة في هلام تتوافق مع تركيزات أعلى من الحمض النووي الريبي. إذا أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، أو إما مجمع corrole يمنع النسخ RNA، يتم تقليل إنتاج RNA وستظهر الفرقة أخف وزنا. باستخدام هذا المفهوم، يمكن تقييم تثبيط النسبي.
ويبين الشكل 3 بروميد إيثيديوم الملون agarose هلام (1٪) من ردود الفعل RNA النسخ تعامل مسبقا مع أي مجمع، أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، أو جا (tpfc) في [معقدة]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01 : 1. أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide تظهر انخفاضا واضحا من الحمض النووي الريبي مقارنة بما كان عليه من السيطرة، وكما هو متوقع منهذه المثبطات درس منذ فترة طويلة. لديه جورجيا (tpfc) الفرقة أيضا مستوى منخفض جدا من الحمض النووي الريبي، في حين أن الفرقة tpfc تظهر شيئا يذكر لولا تثبيط والمعارض نفس الكثافة النسبية باعتبارها السيطرة.
RNA النسخ كميا بواسطة الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي
وقد أخذت مقاييس أشعة فوق البنفسجية فيس لكل عينة بعد خضوعه لRNA النسخ لمدة 4 ساعة وتنقيته مع العمود RNA تدور اللوني. أطياف موجات ترد 220 نانومتر إلى 350 نانومتر في الشكل (4)، مع λ ماكس يحدث في 260 نانومتر، أي ما يعادل امتصاص RNA، ومعامل انقراض 0.025 (ميكروغرام / مل) -1 سم -1. يتم الإبلاغ عن الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر في الجدول 3. إن هناك 260 قراءة 1.0 ما يعادل حوالي 40 ميكروغرام / مل من RNA، RNA والنقي لديه A 260 / A نسبة 280 من 2.1، مما يتيح لإجراء العمليات الحسابية الكمية لل RNA تنتج أثناء العابرةرد فعل تسجيل الأسماء وإجراء تقييم للنقاء RNA بعد استخدام العمود RNA زيادة ونقصان. 44 ثلاثة من ردود الفعل النسخ الأربع المعالجة المانع أسفرت أقل RNA من السيطرة، مع الجا (tpfc) DNA المعالجة بالإثير الكتابة فقط 0.07 أضعاف RNA كما DNA غير المعالجة. أظهر DNA tpfc المعاملة لا تثبيط واضح. جميع العينات لديها نسبة A 260 / A 280 من حوالي 2.2، مما يشير إلى عينات نقية نسبيا. تنقية بواسطة الأعمدة تدور يزيل RNA RNA قصيرة جدائل 20 أو أقل النيوكليوتيدات طويلة. DNA المتبقي أو مسارات أطول من 20 النيوكليوتيدات قد تكون موجودة في ما يعتبر العينات النقية. ومن شأن هذه الشوائب طفيفة يؤدي إلى A 260 / A 280 نسبة أكبر قليلا من 2.1.
الشكل 1. الهياكل الجزيئية من الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (رPFC)) والتناظرية فريبيس 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. منحنيات السمسة وGI 50 قيم corroles في البروستاتا (DU-145) (الرمادي)، وسرطان الثدي (MDA-MB-231) (الأزرق)، والجلد (SK-MEL-28) (برتقالي)، والمبيض (OVCAR -3) (الأخضر) خطوط الخلايا السرطانية. وحضنت الخلايا مع (A) جورجيا (tpfc) و (B) tpfc، تليها تحديد الجدوى باستخدام MTS المستندة إلى اللونية بقاء الخلية الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالرقم.
الشكل 3. إيثيديوم بروميد هلام الاغاروز الملون (1٪) من التفاعلات النسخ بعد 4 ساعات من الحضانة. حارة 1 هو سلم DNA 1،000 بي بي كمعيار. الممرات 2-6 تظهر RNA كتب من 0.43 DNA بمول وتعامل مع 4.3 fmol كل المانع (أ [مجمع]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01): سيطرة (حارة 2)، أكتينوميسين D (حارة 3)، تريبتوليد triptolide (حارة 4)، tpfc (حارة 5)، وجورجيا (tpfc) (حارة 6).
عولج 200 التخفيف من الحمض النووي الريبي كتب في بعد 4 ساعات من الحضانة القالب الحمض النووي للتفاعل مع أي النسخ مجمع، أو مع أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، أو جا (tpfc) على العنوان التالي: الشكل 4. الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف من 1. و[مجمع]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01: 1. يتم قياس تركيز الحمض النووي الريبي التي كتبها OD في 260 نانومتر.
| ذوبان الجليد الكواشف المجمدة على الجليد: |
| 75 حلول ملم من أدينوسين ثلاثي الفوسفات، غوانوزين ثلاثي الفوسفات، سيتيدين ثلاثي الفوسفات، ويوريدين ثلاثي الفوسفات (ATP، CTP، GTP، UTP) |
| Nuclease خالية من المياه |
| 10X رد فعل العازلة (1X رد فعل المخزن المؤقت: 40 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 6 ملي MgCl 2، 2 مم سبيرمدين، 10 ملي dithiothreitol، ودرجة الحموضة 7.9) |
| DNA قالب خطي (0.5 ميكروغرام / مل، 1.85 كيلو بايت) |
| RNA البلمرة أنزيم (20 U / ميكرولتر) |
الجدول 1. قائمة الكواشف المجمدة.
| لبدء التفاعلات النسخ، إضافة الكميات التالية من كل كاشف في 0.2 مل أنابيب PCR رقيقة الجدران: |
| 2 ميكرولترATP حل (75 ملي) |
| 2 ميكرولتر حل CTP (75 ملي) |
| 2 ميكرولتر حل GTP (75 ملم) |
| 2 ميكرولتر حل UTP (75 ملي) |
| 1 ميكرولتر nuclease خالية من المياه |
| 2 ميكرولتر 10X رد فعل العازلة |
| 2 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض النووي قالب الخطي |
| 5 معقدة ميكرولتر (خالية من النواة المياه باعتبارها فارغة، أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، جورجيا (tpfc)) |
| 2 ميكرولتر RNA البلمرة (20 U / ميكرولتر) |
الجدول 2. قائمة الكاشف لرد فعل النسخ.
| مرة نقطة (ساعة) | مجمع | A 260 | A 280 </ قوي> | A 260 / A 280 | تخفيف عامل | [RNA]: A 260 (ميكروغرام / مل) | [RNA] (ملغ / مل) |
| 4 | سيطرة | 7،583 | 3.516 | 2.16 | 200 | 40 | 60.67 |
| 4 | أكتينوميسين D | 0.955 | 0،438 | 2.18 | 200 | 40 | 7،638 |
| 4 | تريبتوليد triptolide | 1.794 | 0.816 | 2.2 | 200 | 40 | 14.35 |
| 4 | tpfc | 7،858 | 3،631 | 2.16 | 200 | 40 | 62.87 |
| 4 | الجا (tpfc) | 0،554 | 0.232 | 2.39 | 200 | 40 | 4،434 |
الجدول 3. تركيز ونقاء RNA كتب بعد 4 ساعات قياس الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. معامل انقراض RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل هو 0.025 (ميكروغرام / مل) -1 سم -1، وهي قراءة 260 من 1.0 ما يعادل حوالي 40 ميكروغرام / مل من RNA، RNA والنقي لديه A 260 / A نسبة 280 2.1 (45).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح هذا الاختبار أن إضافة جورجيا (tpfc) يمنع النسخ RNA نسبيا إلى الحمض النووي ملزم المجمعات المضادة للسرطان المعروف أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. سلوك السامة للخلايا من جورجيا (tpfc) (GI 50 = 58،1 حتي 154،7 ميكرومتر) قد ونظرا لخواصها مثبطة. منذ لم يلاحظ أي تثبيط النسخ في tpfc، وسمية الخلايا من tpfc لا يرجع إلى RNA النسخ تثبيط لكن الناجمة عن وسائل أخرى لم تدرس بعد.
في ردود الفعل النسخ الأربعة القيام بها، كان يعالج DNA مع أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، tpfc، أو جا (tpfc)، في [مجمع]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01، على التوالي، أو عنصر تحكم غير المعالجة. تم الجمع بين الكواشف رد فعل النسخ وسمح للرد فعل النسخ والمضي قدما لمدة 4 ساعة عند 37 ° C. تم تنقية RNA كتب من خلال عمود RNA تدور والعائد تحليلها من قبل UV-فيس والكهربائي للهلام. طبيعة النسخ تثبيط يمكن furtلها التحقيق في استخدام هذا الأسلوب نفسه مع تعديلات مختلفة، أو مركبات يمكن أن تخضع لبديل في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. وتشمل التجارب الإضافية التي قد تساعد على تحديد طبيعة الجزيئية للتثبيط البلورات بالأشعة السينية من adducts-DNA corrole الممكنة أو النمذجة الحاسوبية من رد فعل النسخ. وكان الهدف من هذه التجربة لتحديد ما إذا كانت مركبات تمنع النسخ من أجل جمع المعلومات عن الخصائص المضادة للسرطان المحتملة. وقد تحقق هذا الهدف: tpfc عرضت أي تثبيط، في حين جا (tpfc) عرضت تثبيط واضح ويستحق المزيد من الدراسة.
يمكن تعديل مقايسة RNA النسخ لتقديم المزيد من التفاصيل الآلية. بالإضافة إلى ذلك من وكلاء المضادة للسرطان (مثل المجمعات corrole) بعد رد الفعل النسخ كاملة يمكن أن تظهر ما إذا كانت المجمعات تتحلل أو يتحلل الحمض النووي الريبي. تجربة أخرى الموصى بها هي لإجراءرد فعل النسخ مع جميع المكونات باستثناء من RNA بوليميريز انزيم 10 أضعاف أقل للسماح للتمايز بين آلية تثبيط تنطوي على DNA أو الانزيم. وأخيرا، حضانة DNA أو البلمرة مع المجمعات السابقة إلى RNA النسخ من شأنها أن تسمح لزيادة الربط بين المجمع والهدف منها، التأكد مما إذا كان وتشارك الصفات مثبطة المعقدة في DNA أو البلمرة ملزمة، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نحن نتقدم بخالص الشكر الدكتور سيندي N. تشيو للمساعدة في هلام الكهربائي، واندي تشو ومايكل Grodick للتبرع السخي من الحمض النووي وانزيم قيود. ونحن نعترف بامتنان أستاذ J. هيث وأستاذ D. بروبير للوصول السخي على المعدات والمواد. نشكر الدكتور كارن Sorasaenee للحصول على اقتراحات مفيدة. نشكر ماري H. تانغ لخلق التوضيح المستخدمة في العرض التخطيطي في شريط الفيديو. تم توفير التمويل من قبل جونسون آند جونسون وUSC Y86786.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
References
- American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
- RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
- Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).
