Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Une Published: March 18, 2015 doi: 10.3791/52355
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Molecular Medicine, Beckman Research Institute of the City of Hope

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole et son analogue freebase présentent une faible cytotoxicité cellulaire micromolaire. Ce manuscrit décrit une réaction de transcription d'ARN, l'ARN de formation d'image avec un gel coloré au bromure d'éthidium et l'ARN quantifier avec spectroscopie UV-Vis, afin d'évaluer l'inhibition de la transcription par corroles et illustre une méthode simple d'évaluation des propriétés anticancéreuses candidates.

Abstract

La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques avec de nombreux effets secondaires et ciblage limité. Corroles sont une classe de macrocycles tétrapyrroliques qui présentent des propriétés cytostatiques et cytotoxiques différentielles dans des lignées cellulaires spécifiques, en fonction de l'identité du métal chélaté et des groupes fonctionnels. Le comportement unique de corroles fonctionnalisés envers des lignées cellulaires spécifiques introduit la possibilité d'une chimiothérapie ciblée.

De nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d'ARN. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la transcription d'ARN en présence d'inhibiteurs connus et potentiels. L'évaluation des produits d'ARN de la réaction de transcription par électrophorèse sur gel et spectroscopie UV-Vis fournit des informations sur les propriétés inhibitrices de candidats potentiels de médicaments anticancéreux et, avec les adaptations à l'essai, et plus de leur mécanisme d'action.

Peuest connu sur le mécanisme d'action moléculaire de la cytotoxicité corrole. Dans cette expérience, nous considérons deux composés corrole: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et analogique freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un essai de transcription d'ARN a été utilisé pour examiner les propriétés inhibitrices des corroles. Cinq réactions de transcription ont été préparés: ADN traité avec l'actinomycine D, triptolide, Ga (tpfc), à une tpfc [complexe]: [base de matrice d'ADN] rapport de 0,01, respectivement, et un témoin non traité.

Les réactions de transcription ont été analysés après 4 heures en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose et spectroscopie UV-Vis. Il est clair par inhibition Ga (tpfc), actinomycine D et triptolide.

Ce dosage de transcription d'ARN peut être modifié pour fournir des détails plus mécaniste en faisant varier les concentrations du complexe anticancéreux, ADN, polymérase ou une enzyme, ou par incubation de l'ADN polymerase ou à l'achèvementxes avant transcription de l'ARN; ces modifications seraient différence entre un mécanisme d'inhibition impliquant l'ADN ou l'enzyme. L'ajout du complexe ARN après transcription peut être utilisé pour tester si les complexes se dégradent ou se hydrolyser l'ARN. Ce dosage peut également être utilisé pour étudier les candidats anticancéreux supplémentaires.

Introduction

La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques à des effets secondaires indésirables et ciblage limitée, mais avec une plus grande compréhension de la biologie du cancer, il ya une demande croissante pour les agents anticancéreux avec plus d'efficacité sur le cancer-ciblage et moins d'effets secondaires. 1 cellules cancéreuses humaines deviennent souvent 2 Ainsi dépendant d'un seul oncogène activé ou surexprimé à la survie., de nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d'ARN. Les traitements qui bloquent l'expression de ces gènes transformants sont efficaces dans l'élimination des cellules cancéreuses et conduisent à la mort cellulaire. 3 Les cellules transformées sont plus sensibles aux perturbations de la transcription d'ARN que celles des cellules normales correspondantes. 4 Les médicaments anticancéreux qui inhibent la transcription devraient inhiber sélectivement le expression des oncogènes qui sont nécessaires à la cellule de cancer de survivre. 5 Par conséquent, la transcription d'ARN inhibition est un moyen utile pour identifier les candidats potentiels de médicaments anticancéreux et en apprendre davantage sur leur mécanisme d'action. Ce protocole démontre que Ga (tpfc) inhibe la transcription de l'ARN sur le même ordre que les médicaments de chimiothérapie actinomycine D et triptolide; comparaisons semblables peuvent être faites en utilisant ce protocole avec d'autres candidats de médicaments anticancéreux. L'actinomycine D est un inhibiteur de la transcription d'ARN utilisée pour traiter le cancer trophoblastique gestationnel, le cancer des testicules, la tumeur de Wilm, rhabdomyosacoma, et le sarcome d'Ewing 6. Actinomycine D a été utilisé dans le traitement du cancer depuis près de 50 années depuis qu'il a été approuvé par la FDA en 1964.Triptolide est un inhibiteur sélectif de la transcription qui a été étudiée in vitro et dans divers modèles animaux portant la tumeur pour 30 ans. 7

La nature macrocyclique amphiphile de corroles confère des avantages significatifs par rapport aux autres classes de médicaments tels que les petites molécules ou biologiques. 14.8 Le caractère macrocyclique permet de perméabilité cellulaire qui est plus grande que prévu pour ces grosses molécules, et ils sont assez grands pour interagir avec des surfaces macromoléculaires, telles que celles des protéines. 8 corroles sont connus pour former des complexes non covalents serrés avec des biomolécules et les médicaments. 10 En plus de la cytotoxicité inhérente du cadre corrole, nous avons démontré qu'une sulfonés corrole agit en tant que molécule porteuse pour les agents chimiothérapeutiques, en particulier l'anthracycline doxorubicine médicament d'intercalation d'ADN. Lorsque le corrole sulfoné a été administré en association avec la doxorubicine, une amélioration de 3 fois dans le IC 50 de la doxorubicine a été observée pour cellules DU-145. 9 Le cadre corrole est stable et a absorbance et de fluorescence propriétés inhérentes que, lorsque fonctionnalisé, subissent des changements d'absorbance uniques qui peut être utilisé pour la caractérisation. 10 La fonctionnalisation de l'échafaudage ne ​​est pas intrinsèquement affect les propriétés photophysiques du corrole, 9-15, mais, comme on le voit avec une corrole sulfoné, modifier sélectivement le cadre de la corrole peuvent modifier considérablement ses propriétés biologiques. 16 Nous avons déjà évalué six métallocorroles contre sept lignées de cellules cancéreuses humaines. Les résultats indiquent que la toxicité envers les cellules cancéreuses humaines dépend de l'ion métallique spécifique, ainsi que la substitution du groupe fonctionnel. Par exemple, les corroles de gallium sulfonés connu absorption cellulaire élevée et pénètrent sélectivement dans le noyau des cellules du cancer de la prostate métastatique du cerveau (DU-145); les cellules de la même corrole, bien qu'elle ne pénètre pas dans le noyau d'autres lignées cellulaires, présente une plus grande cytotoxicité du cancer du sein (MDA-MB-231), le mélanome (SK-MEL-28), et de l'ovaire (OVCAR-3) cancer que pour cancer de la prostate. 9

Dosages à base de cellules initiales indiquent que ces composés prometteurs en tant qu'agents thérapeutiques anti-cancéreuses, ce qui mérite Furthenquête er dans le mécanisme d'action. inhibition de la transcription est observée avec certains complexes organométalliques 17-27 et nous a demandé d'examiner ce processus comme un mécanisme possible pour le comportement cytotoxique de la famille corrole. Ce dosage de transcription fournit une méthode simple, peu coûteux et facile pour évaluer l'inhibition de la transcription, ce qui conduira à des informations plus détaillées sur les effets de ces molécules dans les cellules vivantes.

Ici, l'inhibition de la transcription de gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et son analogue de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figure 1) sont testés. Contrairement à certains complexes de métaux de transition, le gallium (III) est redox inactive et donc ne est pas directement impliqué dans le processus d'oxydo-réduction de voies métaboliques en fonction redox. 28 Indépendamment, le gallium (III) ne présentent des propriétés cytotoxiques et a été étudié à des fins thérapeutiques. Gallium est le deuxième métal le plus prometteur pour les traitements anticancéreux après platine et a subi de nombreuses études et enquêtes; des sels à base de nitrate et de chlorure de gallium ont été évaluées dans des essais cliniques contre l'hépatome, le lymphome, les cancers de la vessie, et d'autres maladies. 29-34 Gallium (III) est donc idéal pour les études corrole anticancéreux. Les données initiales montrent Ga (tpfc) et tpfc avoir une faible IG 50, la concentration de médicament nécessaire pour inhiber 50% de la prolifération cellulaire maximale, avec diverses lignées de cellules cancéreuses (voir la figure 2); Cela confirme la validité des autres expériences sur ces deux composés pour déterminer leurs propriétés inhibitrices. Nous comparons ces composés avec les médicaments anticancéreux commune actinomycine D et triptolide. L'actinomycine D intercale ADN, ARN inhibe l'allongement, et induit une apoptose dans certaines lignées cellulaires à des concentrations picomolaires 6,35-37 Triptolide a montré à inhiber la croissance tumorale. il se lie à XPB / ERCC3 humain, une sous-unité of facteur de transcription TFIIH, conduisant à l'inhibition de l'ARN polymérase II activité. 6-7,38-40

Se il est bien connu que corroles présentent des propriétés cytotoxiques, il existe peu d'informations sur les différents mécanismes découlant de fonctionnalisation. Inhibition corrole de transcription de l'ARN offrirait une meilleure idée de leurs interactions avec les macromolécules biologiques. D'autres complexes connus pour se lier à l'ADN, tels que dirhodium (II, II), le chrome (III), le ruthénium (II) polypyridyl, le rhodium (III), et divers autres, ont été soumis à des essais de transcription d'ARN, 18- 27 entraîne une plus grande compréhension de leurs interactions avec biomacromolécules. Cette expérience facile et largement disponible est aussi un bon test initial pour évaluer les propriétés de cytotoxicité d'une molécule donnée et de déterminer se il mérite d'autres essais biologiques. Le dosage de transcription d'ARN permet également de nombreuses modifications, telles que varying la quantité de composé ou les enzymes utilisées; faire varier la période d'incubation, le temps de réaction et des instants échantillons; et faire varier la longueur de la matrice d'ADN et de la séquence, entre autres variables d'intérêt, ainsi potentiellement fournir une grande quantité de données. Ce dosage de transcription est également disponibles sous forme de kits abordables avec tous les composants de réaction nécessaires fournis, bien que les composants peuvent être achetés et préparés individuellement. Dans ces expériences, nous utilisons un kit disponible dans le commerce connu pour avoir un rendement élevé 41.

Pour évaluer l'inhibition de la transcription, nous utilisons deux méthodes: électrophorèse sur gel d'agarose et de spectroscopie UV-Vis. Électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode simple et efficace pour la séparation, l'identification, la purification et 0,5 à des fragments d'ADN et d'ARN de 25 kb. 42 spectroscopie UV-Vis peut être utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l'ARN. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec l'ARN de maintenir un environnement de travail propre pour éviter la contamination par DNase et RNase enzymes qui dégradent l'ADN et de l'ARN. Veiller à ce que des conseils et des tubes pipettes sont DNase et RNase. Il est également utile pour essuyer les surfaces de laboratoire et des équipements tels que des pipettes, des supports de tubes, etc., avec une solution de décontamination.

1. Traitement avec l'ARN de transcription corrole

  1. Préparer le corrole composés inhibiteurs et 0,01 dans un ratio molaire de 1 [complexe]: [ADN].
    NOTE: Dans notre cas, le ratio était de 4,3 fmol complexe: 0,43 pmol ADN, où la matrice d'ADN utilisé était vecteur APET-28c avec le gène de la Liga E. coli sous le contrôle du promoteur T7. Autres ADN avec le promoteur T7 sont également des candidats valables pour l'exécution de l'essai de transcription.
    1. Dissoudre actinomycine D, triptolide, tpfc, et Ga (tpfc) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), dans des récipients propres distincts. Obtenir la concentration finale de 0,01 un ratio molaire de 1 [complex]: [ADN] en utilisant des dilutions en série avec de l'eau sans nucléase.
      1. Dissoudre 1 mg actinomycine D dans 1,8 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/100. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000.
        REMARQUE: La concentration de la solution finale de l'actinomycine D est de 4,3 fmol.
      2. Dissoudre 1 mg triptolide dans 0,64 ml de DMSO. Aliquote de 1 ul à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une seconde 1/1000 dilution.
        REMARQUE: La concentration de la solution finale est de 4,3 fmol triptolide.
      3. Dissoudre 1 mg tpfc dans 2,9 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase pour créer un 1/100 dilution. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000.
        REMARQUE: La concentration de la solution finale est de 4,3 fmol tpfc.
      4. Dissoudre 1 mg Ga (tpfc) dans 2,6 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/100. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l'eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000.
        REMARQUE: La concentration de la solution finale de Ga (tpfc) est de 4,3 fmol.
        NOTE: Ces corroles et les inhibiteurs ne sont pas solubles dans l'eau et doivent être pré-dissous dans du DMSO. De petites quantités de DMSO (moins de 1%) ne induisent pas de cytotoxicité dans les cellules (données non publiées).
  2. Avant de commencer la réaction de transcription, préparer les réactifs nécessaires individuellement ou les acheter à partir d'un fournisseur commercial.
    1. Thaw sur la glace tout gelén réactifs (voir le tableau 1 pour une liste de réactifs congelés).
    2. Laisser le tampon de réaction 10x et 4 ribonucléotide (ATP, CTP, GTP et UTP) temps de solutions de mélanger jusqu'à ce qu'ils soient complètement dissous dans la solution.
    3. Centrifuger brièvement tous les réactifs pour éviter la perte de matière sur le bord du tube. Une fois décongelé, ribonucléotides de magasins sur la glace tout en gardant le 10X Reaction Buffer à température ambiante.
    4. Combiner les réactifs pour la réaction de transcription à la température ambiante (voir le tableau 2 pour une liste de réactifs).
      REMARQUE: La spermidine 10x dans le tampon de réaction peut coprécipiter l'ADN de matrice si la réaction est assemblé sur de la glace et non à la température ambiante.
    5. Mélanger soigneusement en tapotant le tube ou le mélange pipetage et doucement. Après mélange, on centrifuge brièvement pour collecter le mélange de réaction à la partie inférieure du tube.
    6. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant un total de 2 à 4 heures.
      NOTE: Les temps de réaction nécessaires varierontavec la taille et la séquence de matrice d'ADN. Cette étape peut nécessiter une optimisation pour des séquences spécifiques. Des modèles plus courts peuvent nécessiter de plus longues durées de réaction pour un rendement élevé de l'ARN total.
    7. Retirez quatre aliquotes de chaque réaction après chaque heure et conserver à -20 ° C. Modifier comme nécessaire pour timepoints souhaités.

2. ARN Spin Colonne

  1. Après la réaction de transcription, de purifier l'ARN en utilisant des colonnes de Chromatographie microcentrifugation-compatible.
    Remarque:. Utilisation d'ARN colonnes de spin pour purifier l'ARN avec plus de 20 bases des résultats dans plus de 80% de récupération 44
    REMARQUE: La Chromatographie sur colonne est une méthode courante et pratique pour purifier l'ARN. D'autres procédés de purification existent aussi comme chlorure de lithium précipitation, extraction au phénol: chloroforme, précipitation à l'isopropanol, ainsi que d'autres kits disponibles dans le commerce.
    1. Remettre en suspension uniformément dans la matrice Sephadex le tampon de colonne en inversant la vigoureusementcolonne trois fois ou plus. Pour ce faire, en feuilletant la colonne fortement.
    2. Retirez le couvercle supérieur de la colonne. Il y aura une certaine matrice Sephadex résiduelle dans le bouchon; si la capsule est remplie avec la matrice, replacer le capuchon sur la colonne et répéter l'étape précédente jusqu'à ce que la majorité de la matrice est dans la colonne.
    3. Casser la pointe en bas de la colonne.
      NOTE: Certaines liquide peut se échapper de la colonne.
    4. Remplir la colonne.
      1. Placez colonne dans une stérile (sans RNase ni DNase) Tube de 1,5 ml.
      2. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de paillasse à 1000 g pendant 1 min.
    5. Jeter le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec du tampon élue de la colonne.
    6. Placer immédiatement la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml de microcentrifugation stérile et pipeter l'échantillon au centre du lit de la colonne. Utilisez 20-50 ul de l'échantillon pour éviter de surcharger la colonne.
    7. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de table à 1000 xgpendant 1 min.
      NOTE: L'éluant est l'échantillon d'ARN purifié.

3. Agarose électrophorèse sur gel (1% Agarose Gel) 42

NOTE: Le bromure d'éthidium est fluorescent lors de la liaison à l'ADN et l'ARN, par conséquent, ces biomolécules peuvent être visualisées avec une lumière UV en les incubant avec 0,5 pg / ml de solution de bromure d'éthidium.

  1. Préparer une solution 1,000x boursier de bromure d'éthidium (0,5 mg / ml) en dissolvant 5 mg de bromure d'éthidium dans 10 ml d'eau.
  2. Préparer Tris acétate EDTA (TAE) tampon de course pour électrophorèse sur gel. Pour faire un tampon 50x TAE combiner 2,0 M Tris-acétate avec 0,05 M d'acide éthylène diamine (EDTA) et ajuster le pH à 8,5.
  3. Préparation d'un gel d'agarose à 1% (poids / volume) en dissolvant 10 g d'agarose dans UltraPure 1 L de tampon TAE 1X et faire fondre l'agarose avec un four à micro-ondes conventionnel. Une fois refroidi à 50 ° C, ajouter 1 ml de bromure d'éthidium à 1,000x le gel d'agarose à 1% solution, mélanger en remuant doucement en inversant ou dans un récipient fermé, puis verser la solution d'agarose dans une plate-forme de gel sous pression et permettre au gel de se solidifier à température ambiante.
    NOTE: Le bromure d'éthidium est un mutagène et cancérogène potentiel. Porter des gants et manipuler solutions attentivement. Pour les procédures de manipulation appropriées de bromure d'éthidium, se il vous plaît voir: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Après que le gel est solidifié, placer le gel de consigne dans la cuve d'électrophorèse. Ajouter tampon TAE assez pour couvrir le gel jusqu'à ce que les puits sont submergés. Vérifiez que le niveau du tampon TAE est d'environ 1 mm au-dessus du niveau du gel. Retirer le peigne de gel.
    REMARQUE: Retrait du peigne après puits sont submergés empêche poches d'air d'être piégé dans les puits.
  5. Préparer les échantillons d'ARN. Combiné 1 pl de chaque échantillon aliquote purifiée avec 1 ul Gel Loading Buffer (ou avec 1 ul 10x tampon de chargement et DILUTed à 10 pi avec de l'eau sans nucléase) et bien mélanger par pipetage de haut en bas avec une micropipette.
    REMARQUE: tampon de charge de 10x contient 20% de Ficoll 400, 0,1 M de Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% de SDS, 0,25% de bleu de bromophénol. 0,25% de xylene cyanol peut également être ajouté au tampon de charge, il fonctionne comme ~ 50% plus vite que le bleu de bromophénol et peut être utile pour contrôler très longues distances. 42
  6. Charger le gel avec chaque échantillon à la pipette soigneusement la solution dans le fond de chaque puits. Prenez soin de ne pas laisser les bulles d'air ou de mélanger les échantillons entre les puits.
    REMARQUE: Une échelle d'ARN peut également être utilisé pour déterminer la taille de la transcription.
  7. Fixez les câbles de sorte que l'ADN va migrer dans le gel vers le fil positif. Régler la tension au niveau désiré, généralement de 1 à 10 V / cm de gel. Démarrer le gel pour le temps est suffisant pour la séparation significative entre les fragments d'ARN, en utilisant la migration des colorants pour surveiller la progression de la séparation.
    NOTE: A 23 cm x 25 cm de gel à 250 V prendra environ 1 heure, tandis que 8 cm x 8 cm de gel à 150 V aura environ 20 min. Fragments d'ARN de petite taille ont une meilleure résolution lorsqu'il est exécuté à des tensions plus élevées.
  8. Coupez l'alimentation électrique lorsque le colorant de la mémoire tampon de chargement a migré une distance jugée suffisante pour la séparation entre les fragments d'ARN.
  9. Image de l'ARN sous lumière UV que le bromure d'éthidium sera fluorescence.
  10. Prenez une photo de l'image et comparer les intensités de fluorescence de l'ARN purifié à partir de chaque condition.

4. ARN Quantification par spectroscopie UV-Vis

  1. Placez 2 pl H 2 O sur une NanoDrop 2000, ou une machine similaire, et de mesurer le vide.
  2. Ensuite, placer 2 ul de chaque échantillon d'ARN, après purification, sur le spectrophotomètre et de mesurer UV-Vis à partir d'une gamme de longueurs d'onde de 200 nm à 800 nm.
    REMARQUE: Une lecture de 260 A 1,0 est équivalente à environ 40 ug / ml d'ARN,et l'ARN pur a un A 260 / A 280 rapport de 2,1 45.
  3. Dans le cas ci-dessus est que l'absorbance DO 1, diluer les échantillons dans de l'eau sans nuclease à obtenir une DO inférieure à 1.
  4. Utilisez un logiciel graphique pour tracer les différents échantillons et comparez DO à 260 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Qualitativement transcription ARN évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose

Une électrophorèse sur gel d'agarose est utilisé pour l'image de l'ARN transcrit. Bromure d'éthidium fluoresce lors de la liaison (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 permettant l'imagerie de l'ARN. Bandes sombres dans le gel correspondent à des concentrations plus élevées d'ARN. Si actinomycine D, triptolide, ou soit complexe corrole inhibe la transcription d'ARN, la production d'ARN est réduite et la bande apparaît plus léger. En utilisant ce concept, l'inhibition relative peut être évaluée.

La figure 3 montre le gel au bromure d'éthidium d'agarose (1%) des réactions de transcription d'ARN pré-traitées avec aucun complexe, l'actinomycine D, triptolide, tpfc ou Ga (tpfc) à une [complexe]: rapport [base de matrice d'ADN] de 0,01 : 1. Actinomycine D et triptolide montrent une nette diminution de l'ARN par rapport à celle du témoin, comme prévu deces inhibiteurs long étudiés. Le Ga (tpfc) bande a également un niveau d'ARN très faible, tandis que la bande de tpfc montre peu ou pas de l'inhibition et présente la même intensité relative que le contrôle.

ARN transcription quantifiée par spectroscopie UV-Vis

mesures UV-Vis ont été prises pour chaque échantillon après avoir subi une transcription de l'ARN pendant 4 heures et on les purifie par Chromatographie sur une colonne de spin ARN. Les spectres de longueurs d'onde de 220 ​​nm à 350 nm sont présentées dans la figure 4, avec le λ max se produit à 260 nm, correspondant à l'absorption de l'ARN, et un coefficient d'extinction de 0,025 (pg / ml) -1 cm -1. L'absorbance à 260 nm et 280 nm sont rapportés dans le tableau 3. A 260 Une lecture de 1,0 est équivalente à environ 40 ug / ml d'ARN, et l'ARN pur présente une A 260 / A 280 rapport de 2,1, ce qui permet de calculs quantitatifs ARN produite lors de la transréaction d'cription et une évaluation de la pureté de l'ARN après l'utilisation de la colonne de l'ARN par centrifugation. 44 Trois des quatre réactions de transcription inhibiteurs traités ont produit moins d'ARN que le témoin, avec Ga (tpfc) d'ADN traité à la transcription seulement 0,07 fois plus d'ARN que l'ADN non traité. tpfc ADN traité n'a montré aucune inhibition apparente. Tous les échantillons ont un rapport A 260 / A 280 d'environ 2,2, ce qui indique des échantillons relativement purs. Purification par des colonnes de spin d'ARN supprime ARN court brins ou moins 20 nucléotides de long. ADN ou brins de plus de 20 nucléotides résiduelle peuvent être présents dans ce qui est considéré les échantillons purifiés. Ces impuretés légères se traduirait par une / un rapport légèrement supérieur à 2,1 A 260 280.

Figure 1
Figure 1. structures moléculaires de Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) et l'analogue freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. courbes de cytotoxicité et GI 50 valeurs de corroles dans la prostate (DU-145) (gris), du sein (MDA-MB-231) (bleu), la peau (SK-MEL-28) (orange), et de l'ovaire (OVCAR -3) (vert) lignées cellulaires de cancer. Les cellules ont été incubées avec (A) Ga (tpfc) et (B) tpfc, suivie par détermination de la viabilité en utilisant le MTS à base colorimétrique dosage de la viabilité des cellules selon le protocole du fabricant. Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

Figure 3
Figure 3. Le bromure d'éthidium du gel d'agarose coloré (1%) des réactions de transcription après 4 h d'incubation. La piste 1 est une échelle d'ADN de 1000 pb comme étalon. Les pistes 2-6 montrent l'ARN transcrit à partir de 0,43 ADN pmol et traité avec 4,3 fmol de chaque inhibiteur (a [complexe]: [base de matrice d'ADN] rapport de 0,01): la commande (piste 2), actinomycine D (piste 3), triptolide (piste 4), tpfc (piste 5), et Ga (tpfc) (piste 6).

Figure 4
Figure 4. UV-Vis spectre de 1:. 200 dilution de l'ARN transcrit à après 4 h d'incubation, la matrice d'ADN pour la réaction de transcription a été traité avec aucun complexe, ou à l'actinomycine D, triptolide, tpfc ou Ga (tpfc) à un complexe []: [base d'ADN du modèle] de rapport de 0,01: 1. La concentration de l'ARN est mesurée par OD à 260 nm.

Décongeler réactifs congelés sur de la glace:
Solutions de l'adénosine triphosphate, la guanosine triphosphate, cytidine triphosphate, et de l'uridine triphosphate 75 mM (ATP, CTP, GTP, UTP)
Eau sans nucléase
Reaction Buffer 10x (1x Reaction Buffer: 40 mM Tris-HCl, 6 mM de MgCl2, 2 mM de spermidine, 10 mM de dithiothréitol, pH 7,9)
ADN matrice linéarisé (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
Enzyme ARN polymérase (20 U / ul)

Tableau 1. Liste des réactifs congelés.

Pour commencer les réactions de transcription, ajouter le montant suivant de chaque réactif dans 0,2 ml tubes de PCR à paroi mince:
2 ulSolution ATP (75 mM)
Solution CTP 2 ul (75 mM)
Solution de GTP 2 ul (75 mM)
Solution UTP 2 ul (75 mM)
Une eau exempte de nucléase-ul
2 ul 10x Reaction Buffer
2 ul de matrice d'ADN linéaire de 0,5 pg / pl
5 (eau libre de noyau, comme le blanc, l'actinomycine D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc)) ul complexe
2 ul ARN polymérase (20 U / pl)

Tableau 2. Liste des réactifs pour la réaction de transcription.

Temps Point (hr) Complexe A 260 A 280 </ Strong> A 260 / A 280 Facteur de dilution [RNA]: A 260
(Ug / ml) 		[RNA] (mg / ml)
4 Contrôle 7.583 3,516 2,16 200 40 60,67
4 L'actinomycine D 0,955 0,438 2,18 200 40 7,638
4 triptolide 1,794 0,816 2.2 200 40 14,35
4 tpfc 7,858 3,631 2,16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2,39 200 40 4,434

Tableau 3. Concentration et la pureté de l'ARN transcrit après 4 heures mesurée par spectroscopie UV-Vis. Le coefficient d'extinction de l'ARN simple brin est de 0,025 (pg / ml) -1 cm -1, une lecture A260 de 1,0 est équivalente à environ 40 ug / ml d'ARN, et l'ARN pur a un A 260 / A 280 rapport de 2,1 45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cet essai démontre que l'ajout de Ga (tpfc) inhibe la transcription de l'ARN comparable aux complexes anticancéreux de liaison à l'ADN connus actinomycine D et triptolide. Le comportement cytotoxique de Ga (tpfc) (IG = 50 58,1 à 154,7 M) peut en raison de ses propriétés inhibitrices. Étant donné qu'aucune transcription inhibition a été observée dans tpfc, la cytotoxicité de tpfc est pas due à la transcription d'ARN d'inhibition mais est causée par d'autres moyens non encore étudiées.

Dans les quatre réactions de transcription réalisées, l'ADN a été traité avec de l'actinomycine D, triptolide, tpfc ou Ga (tpfc), à une [complexe]: [base de matrice d'ADN] rapport de 0,01, respectivement, ou un témoin non traité. Les réactifs de la réaction de transcription ont été combinés et la réaction de transcription a été laissée se dérouler pendant 4 heures à 37 ° C. L'ARN transcrit est purifié à travers une colonne de l'ARN par centrifugation et le rendement analysé par électrophorèse sur gel et UV-Vis. La nature de l'inhibition de la transcription peut être Furtsa étudiée en utilisant la même technique avec diverses modifications, ou des composés peut être soumis à l'alternative in vitro et in vivo. Des expériences supplémentaires qui peuvent aider à déterminer la nature moléculaire de l'inhibition comprennent cristallographie aux rayons X d'adduits corrole-ADN possibles ou la modélisation informatique de la réaction de transcription. L'objectif de cette expérience était de déterminer si les composés inhibent la transcription afin de collecter des informations sur leurs propriétés anti-cancéreux potentiels. Cet objectif a été atteint: tpfc présentait aucune inhibition, tandis que Ga (tpfc) présentaient une inhibition claire et mérite une étude plus approfondie.

Le dosage de transcription d'ARN peut être modifié pour fournir des détails plus mécanistique. Outre des agents anticancéreux (par exemple, les complexes corrole) après la réaction de transcription est complète peut montrer si les complexes dégradent ou hydrolysent l'ARN. Une autre expérience est recommandé de procéder àla réaction de transcription avec tous les composants à l'exception de l'enzyme ARN polymerase 10 fois plus faible pour permettre une différenciation entre un mécanisme impliquant l'inhibition de l'ADN ou de l'enzyme. Enfin, l'incubation de l'ADN ou la polymérase avec les complexes avant de la transcription d'ARN qui permettrait d'accroître la liaison entre le complexe et la cible respective, déterminer si les qualités inhibitrices complexes sont impliqués dans la liaison de l'ADN ou, respectivement polymerase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Nous remercions sincèrement le Dr N. Cindy Chiu de l'aide pour électrophorèse sur gel, et Andy Zhou et Michael Grodick pour leur généreux don de l'ADN et l'enzyme de restriction. Nous tenons à remercier le professeur J. Heath et le Professeur D. Prober pour un accès généreux à l'équipement et des matériaux. Nous remercions le Dr Karn Sorasaenee suggestions utiles. Nous remercions Mary H. Tang pour créer l'illustration utilisée dans l'aperçu schématique dans la vidéo. Le financement a été fourni par Johnson & Johnson et USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O  Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Tags

Bioengineering Numéro 97 corrole ARN la transcription l'inhibition anti-cancer l'ADN la reliure l'actinomycine D triptolide
Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, G. Y., Pribisko, M. A.,… More

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter