Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Een Published: March 18, 2015 doi: 10.3791/52355
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Molecular Medicine, Beckman Research Institute of the City of Hope

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole en haar freebase analoge vertonen een lage micromolaire cel cytotoxiciteit. Dit manuscript beschrijft een RNA transcriptie reactie, beeldvorming RNA met ethidiumbromide gekleurde gel en kwantificeren RNA met UV-Vis spectroscopie, teneinde transcriptie remming te bepalen door corroles en toont een eenvoudige methode voor de beoordeling antikanker kandidaat eigenschappen.

Abstract

Chemotherapie gaat vaak gepaard met een breed spectrum van cytotoxische middelen met veel bijwerkingen en beperkte targeting. Corroles zijn een klasse van tetrapyrrolic macrocyclische die differentiële cytostatische en cytotoxische eigenschappen in bepaalde cellijnen, afhankelijk van de identiteit van het gechelateerde metaal en functionele groepen vertonen. De unieke gedrag van gefunctionaliseerde corroles op specifieke cellijnen introduceert de mogelijkheid van gerichte chemotherapie.

Veel antikankergeneesmiddelen worden beoordeeld op hun vermogen om RNA transcriptie remmen. Hier geven we een stap-voor-stap protocol voor RNA-transcriptie in aanwezigheid van bekende en potentiële inhibitoren. De evaluatie van de RNA produkten van de transcriptiereactie door gelelektroforese en UV-Vis spectroscopie levert informatie over remmende eigenschappen van potentiële kandidaten geneesmiddel tegen kanker, met modificaties om de analyse, over hun werkingsmechanisme.

Weinigbekend is over de moleculaire werkingsmechanisme van corrole cytotoxiciteit. In dit experiment, beschouwen we twee corrole verbindingen: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) en freebase analoge 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Een RNA transcriptie assay werd gebruikt om de remmende eigenschappen van de corroles onderzoeken. Vijf transcriptiereacties werden bereid: DNA behandeld met Actinomycine D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc op [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01, respectievelijk, en een onbehandelde controle.

De transcriptiereacties werden geanalyseerd na 4 uur met agarose gelelektroforese en UV-Vis spectroscopie. Er is een duidelijke remming door Ga (tpfc), Actinomycine D, en triptolide.

Dit RNA transcriptie assay kan worden gewijzigd om de mechanistische wordt ingegaan door het variëren van de concentraties van de antikanker complex, DNA of polymerase enzym, of door incubatie van het DNA polymerase of het complexes voor RNA transcriptie; Deze modificaties zouden maken tussen een remming mechanisme met het DNA of het enzym. Het toevoegen van het complex na RNA transcriptie kan worden gebruikt om te testen of de complexen afbreken of hydrolyseren het RNA. Deze test kan ook worden gebruikt om extra antikanker kandidaten bestuderen.

Introduction

Chemotherapie gaat vaak breed-spectrum cytotoxische middelen met ongewenste bijwerkingen en beperkt targeting, maar met een beter begrip van de biologie van kanker, is er een steeds toenemende vraag naar antikankermiddelen met groter kanker targeting werkzaamheid en minder bijwerkingen. 1 menselijke kankercellen veelvuldig worden afhankelijk van één geactiveerd of overexpressie oncogen te overleven. 2 zijn dus vele antikankergeneesmiddelen beoordeeld op hun vermogen om RNA transcriptie remmen. Behandelingen die de expressie van deze transformerende genen blokkeren effectief in het elimineren van kankercellen en leidt tot celdood. 3 Getransformeerde cellen gevoeliger voor verstoringen in RNA transcriptie dan zijn overeenkomstige normale cellen. 4 Antikankergeneesmiddelen die transcriptie remmen verwachting selectief remmen de expressie van de oncogenen die voor de kankercel te overleven. 5 Bijgevolg RNA transcriptie inhibition is een handige manier om potentiële kandidaten medicijn tegen kanker te identificeren en leer meer over hun werkingsmechanisme. Dit protocol laat zien dat Ga (tpfc) remt RNA transcriptie op dezelfde volgorde als de chemotherapie drugs Actinomycine D en triptolide; gelijkaardige vergelijkingen kunnen worden gemaakt met behulp van dit protocol met andere kandidaten medicijn tegen kanker. Actinomycine D is een RNA transcriptie remmer gebruikelijke zwangerschapsduur trofoblastische kanker, testiculaire kanker, Wilm's tumor, rhabdomyosacoma behandelen en Ewing-sarcoom 6. Actinomycine D is gebruikt bij kankertherapie bijna vijftig jaar geleden voor het eerst werd goedgekeurd door de FDA in 1964.Triptolide een selectieve transcriptie remmer die is onderzocht in vitro en in diverse tumordragende diermodellen 30 jaar. 7

De amfifiele macrocyclische aard van corroles schenkt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere klassen van geneesmiddelen zoals kleine moleculen of biologisches. 8-14 De macrocyclische karakter maakt cellulaire permeabiliteit die groter is dan verwacht voor dergelijke grote moleculen, en zijn groot genoeg om met macromoleculaire oppervlakken, zoals eiwitten. 8 Corroles bekend strak covalente complexen vormen met biomoleculen en drugs. 10 Naast de inherente cytotoxiciteit van het corrole raamwerk hebben we aangetoond dat een gesulfoneerd corrole fungeert als een dragermolecuul voor chemotherapeutische middelen, in het bijzonder de DNA-intercalerende antracyclinegeneesmiddel doxorubicine. Wanneer het gesulfoneerde corrole werd toegediend met doxorubicine, werd een 3-voudige verhoging in de IC50 van doxorubicine waargenomen voor DU-145-cellen. 9 corrole raamwerk is stabiel en heeft inherente absorptie en fluorescentie-eigenschappen die bij gefunctionaliseerde ondergaan unieke absorptie verschuivingen die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren. 10 functionalisering van de steiger niet inherent affect de fotofysische eigenschappen van de corrole, 9-15 maar zoals gezien met een gesulfoneerd corrole selectief modificeren van het kader van de corrole kan zijn biologische eigenschappen aanzienlijk veranderen. 16 We hebben eerder geëvalueerd zes metallocorroles tegen zeven menselijke kankercellijnen. De resultaten geven aan dat de toxiciteit tegen menselijke kankercellen is afhankelijk van de specifieke metaalion, evenals functionele groep substitutie. Bijvoorbeeld, gesulfoneerde gallium corroles ervaren hoge cellulaire opname en selectief doorgedrongen tot in de kern van de hersenen uitgezaaide prostaatkanker cellen (DU-145); hetzelfde corrole, hoewel het niet doordringt in de kern van andere cellijnen, vertoont grotere cytotoxiciteit voor borst (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28) en eierstokkanker (OVCAR-3) kankercellen dan prostaatkanker. 9

Eerste celgebaseerde proeven geven aan dat deze verbindingen veelbelovend als anti-kanker therapeutische middelen, die furth grondeer onderzoek naar het werkingsmechanisme. Transcriptie remming wordt waargenomen bij bepaalde organometalische 17-27 en we getracht dit proces een mogelijk mechanisme voor de cytotoxische werking van de corrole familie onderzocht. Deze transcriptie assay biedt een eenvoudige, goedkope en gemakkelijke methode voor het beoordelen van de transcriptie remming, die zal leiden tot meer gedetailleerde informatie over de effecten van deze moleculen in levende cellen.

Hier, de transcriptie remming van gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) en de vrije base analogon 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figuur 1) getest. In tegenstelling tot sommige overgangsmetaalcomplexen, gallium (III) is redox inactief en dus niet direct betrokken is bij de redox proces van redox-gebaseerde metabole routes. 28 Ongeacht, gallium (III) vertoont cytotoxische eigenschappen en is onderzocht voor therapeutische doeleinden. Gallium is de tweede meest veelbelovende metaal voor antikanker geneesmiddelen na platina en heeft vele studies en onderzoeken ondergaan; nitraat en chloride gallium zouten zijn geëvalueerd in klinische studies tegen hepatoma, lymfoom, blaas kanker en andere ziekten. 29-34 Gallium (III) is daarom ideaal voor kanker corrole studies. Aanvankelijke gegevens blijkt Ga (tpfc) en tpfc lage GI 50, de geneesmiddelconcentratie nodig 50% van de maximale celproliferatie inhiberen, met diverse kankercellijnen (zie figuur 2); Dit bevestigt de geldigheid van verdere experimenten op deze twee verbindingen om hun remmende eigenschappen te bepalen. We vergelijken deze verbindingen met de gemeenschappelijke geneesmiddelen tegen kanker Actinomycine D en triptolide. Actinomycine D intercalaten DNA, RNA rek remt en apoptose in bepaalde cellijn picomolaire concentraties 6,35-37 Triptolide blijkt tumorgroei te remmen.; het bindt aan menselijke XPB / ERCC3 een subeenheid of transcriptiefactor TFIIH, leidt tot remming van RNA-polymerase II-activiteit. 6-7,38-40

Terwijl het algemeen bekend dat corroles vertonen cytotoxische eigenschappen, bestaat er weinig informatie over de verschillende mechanismen die voortvloeien uit functionalizatie. Corrole remming van RNA-transcriptie zou meer inzicht in hun interacties met biomacromoleculen bieden. Andere complexen bekend te binden aan DNA, zoals dirhodium (II, II) complexen, chroom (III) complexen, ruthenium (II) complexen polypyridyl, rhodium (III) complexen, en diverse anderen, werden onderworpen aan RNA transcriptie assays, 18- 27 resulteert in een beter begrip van hun interacties met biomacromoleculen. Deze gemakkelijke en overal verkrijgbaar experiment is ook een goede eerste test om de cytotoxiciteit eigenschappen van een bepaald molecuul te beoordelen en te bepalen of het zou nader biologische testen. Het RNA transcriptie assay maakt ook vele modificaties, zoals varyinG de hoeveelheid verbinding of enzymen; variëren van de incubatietijd, de reactietijd en het monster tijdstippen; en variëren van de DNA-template lengte en sequentie onder andere van belang zijnde variabelen, zo potentieel die een grote hoeveelheid gegevens. Deze transcriptie test is ook beschikbaar als betaalbare kits met alle benodigde reactie componenten geleverd, hoewel componenten kunnen worden gekocht en individueel bereid. In deze experimenten, gebruiken we een commercieel verkrijgbare kit bekende hoog rendement hebben. 41

Om transcriptie remming te bepalen, gebruiken we twee methoden: agarose gel elektroforese en UV-Vis spectroscopie. Agarose gelelektroforese is een eenvoudige en effectieve methode voor het scheiden, identificeren en zuiveren van 0,5- tot 25-kb DNA en RNA fragmenten. 42 UV-Vis spectroscopie kan worden gebruikt om de concentratie en zuiverheid van het RNA te bepalen. 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Bij het werken met RNA handhaven van een schone werkomgeving om besmetting door DNase en RNase enzymen die DNA en RNA degraderen te voorkomen. Zorg ervoor dat pipet tips en buizen zijn DNase en RNase vrij. Het is ook nuttig om te vegen van lab oppervlakken en apparatuur zoals pipetten, slang houders, enz. Met een decontaminatie-oplossing.

1. RNA transcriptie met Corrole Treatment

  1. Bereid de corrole en inhibitor verbindingen in een 0,01: 1 molverhouding van [complex]: [DNA].
    Opmerking: In ons geval is de verhouding 4,3 fmol complex: 0.43 pmol DNA, waarbij de DNA-template gebruikt werd APET-28c vector met LIGA gen uit E. coli onder controle van de T7 promoter. Andere DNA met de T7 promoter gelden ook kandidaten voor het uitvoeren van de transcriptie assay.
    1. Ontbinden Actinomycine D, triptolide, tpfc, en Ga (tpfc) in dimethylsulfoxide (DMSO) in schone, aparte containers. Verkrijg de uiteindelijke concentratie van 0,01: 1 molaire verhouding van [complex]: [DNA] met behulp van seriële verdunningen met nuclease-vrij water.
      1. Los 1 mg Actinomycine D in 1,8 ml DMSO. Aliquot 10 pi om een ​​aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een verdunning van 1/100 te creëren. Portie 1 pl van de verdunning tot een aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een 1/1000 verdunning creëren.
        Opmerking: De concentratie van de eindoplossing van Actinomycine D 4.3 fmol.
      2. Los 1 mg triptolide in 0,64 ml DMSO. Portie 1 ui in een aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een 1/1000 verdunning creëren. Portie 1 pl van de verdunning tot een aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een tweede 1/1000 verdunning creëren.
        Opmerking: De concentratie van de eindoplossing van triptolide 4,3 fmol.
      3. Los 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquot 10 pi om een ​​aparte container en vul aan met nuclease-vrij water 1 ml in een 1/100 d creërenilution. Portie 1 pl van de verdunning tot een aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een 1/1000 verdunning creëren.
        Opmerking: De concentratie van de eindoplossing van tpfc 4,3 fmol.
      4. Los 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquot 10 pi om een ​​aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een verdunning van 1/100 te creëren. Portie 1 pl van de verdunning tot een aparte container en vul aan tot 1 ml met nuclease-vrij water tot een 1/1000 verdunning creëren.
        OPMERKING: De concentratie van de uiteindelijke oplossing van Ga (tpfc) is 4,3 fmol.
        Opmerking: Deze corroles en remmers niet oplosbaar zijn in water en moeten vooraf worden opgelost in DMSO. Kleine hoeveelheden DMSO (minder dan 1%) niet cytotoxiciteit in cellen (ongepubliceerde gegevens) induceren.
  2. Voorafgaand aan het begin van de transcriptie reactie, de voorbereiding van de noodzakelijke reagentia individueel of kopen ze van een commerciële leverancier.
    1. Dooi op ijs al bevroorn reagentia (zie tabel 1 voor een overzicht van bevroren reagentia).
    2. Laat de 10x Reaction Buffer en 4 ribonucleotide (ATP, CTP, GTP en UTP) -oplossingen tijd mengen totdat zij volledig opgelost in oplossing.
    3. Kort centrifugeren alle reagentia aan materiaalverlies voorkomen op de rand van de buis. Eenmaal ontdooid, winkel ribonucleotides op het ijs terwijl de 10x Reaction Buffer bij RT.
    4. Combineer reagentia voor transcriptie reactie bij RT (zie tabel 2 voor een lijst van reagentia).
      OPMERKING: De spermidine in de 10x Reaction Buffer kan het matrijs DNA coprecipiteren als de reactie is gemonteerd op ijs plaats bij kamertemperatuur.
    5. Meng goed door de knop van de buis of pipetteren het mengsel op en neer voorzichtig. Na mengen centrifuge kort reactiemengsel verzamelen op de bodem van de buis.
    6. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende een totaal van 2-4 uur.
      LET OP: De benodigde reactietijden zullen variërenmet DNA matrijs grootte en sequentie. Deze stap kan optimalisatie voor specifieke sequenties vereist. Kortere templates kunnen langere reactietijden noodzakelijk voor een hoge opbrengst van totaal RNA.
    7. Verwijder 4 pi aliquots van elke reactie na elk uur en bewaar bij -20 ° C. Pas als nodig voor de gewenste tijdstippen.

2. RNA Spin Column

  1. Na de transcriptie reactie, zuivert het RNA met microcentrifuge-compatibele chromatografiekolommen.
    Opmerking. Het gebruik van RNA spinkoloms RNA te zuiveren met meer dan 20 basen leidt tot meer dan 80% terugwinning 44
    OPMERKING: Kolomchromatografie is een frequente en handige methode om RNA te zuiveren. Andere zuiveringsmethoden ook voorkomen als lithiumchloride neerslag, fenol: chloroform extractie, isopropanol precipitatie, alsmede andere in de handel verkrijgbare kits.
    1. Gelijkmatig resuspendeer de Sephadex matrix in de kolom buffer door krachtig omkeren van dekolom drie of meer keer. Doe dit door de knop in de kolom scherp.
    2. Verwijder de dop van de kolom. Er zullen enkele resterende Séphadex matrix in de dop zijn; Als de dop wordt gevuld met de matrix de dop op de kolom en herhaal de voorgaande stap totdat het merendeel van de matrix in de kolom.
    3. Breek de onderste punt van de kolom.
      OPMERKING: Sommige vloeistof kan ontsnappen uit de kolom.
    4. Verpak de kolom.
      1. Plaats de kolom in een steriele (RNase en DNase-vrij) 1,5 ml microcentrifugebuis.
      2. Centrifugeer de buis in een tafelblad centrifuge bij 1000 xg gedurende 1 min.
    5. Gooi de 1,5 ml microcentrifugebuis met buffer geëlueerd uit de kolom.
    6. Onmiddellijk plaats de kolom in een nieuwe steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en pipet het monster naar het midden van de kolom bed. Gebruik 20-50 ul van het monster te voorkomen dat overbelasting van de kolom.
    7. Centrifugeer de buis in een tafelblad centrifuge bij 1000 xggedurende 1 min.
      OPMERKING: Het eluens is het gezuiverde RNA-monster.

3. Agarose gelelektroforese (1% agarosegel) 42

OPMERKING: Ethidiumbromide fluoresceert na binding aan DNA en RNA, dus deze biomoleculen kunnen worden gevisualiseerd met UV licht door incuberen met 0,5 ug / ml ethidiumbromide oplossing.

  1. Bereid een 1000x voorraadoplossing van ethidiumbromide (0,5 mg / ml) door het oplossen van 5 mg ethidium bromide in 10 ml water.
  2. Bereid Tris acetaat EDTA (TAE) loopbuffer voor gelelektroforese. Om een ​​50x TAE buffer combineren 2,0 M Tris-acetaat met 0,05 M Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en de pH op 8,5.
  3. Maak een 1% (w / v) agarosegel door het oplossen van 10 g UltraPure Agarose in 1 L 1 x TAE buffer en smelten van de agarose met een conventionele magnetronoven. Na afkoelen op 50 ° C, voeg 1 ml 1000x ethidiumbromide tot 1% agarosegel oplostie, meng door voorzichtig schudden of door het omkeren in een gesloten container, en giet de agarose oplossing in een gel-casting platform en laat de gel te stollen bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Ethidiumbromide is mutageen en potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen en handvat oplossingen zorgvuldig. Voor een juiste verwerking procedures van ethidiumbromide, zie: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Nadat de gel is gestold, plaatst u de set gel in de elektroforese tank. Voeg genoeg TAE buffer om de gel te dekken tot de putjes ondergedompeld. Controleer dat het niveau van de TAE buffer ongeveer 1 mm boven het niveau van de gel. Verwijder de gel kam.
    LET OP: Het verwijderen van de kam na putten worden ondergedompeld voorkomt luchtzakken van wordt gevangen in de putten.
  5. Bereid de RNA-monsters. Combineer 1 pi van elk monster gezuiverd aliquot met 1 pl gelbeladingsbuffer (of met 1 pi 10x laadbuffer en diluted tot 10 ul met nuclease-vrij water) en goed te mengen door en neer te pipetteren met een micropipet.
    OPMERKING: 10x loading buffer bevat 20% Ficoll 400, 0,1 M Na2EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% broomfenolblauw. 0,25% xyleencyanol kunnen ook worden toegevoegd aan de laadbuffer, omdat zij ingaat ~ 50% zo snel als broomfenolblauw en kan nuttig zijn voor het monitoren lange runs. 42
  6. Laad de gel bij elk monster door voorzichtig pipetteren de oplossing in de bodem van elk putje. Zorg dat er geen luchtbellen te verlaten of meng monsters tussen putten.
    OPMERKING: een RNA ladder kan ook worden gebruikt om de grootte van het transcript te bepalen.
  7. Bevestig de draden zodat het DNA zal migreren in de gel naar de plus. Stel de spanning op het gewenste niveau, kenmerkend 1 tot 10 V / cm gel. Laat de gel voor hoe lang is voldoende om significante scheiding tussen de RNA-fragmenten, met de migratie van kleurstoffen aan de voortgang van de scheiding te volgen.
    NOTE: Een 23 cm x 25 cm gel bij 250 V zal ongeveer 1 uur duren, terwijl een 8 cm x 8 cm gel bij 150 V zal ongeveer 20 minuten duren. Kleinere RNA fragmenten betere resolutie bij werking bij hogere spanningen.
  8. Schakel de stroomtoevoer wanneer de kleurstof uit de beladingsbuffer een afstand voldoende voor de scheiding tussen de RNA-fragmenten geoordeeld is geëmigreerd.
  9. Afbeelding van de RNA onder UV-licht als de ethidiumbromide fluoresceren.
  10. Maak een foto van het beeld en vergelijk fluorescentie-intensiteiten van het gezuiverde RNA van elke conditie.

4. RNA kwantificering via UV-Vis spectroscopie

  1. Plaats 2 pi H 2 O op een NanoDrop 2000, of een soortgelijke machine, en meet de Blanco.
  2. Plaats vervolgens 2 pl van elk RNA monster, na zuivering op de spectrofotometer meet UV-Vis van een golflengtebereik van 200 nm tot 800 nm.
    OPMERKING: Een A260 lezing van 1,0 equivalent tot ongeveer 40 ug / ml RNA,en pure RNA heeft een A260 / A280-verhouding van 2,1. 45
  3. In het geval dat absorptie boven 1 OD verdunnen monsters in nuclease-vrij water tot een OD van minder dan 1 te verkrijgen.
  4. Gebruik grafische software om de verschillende monsters te plotten en vergelijk OD bij 260 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA transcriptie kwalitatief beoordeeld door agarosegelelectroforese

Agarose gelelektroforese wordt gebruikt om beeld het getranscribeerde RNA. Ethidiumbromide fluoresceert na binding (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 waardoor beeldvorming van RNA. Donkere banden in de gel corresponderen met hogere concentraties van RNA. Als Actinomycine D, triptolide, of hetzij corrole complex remt RNA transcriptie, wordt de productie van RNA verminderd en zal de band lichter verschijnen. Met dit concept kan relatieve remming worden beoordeeld.

Figuur 3 toont de met ethidiumbromide gekleurde agarosegel (1%) van RNA transcriptie reacties voorbehandeld zonder complexe, Actinomycine D, triptolide, tpfc of Ga (tpfc) op [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01 : 1. Actinomycine D en triptolide een duidelijke afname van RNA in vergelijking met dat van de controle, als verwachtdeze lang bestudeerd remmers. De Ga (tpfc) band ook een zeer lage RNA, terwijl de tpfc band vertoont weinig tot geen inhibitie en vertoont dezelfde relatieve intensiteit als de controle.

RNA transcriptie gekwantificeerd door UV-Vis spectroscopie

UV-Vis-metingen werden voor elk monster na het ondergaan van RNA transcriptie gedurende 4 uur en gezuiverd met RNA rotatie kolomchromatografie. De spectra van golflengtes 220 nm tot 350 nm zijn weergegeven in figuur 4, met λ max wordt bij 260 nm, overeenkomend met RNA absorptie en extinctiecoëfficiënt van 0.025 (ug / ml) -1 cm -1. De absorptie bij 260 nm en 280 nm zijn in tabel 3. Een A260 lezing van 1,0 equivalent tot ongeveer 40 ug / ml RNA en pure RNA heeft een A260 / A280-verhouding van 2,1, waardoor kwantitatieve berekeningen RNA geproduceerd tijdens de transschrijving reactie en een evaluatie van de zuiverheid van het RNA na gebruik van de kolom RNA rotatie. 44 Drie van de vier-remmer behandelde transcriptiereacties leverde RNA minder dan de controle, met Ga (tpfc) behandeld DNA transcriberen slechts 0,07 keer meer RNA als onbehandeld DNA. tpfc behandelde DNA vertoonden geen duidelijke remming. Alle monsters een A260 / A280 verhouding van ongeveer 2,2 te geven relatief zuivere monsters. Zuivering door RNA spinkolommen verwijdert korte RNA-strengen 20 of minder nucleotiden lang. Resterende DNA of strengen langer dan 20 nucleotiden aanwezig in wat wordt beschouwd de gezuiverde monsters. Deze lichte verontreinigingen leidt tot een A260 / A280 verhouding iets groter dan 2,1.

Figuur 1
Figuur 1. Moleculaire structuren van gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) en de freebase analoge 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Cytotoxiciteit bochten en GI-50 waarden van corroles in de prostaat (DU-145) (grijs), borst (MDA-MB-231) (blauw), de huid (SK-MEL-28) (oranje) en eierstokkanker (OVCAR -3) (groen) kankercellijnen. Cellen werden geïncubeerd met (A) Ga (tpfc) en (B) tpfc, gevolgd door bepaling van levensvatbaarheid met de MTS-gebaseerde colorimetrische cellevensvatbaarheid bepaling volgens protocol van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.

Figuur 3
Figuur 3. ethidiumbromide gekleurde agarosegel (1%) van transcriptie reacties na 4 uur incubatie. Baan 1 is een 1000 bp DNA-ladder als standaard. Lanen 2-6 tonen de RNA getranscribeerd van 0,43 pmol DNA en behandeld met 4,3 fmol van elke remmer (a [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01): controle (laan 2), Actinomycine D (laan 3), triptolide (laan 4), tpfc (laan 5) en Ga (tpfc) (laan 6).

Figuur 4
Figuur 4. UV-Vis spectrum van 1:. 200 verdunning van getranscribeerd RNA na 4 uur incuberen De DNA-matrijs voor de transcriptie reactiemengsel werd behandeld met geen ingewikkelde of met Actinomycine D, triptolide, tpfc of Ga (tpfc) bij een [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01: 1. De RNA-concentratie wordt gemeten door OD bij 260 nm.

Ontdooi bevroren reagentia op het ijs:
75 mM oplossingen van adenosine trifosfaat, guanosine trifosfaat, cytidine trifosfaat en uridine trifosfaat (ATP, CTP, GTP, UTP)
Nuclease-vrij Water
10x Reaction Buffer (1x Reaction Buffer: 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9)
Gelineariseerde template DNA (0,5 ug / ml, 1,85 kb)
RNA polymerase enzym (20 U / ul)

Tabel 1. Lijst van bevroren reagentia.

Om de transcriptiereacties beginnen, voeg de volgende hoeveelheid van elk reagens in 0,2 ml dunwandige PCR-buisjes:
2 piATP oplossing (75 mM)
2 pl CTP-oplossing (75 mM)
2 pl GTP-oplossing (75 mM)
2 pl UTP oplossing (75 mM)
1 ul nuclease-vrij water
2 pl 10x Reaction Buffer
2 pl van 0,5 ug / ul lineair template DNA
5 ul complex (-kern gratis water als de lege, actinomycine D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 pl RNA polymerase (20 U / ul)

Tabel 2. Lijst van reagentia voor transcriptie reactie.

Time Point (hr) Complex A260 A280 </ Strong> A260 / A280 Verwatering Factor [RNA]: A260
(Ug / ml) 		[RNA] (mg / ml)
4 Controle 7,583 3,516 2.16 200 40 60.67
4 Actinomycine D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1.794 0,816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3.631 2.16 200 40 62,87
4 Ga (tpfc) 0,554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabel 3. concentratie en zuiverheid van getranscribeerd RNA na 4 uur gemeten door UV-Vis spectroscopie. De extinctiecoëfficiënt van enkelstrengs RNA 0,025 (ug / ml) -1 cm -1, een A260 lezing van 1,0 is gelijk aan ongeveer 40 ug / ml RNA en pure RNA heeft een A260 / A280-verhouding van 2,1. 45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze test toont aan dat de toevoeging van Ga (tpfc) remt RNA transcriptie vergelijkbaar met de bekende DNA-bindende kanker complexen Actinomycine D en triptolide. De cytotoxische gedrag van Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 uM) mag vanwege zijn remmende eigenschappen. Aangezien geen transcriptie remming werd waargenomen in tpfc de cytotoxiciteit van tpfc niet door RNA transcriptie remming maar door andere middelen nog niet bestudeerd.

In de vier transcriptiereacties uitgevoerd, werd DNA behandeld met Actinomycine D, triptolide, tpfc of Ga (tpfc), een [complex]: [template DNA base] verhouding van 0,01, respectievelijk, of een onbehandelde controle. De transcriptiereactie reagentia werden gecombineerd en de transcriptie reactiemengsel liet men gedurende 4 uur bij 37 ° C. De getranscribeerde RNA werd gezuiverd door een RNA spinkolom en de opbrengst door UV-Vis en gelelektroforese geanalyseerd. De aard van transcriptie remming kan worden Furthaar onderzocht met dezelfde techniek diverse modificaties of de verbindingen kunnen worden onderworpen aan andere in vitro en in vivo studies. Additionele experimenten die kunnen helpen bepalen de moleculaire aard van de inhibitie omvatten röntgenkristallografie mogelijke corrole-DNA adducten of numerieke modellering van de transcriptiereactie. Het doel van dit experiment was om te bepalen of de verbindingen remmen transcriptie om informatie te verzamelen over de mogelijke antikanker eigenschappen. Dat doel werd bereikt: tpfc vertoonden geen remming, terwijl Ga (tpfc) vertoonden duidelijke remming en verdient nadere studie.

Het RNA transcriptie assay kan worden gewijzigd om de mechanistische wordt ingegaan. Toevoeging van de antikankermiddelen (bijvoorbeeld de corrole complexen) na de transcriptie reactie voltooid kan aantonen of de complexen afbreken of hydrolyseren het RNA. Een andere aanbevolen experiment uit te voerende transcriptie reactie met alle componenten behalve de RNA-polymerase-enzym 10-voudig lager mogelijk te maken onderscheid tussen een inhibitie mechanisme met het DNA of het enzym. Tenslotte incubatie van het DNA of de polymerase de complexen voor RNA transcriptie mogelijk zou maken verhoogde binding van het complex en de respectieve streefwaarden, vraag of de complexe remmende eigenschappen zijn betrokken bij DNA of polymerase binding respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Onze oprechte dank Dr. Cindy N. Chiu voor hulp met gelelektroforese, en Andy Zhou en Michael Grodick voor hun genereuze donatie van DNA en restrictie-enzym. Wij dankbaar erkennen Professor J. Heath en professor D. Prober voor genereuze toegang tot apparatuur en materialen. Wij danken dr Karn Sorasaenee voor nuttige tips. Wij danken Mary H. Tang voor het maken van de afbeelding in het schematische overzicht in de video. De financiering werd verstrekt door Johnson & Johnson en USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O  Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

Tags

Bioengineering Corrole RNA transcriptie remming anti-kanker DNA binding Actinomycine D triptolide
Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, G. Y., Pribisko, M. A.,… More

Tang, G. Y., Pribisko, M. A., Henning, R. K., Lim, P., Termini, J., Gray, H. B., Grubbs, R. H. An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles. J. Vis. Exp. (97), e52355, doi:10.3791/52355 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter