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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un Published: March 18, 2015 doi: 10.3791/52355
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Molecular Medicine, Beckman Research Institute of the City of Hope

Summary

Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l'inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.

Abstract

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con molti effetti collaterali e il targeting limitato. Corroles sono una classe di macrocicli tetrapirrolici che presentano differenziali proprietà citostatici e citotossici in linee cellulari specifici, a seconda delle identità del metallo chelato e gruppi funzionali. Il comportamento unico di corroles funzionalizzati verso linee cellulari specifiche introduce la possibilità di chemioterapia mirata.

Molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell'RNA. Presentiamo qui un protocollo passo-passo per RNA trascrizione in presenza di inibitori noti e potenziali. La valutazione dei prodotti RNA della reazione di trascrizione mediante elettroforesi su gel e-Vis UV spettroscopia fornisce informazioni sulle proprietà inibitive di potenziali farmaci candidati antitumorali e, con modifiche al dosaggio, più circa il loro meccanismo d'azione.

Piccolosi conosce il meccanismo molecolare di azione di citotossicità corrole. In questo esperimento, consideriamo due composti corrole: gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analogici freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un saggio di trascrizione dell'RNA è stata utilizzata per esaminare le proprietà anticorrosione dei corroles. Cinque reazioni di trascrizione sono stati preparati: DNA trattato con Actinomicina D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc a [complesso]: [modello base DNA] rapporto 0,01, rispettivamente, e un testimone non trattato.

Le reazioni di trascrizione sono stati analizzati dopo 4 ore mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettroscopia UV-Vis. C'è l'inibizione chiaro Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide.

Questo test RNA trascrizione può essere modificato per fornire dettagli più meccanicistica variando le concentrazioni del complesso antitumorale, DNA, o enzima polimerasi, o incubando il DNA polimerasi o con il complexes prima RNA di trascrizione; queste modifiche sarebbero distinguere tra un meccanismo di inibizione coinvolge il DNA o l'enzima. Aggiunta del complesso dopo la trascrizione dell'RNA può essere utilizzato per verificare se i complessi degradano o idrolizzare l'RNA. Questo test può anche essere usato per studiare ulteriori candidati antitumorali.

Introduction

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con effetti collaterali indesiderati e il targeting limitata, ma con una maggiore comprensione della biologia del cancro, vi è una sempre crescente domanda di farmaci antitumorali con efficacia il cancro-targeting superiore e minori effetti collaterali. 1 le cellule tumorali umane spesso diventano dipendenti da un singolo oncogene attivato o overexpressed per la sopravvivenza 2 Così., molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell'RNA. Trattamenti che bloccano l'espressione di questi geni che trasformano sono efficaci per eliminare le cellule tumorali e portano alla morte cellulare. 3 Le cellule trasformate sono più sensibili alle interruzioni di RNA di trascrizione di quelle corrispondenti cellule normali. 4 farmaci antitumorali che inibiscono la trascrizione dovrebbero inibire selettivamente la espressione degli oncogeni che sono necessari per la cellula tumorale di sopravvivere. 5 Di conseguenza, i trascrizione dell'RNAnhibition è un modo utile per identificare i potenziali candidati farmaco antitumorale e saperne di più sul loro meccanismo d'azione. Questo protocollo dimostra che Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell'RNA sullo stesso ordine delle droghe di chemioterapia Actinomicina D e triptolide; paragoni simili possono essere effettuate utilizzando questo protocollo con altri farmaci candidati antitumorale. Actinomicina D è un inibitore della trascrizione di RNA comunemente usato per trattare il cancro gestazionale trofoblastica, cancro ai testicoli, tumore di Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing sarcoma di 6. Actinomicina D è stato utilizzato nella terapia del cancro per quasi 50 anni da quando è stata approvata dalla FDA nel 1964.Triptolide è un inibitore selettivo della trascrizione che è stata valutata in vitro e in vari modelli animali di tumore per 30 anni. 7

La natura amfifilico macrociclico di corroles conferisce vantaggi significativi rispetto ad altri classi di farmaci, quali piccole molecole o biologicas. 8-14 Il carattere macrociclico permette permeabilità cellulare che è maggiore del previsto per tali grandi molecole, e sono abbastanza grandi per interagire con superfici macromolecolari, come quelle delle proteine. 8 Corroles sono noti per formare complessi covalenti stretti con biomolecole e droghe. 10 Oltre alla citotossicità intrinseca del quadro corrole, abbiamo dimostrato che un solfonati agisce corrole come una molecola carrier per agenti chemioterapici, in particolare il antracicline doxorubicina farmaco-DNA intercalanti. Quando il corrole solfonata è stato somministrato con doxorubicina, un aumento di 3 volte nella IC 50 di doxorubicina è stata osservata per DU-145 cellule. 9 Il quadro corrole è stabile e ha assorbanza e fluorescenza intrinseche proprietà che, quando funzionalizzato, sottoposti a turni di assorbanza unici che possono essere utilizzati per la caratterizzazione. 10 Funzionalizzazione del ponteggio no intrinsecamente affetto,t le proprietà fotofisiche del corrole, 9-15 ma, come si è visto con un corrole solfonato, modificando selettivamente quadro del corrole può cambiare in modo sostanziale le sue proprietà biologiche. 16 Abbiamo già valutato sei metallocorroles contro sette linee cellulari tumorali umane. I risultati indicano che la tossicità verso cellule tumorali umane dipende lo ione metallico specifica, così come la sostituzione del gruppo funzionale. Ad esempio, corroles gallio solfonati sperimentato elevato assorbimento cellulare e penetrarono selettivamente nel nucleo delle cellule tumorali della prostata metastatico cervello (DU-145); cellule stesso corrole, anche se non penetra nel nucleo di altre linee cellulari, presenta una maggiore citotossicità per il seno (MDA-MB-231), il melanoma (SK-MEL-28), e delle ovaie (OVCAR-3) che per il cancro il cancro alla prostata. 9

Saggi cellulari iniziali indicano che questi composti promettenti come anti-cancro agenti terapeutici, quali meriti Fürthindagini er nel meccanismo di azione. L'inibizione della trascrizione è osservato con alcuni complessi organometallici 17-27 e abbiamo cercato di esaminare questo processo come un possibile meccanismo per il comportamento citotossica della famiglia corrole. Questo test trascrizione fornisce un metodo semplice, poco costoso, e facile per valutare l'inibizione di trascrizione, che porterà a informazioni più dettagliate sugli effetti di queste molecole in cellule vive.

Qui, l'inibizione della trascrizione di gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)), e il suo analogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) sono testati. A differenza di alcuni complessi di metalli di transizione, di gallio (III) è redox inattivo e, pertanto, non è direttamente coinvolto nel processo redox delle vie metaboliche a base redox-. 28 Indipendentemente, gallio (III) non presentano proprietà citotossiche ed è stato indagato per scopi terapeutici. Gallio è il secondo metallo più promettente per terapie antitumorali dopo platino e ha subito molti studi e ricerche; sali nitrati e cloruro di gallio sono stati valutati in studi clinici contro epatocarcinoma, linfoma, tumori della vescica, e di altre malattie. 29-34 gallio (III) è quindi l'ideale per antitumorali studi corrole. I dati iniziali mostrano Ga (tpfc) e tpfc hanno un basso GI 50, la concentrazione necessaria farmaco per inibire il 50% della proliferazione cellulare massima, con varie linee cellulari tumorali (vedi figura 2); questo afferma la validità di ulteriori esperimenti su questi due composti per determinare le loro proprietà anticorrosione. Confrontiamo questi composti con i farmaci antitumorali comuni Actinomicina D e Triptolide. Actinomicina D intercala DNA, inibisce la RNA di allungamento, e induce apoptosi in alcune linee cellulari a concentrazioni picomolari 6,35-37 Triptolide ha dimostrato di inibire la crescita tumorale.; si lega a XPB umana / ERCC3, una subunità ofattore di trascrizione f TFIIH, porta alla inibizione della RNA polimerasi II attività. 6-7,38-40

Mentre è risaputo che corroles presentano proprietà citotossiche, esiste poca informazione sui diversi meccanismi derivanti dalla funzionalizzazione. L'inibizione Corrole di RNA trascrizione offrirebbe una maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Altri complessi noti per legarsi a DNA, come dirhodium (II, II), complessi di cromo (III), rutenio (II) polypyridyl, rodio (III), e vari altri, sono stati sottoposti a test RNA trascrizione, 18- 27 con conseguente maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Questo esperimento facile e ampiamente disponibile è anche un buon test iniziale per valutare le proprietà di citotossicità di una data molecola e determinare se merita ulteriori test biologici. Il dosaggio RNA trascrizione permette anche per molte modifiche, come varying la quantità di composto o enzimi utilizzati; variando il periodo di incubazione, tempo di reazione e momenti di campionamento; e variando la lunghezza del DNA modello e sequenza, tra le altre variabili di interesse, quindi potenzialmente fornendo una grande quantità di dati. Questo test trascrizione è anche facilmente disponibili come kit a prezzi accessibili con tutti i componenti della reazione necessari previsti, anche se i componenti possono essere acquistati e preparati singolarmente. In questi esperimenti, usiamo un kit disponibile in commercio noti per avere alto rendimento. 41

Per valutare l'inibizione della trascrizione, utilizziamo due metodi: elettroforesi gel e spettroscopia UV-Vis. Elettroforesi su gel di agarosio è un metodo semplice ed efficace per la separazione, l'identificazione e purificazione da 0,5 a DNA e RNA frammenti di 25 kb. 42 spettroscopia UV-Vis può essere utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza di RNA. 43

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Protocol

NOTA: Quando si lavora con l'RNA mantenere un ambiente di lavoro pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi enzimi che degradano il DNA e l'RNA. Assicurarsi che i puntali e tubi sono DNasi e RNasi gratuito. E 'utile anche per pulire le superfici di laboratorio e le attrezzature, come pipette, titolari di tubi, ecc, con una soluzione di decontaminazione.

1. RNA trascrizione con trattamento Corrole

  1. Preparare la corrole e inibitore composti in un 0.01: 1 rapporto molare [complesso]: [DNA].
    NOTA: Nel nostro caso, il rapporto era di 4,3 complessa fmol: 0.43 pmol DNA, dove il modello di DNA usato era APET-28c vettoriale con liga gene da E. coli sotto il controllo del promotore T7. Altri DNA con il promotore T7 sono anche candidati validi per l'esecuzione del test di trascrizione.
    1. Sciogliere Actinomicina D, triptolide, tpfc, e Ga (tpfc) in dimetilsolfossido (DMSO) in contenitori separati puliti. Ottenere la concentrazione finale di 0,01: 1 rapporto molare [complex]: [DNA] utilizzando diluizioni seriali con acqua priva di nucleasi.
      1. Sciogliere 1 mg Actinomicina D in 1,8 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000.
        NOTA: La concentrazione della soluzione finale di actinomicina D è 4,3 fmol.
      2. Sciogliere 1 mg triptolide a 0.64 ml DMSO. Aliquota 1 ml ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare un secondo 1 / 1.000 di diluizione.
        NOTA: La concentrazione della soluzione finale di triptolide è 4.3 fmol.
      3. Sciogliere 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e diluire a 1 ml con acqua priva di nucleasi per creare un 1/100 dilution. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000.
        NOTA: La concentrazione della soluzione finale di tpfc è 4.3 fmol.
      4. Sciogliere 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000.
        NOTA: La concentrazione della soluzione finale di Ga (tpfc) è 4.3 fmol.
        NOTA: Queste corroles e inibitori non sono solubili in acqua e devono essere pre-sciolti in DMSO. Piccole quantità di DMSO (inferiore all'1%) non inducono citotossicità in cellule (dati non pubblicati).
  2. Prima di iniziare la reazione di trascrizione, preparare i reagenti necessari singolarmente o acquistare da un fornitore commerciale.
    1. Thaw sul ghiaccio tutto congelaton reagenti (fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco di reagenti congelati).
    2. Lasciare che il 10X Reaction Buffer e il 4 ribonucleotide (ATP, CTP, GTP, e UTP) soluzioni tempo a mescolare fino a quando non sono completamente sciolti in soluzione.
    3. Centrifugare brevemente tutti i reagenti per prevenire la perdita di materiale sul bordo del tubo. Una volta scongelato, negozio ribonucleotidi sul ghiaccio, mantenendo il 10x Reaction Buffer a RT.
    4. Combine reagenti per la reazione di trascrizione in RT (vedi Tabella 2 per un elenco di reagenti).
      NOTA: La spermidina nella 10x tampone di reazione può coprecipitato DNA stampo se la reazione è montato su ghiaccio piuttosto che a RT.
    5. Mescolare accuratamente muovendo il tubo o la miscela pipettando su e giù delicatamente. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente per raccogliere miscela di reazione sul fondo della provetta.
    6. Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per un totale di 2-4 ore.
      NOTA: I tempi di reazione varieranno necessariecon dimensioni del modello di DNA e la sequenza. Questo passaggio potrebbe richiedere ottimizzazione per sequenze specifiche. Modelli più brevi possono richiedere tempi di reazione più lunghi per una elevata resa di RNA totale.
    7. Rimuovere 4 aliquote microlitri di ogni reazione dopo ogni ora e conservare a -20 ° C. Modificare come necessario per timepoints desiderati.

2. RNA Spin Column

  1. Dopo la reazione di trascrizione, purificare l'RNA usando colonne cromatografiche compatibile microcentrifuga.
    NOTA:. L'uso di colonne RNA selezione per purificare RNA con più del 20 basi risultati in maggiore dell'80% di recupero 44
    NOTA: Cromatografia su colonna è un metodo comune e conveniente per purificare RNA. Altri metodi di purificazione esistono anche come cloruro di litio precipitazione, fenolo: estrazione con cloroformio, isopropanolo precipitazione, nonché altri kit disponibili in commercio.
    1. Uniformemente risospendere matrice Sephadex nel buffer colonna vigorosamente invertendo lacolonna di tre o più volte. A tale scopo, sfogliando colonna bruscamente.
    2. Rimuovere il tappo superiore dalla colonna. Ci sarà qualche matrice Sephadex residua nel cap; se il tappo è riempito con la matrice, sostituire il tappo nella colonna e ripetere l'operazione precedente fino maggioranza della matrice è nella colonna.
    3. Snap al largo della punta inferiore della colonna.
      Nota: alcuni liquido può fuggire dalla colonna.
    4. Riempire la colonna.
      1. Mettere colonna in una sterile (RNasi e DNasi gratuito) provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
      2. Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xg per 1 min.
    5. Gettare la provetta da 1,5 ml con tampone eluito dalla colonna.
    6. Porre immediatamente la colonna in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e pipettare il campione al centro del letto della colonna. Utilizzare 20-50 ml di campione per evitare di sovraccaricare la colonna.
    7. Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xgper 1 min.
      NOTA: L'eluente è il campione di RNA purificato.

3. Agarosio elettroforesi su gel (1% agarosio Gel) 42

NOTA: bromuro di etidio reagisce dopo il legame al DNA e RNA, pertanto tali biomolecole possono essere visualizzate con luce UV incubandoli con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione.

  1. Preparare una soluzione 1,000x scorta di etidio bromuro (0,5 mg / ml) sciogliendo 5 mg di bromuro di etidio in 10 ml di acqua.
  2. Preparare Tris Acetato EDTA (TAE) buffer di corsa per elettroforesi su gel. Per fare un buffer 50x TAE combinare 2.0 M Tris-acetato con 0,05 M di acido etilendiamminotetracetico (EDTA) e regolare il pH a 8,5.
  3. Preparare una 1% (peso / volume) gel sciogliendo 10 g UltraPure agarosio in 1 L 1x TAE buffer e la fusione agarosio con un forno a microonde convenzionale. Una volta raffreddato a 50 ° C, aggiungere 1 ml di bromuro di etidio 1,000x al 1% gel di agarosio soluzione, mescolare agitando delicatamente o capovolgendo in un contenitore chiuso, quindi versare la soluzione di agarosio in una piattaforma-gel fusione e lasciare il gel di solidificare a temperatura ambiente.
    NOTA: il bromuro di etidio è mutageno e potenzialmente cancerogeno. Indossare guanti e maneggiare con cura le soluzioni. Per le procedure di manipolazione di bromuro di etidio, consultare: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 .
  4. Dopo che il gel si è solidificato, posizionare il gel set nel serbatoio elettroforesi. Aggiungere abbastanza tampone TAE a coprire il gel fino pozzetti sono sommersi. Verificare che il livello del buffer TAE è di circa 1 mm sopra il livello del gel. Rimuovere il pettine gel.
    NOTA: La rimozione del pettine dopo pozzi sono sommersi impedisce sacche d'aria di essere intrappolati nei pozzi.
  5. Preparare i campioni di RNA. Combina 1 ml di ciascuna aliquota campione purificato con 1 ml Gel Loading Buffer (o con 1 ml 10x tampone di caricamento e diluted al 10 microlitri di acqua priva di nucleasi) e mescolare accuratamente pipettando su e giù con una micropipetta.
    NOTA: 10x tampone di caricamento contiene il 20% Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% blu di bromofenolo. 0,25% Xilene cianolo può anche essere aggiunto al tampone di caricamento, in quanto corre ~ 50% più velocemente blu di bromofenolo e può essere utile per monitorare tirature molto lunghe. 42
  6. Caricare il gel con ciascun campione pipettando accuratamente la soluzione nel fondo di ciascun pozzetto. Fare attenzione a non lasciare bolle d'aria o mescolare campioni tra i pozzetti.
    NOTA: Una scala RNA può anche essere utilizzata per determinare la dimensione del trascritto.
  7. Fissare i cavi in ​​modo che il DNA migrerà nel gel verso il cavo positivo. Impostare la tensione al livello desiderato, tipicamente da 1 a 10 V / cm di gel. Eseguire il gel per tutto il tempo è sufficiente per significativa separazione tra i frammenti di RNA, usando la migrazione di coloranti per monitorare l'andamento della separazione.
    NOTE: A 23 centimetri x 25 cm gel a 250 V richiede circa 1 ora, mentre 8 cm x 8 cm gel a 150 V si terrà a circa 20 min. Frammenti di RNA più piccoli hanno una risoluzione migliore quando viene eseguito a tensioni superiori.
  8. Spegnere l'alimentazione quando il colorante dal buffer di caricamento è migrata una distanza giudicato sufficiente per la separazione tra i frammenti di RNA.
  9. Immagine del RNA sotto luce UV come bromuro di etidio sarà fluorescenza.
  10. Scatta una foto dell'immagine e confrontare intensità di fluorescenza di RNA purificato da ogni condizione.

4. Quantificazione RNA tramite spettroscopia UV-Vis

  1. Mettere 2 ml H 2 O su un NanoDrop 2000 o macchina simile, e misurare il vuoto.
  2. Quindi, posizionare 2 ml di ogni campione di RNA, seguenti purificazione, sulla spettrofotometro e misurare UV-Vis da una lunghezza d'onda di 200 nm a 800 nm.
    NOTA: Un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a circa 40 ug / ml di RNA,e RNA pura ha un A 260 / A 280 Rapporto di 2.1. 45
  3. Nel caso che l'assorbanza è superiore a 1 OD, diluire i campioni in acqua priva di nucleasi per ottenere un OD inferiore 1.
  4. Utilizzare software grafici per tracciare i vari campioni e confrontare OD a 260 nm.

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Representative Results

RNA Trascrizione Qualitativamente Valutazione effettuta da Gel di Agarosio

Elettroforesi su gel di agarosio è utilizzato per l'immagine RNA trascritto. Etidio bromuro reagisce dopo il legame (λ = 605 nm em, λ = 210 nm ex, 285 nm) 46 permette l'imaging di RNA. Bande scure nel gel corrispondono a concentrazioni più elevate di RNA. Se Actinomicina D, triptolide, o sia complesso corrole inibisce la trascrizione dell'RNA, la produzione di RNA è ridotta e la band apparirà più chiaro. Con questo concetto, l'inibizione relativa può essere valutata.

La Figura 3 mostra il bromuro di etidio macchiato gel di agarosio (1%) di reazioni di trascrizione dell'RNA pre-trattati senza complessi, actinomicina D, triptolide, tpfc o Ga (tpfc) a [complesso]: [modello base DNA] rapporto di 0,01 : 1. Actinomicina D e triptolide mostrano una netta diminuzione di RNA rispetto a quella del controllo, come previsto diquesti inibitori a lungo studiate. Il (tpfc) banda Ga ha anche un livello molto basso di RNA, mentre la band tpfc mostra poca o nessuna inibizione e presenta la stessa intensità relativa come controllo.

RNA Trascrizione quantificato tramite spettroscopia UV-Vis

Misure UV-Vis sono stati presi per ciascun campione dopo aver subito un RNA trascrizione per 4 ore e purificate con cromatografia su colonna RNA di spin. Gli spettri di lunghezza d'onda 220 nm a 350 nm sono mostrati in Figura 4, con la λ max verificano a 260 nm, corrispondente ad assorbimento RNA, ed un coefficiente di estinzione di 0,025 (g / ml) -1 cm -1. L'assorbanza a 260 nm e 280 nm sono riportati in Tabella 3. Un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a circa 40 mcg / ml di RNA e RNA puro ha un A 260 / A 280 rapporto di 2,1, consentendo calcoli quantitativi di RNA prodotta durante la transreazione cription e una valutazione della purezza del RNA dopo aver usato la colonna RNA di spin. 44 Tre delle quattro reazioni trascrizione inibitore trattati hanno prodotto meno RNA rispetto al controllo, con Ga (tpfc) DNA -treated trascrivere solo 0,07 volte tanto RNA come il DNA non trattato. DNA tpfc trattati ha mostrato alcuna inibizione apparente. Tutti i campioni hanno un rapporto A 260 / A 280 di circa 2,2, indicando campioni relativamente puri. Purificazione da colonne di spin RNA rimuove breve RNA filoni lungo 20 o meno nucleotidi. DNA residua o filamenti più lunghi di 20 nucleotidi possono essere presenti in quella che è considerata campioni purificati. Queste piccole impurità comporterebbe un / A rapporto A 260 280 leggermente maggiore di 2.1.

Figura 1
Figura 1. strutture molecolari di gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tPFC)) e l'analogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Curve citotossicità e GI di 50 valori di corroles in prostata (DU-145) (grigio), seno (MDA-MB-231) (blu), la pelle (SK-MEL-28) (arancione), e delle ovaie (OVCAR -3) (verde) linee cellulari tumorali. Le cellule sono state incubate con (A) Ga (tpfc) e (B) tpfc, seguita dalla determinazione della redditività con il MTS basata colorimetrico test vitalità cellulare secondo il protocollo del produttore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questofigura.

Figura 3
Figura 3. etidio bromuro macchiato gel di agarosio (1%) di reazioni di trascrizione dopo 4 ore di incubazione. Corsia 1 è un 1.000 bp DNA ladder come standard. Lanes 2-6 mostrano l'RNA trascritto dal 0,43 pmol DNA e trattati con 4.3 fmol di ogni inibitore (un [complesso]: rapporto [modello base DNA] di 0.01): il controllo (corsia 2), Actinomicina D (corsia 3), triptolide (corsia 4), tpfc (corsia 5), ​​e Ga (tpfc) (corsia 6).

Figura 4
Figura 4. UV-Vis spettro di 1:. 200 diluizione dell'RNA trascritto a dopo 4 ore di incubazione Il DNA stampo per la reazione di trascrizione è stata trattata senza complessi, o con actinomicina D, triptolide, tpfc o Ga (tpfc) a un [complesso]: [base DNA template] rapporto 0.01: 1. La concentrazione di RNA è misurata con OD a 260 nm.

Scongelare reagenti congelati su ghiaccio:
Soluzioni 75 mm di adenosina trifosfato, Guanosintrifosfato, Citosintrifosfato, e uridina trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP)
Acqua priva di nucleasi
10X Reaction (Buffer 1x Reaction: 40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl 2, spermidina mm 2, ditiotreitolo 10 mM, pH 7,9) Buffer
Linearizzato DNA template (0,5 mg / ml, 1,85 kb)
RNA polimerasi enzimatica (20 U / ml)

Tabella 1. Elenco dei reagenti congelati.

Per iniziare le reazioni di trascrizione, aggiungere la seguente quantità di ogni reagente in 0,2 ml tubi PCR a pareti sottili:
2 plSoluzione di ATP (75 mm)
Soluzione CTP 2 pl (75 mm)
Soluzione GTP 2 pl (75 mm)
Soluzione UTP 2 pl (75 mm)
1 di acqua priva di nucleasi microlitri
2 microlitri 10X Reaction Buffer
2 ml di 0,5 mg / mL DNA template lineari
5 ml complesso (acqua priva di nucleo come il vuoto, actinomicina D, triptolide, tpfc, Ga (tpfc))
2 ml di RNA polimerasi (20 U / ml)

Tabella 2. Elenco dei reagenti per la reazione di trascrizione.

Time Point (h) Complesso A 260 A 280 </ Strong> A 260 / A 280 Fattore di diluizione [RNA]: A 260
(Mg / ml) 		[RNA] (mg / ml)
4 Controllo 7,583 3.516 2.16 200 40 60.67
4 Actinomicina D 0,955 0,438 2.18 200 40 7,638
4 triptolide 1.794 0,816 2.2 200 40 14.35
4 tpfc 7,858 3,631 2.16 200 40 62.87
4 Ga (tpfc) 0.554 0,232 2.39 200 40 4,434

Tabella 3. Concentrazione e purezza dell'RNA trascritto dopo 4 ore misurata mediante spettroscopia UV-Vis. Il coefficiente di estinzione di RNA a singolo filamento è 0,025 (mg / ml) -1 cm -1, una lettura di 1,0 A 260 è equivalente a circa 40 ug / ml di RNA e l'RNA pura ha un A 260 / A 280 Rapporto di 2.1. 45

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Discussion

Questo test dimostra che l'aggiunta di Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell'RNA paragonabile alle note che legano il DNA complessi antitumorali Actinomicina D e Triptolide. Il comportamento citotossica di Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 micron) possono grazie alle sue proprietà anticorrosione. Poiché nessuna inibizione della trascrizione è stata osservata nel tpfc, la citotossicità di tpfc non è dovuta alla trascrizione dell'RNA inibizione ma è causata da altri mezzi non ancora studiati.

Nei quattro reazioni di trascrizione eseguite, il DNA è stato trattato con actinomicina D, triptolide, tpfc o Ga (tpfc), a [complesso]: [modello base DNA] rapporto di 0,01, rispettivamente, o un controllo non trattato. I reagenti reazione di trascrizione sono stati combinati e la reazione di trascrizione è stato permesso di proseguire per 4 ore a 37 ° C. L'RNA trascritto è stato purificato attraverso una colonna di spin RNA e la resa analizzati mediante elettroforesi su gel UV-Vis e. La natura di inibizione di trascrizione può essere Furtla studiata utilizzando la stessa tecnica con varie modifiche, oi composti possono essere sottoposti a alternative in vitro ed in vivo. Ulteriori esperimenti che possono contribuire a determinare la natura molecolare di inibizione comprendono cristallografia a raggi X di possibili addotti corrole-DNA o modellazione computazionale della reazione di trascrizione. L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di determinare se i composti inibiscono la trascrizione al fine di raccogliere informazioni sui loro potenziali proprietà antitumorali. Tale obiettivo è stato raggiunto: tpfc esibito alcuna inibizione, mentre Ga (tpfc) esposto inibizione chiara e merita ulteriori studi.

Il dosaggio RNA trascrizione può essere modificato per fornire dettagli più meccanicistica. L'aggiunta di agenti antitumorali (ad esempio, i complessi corrole) dopo la reazione di trascrizione è completa può mostrare che i complessi degradano o idrolizzano l'RNA. Un altro esperimento raccomandata è di condurrela reazione di trascrizione con tutti i componenti, ad eccezione della RNA polimerasi dell'enzima 10 volte inferiori per consentire differenziazione tra un meccanismo di inibizione coinvolge il DNA o l'enzima. Infine, incubazione della DNA polimerasi o con i complessi prima di RNA trascrizione consentirebbe maggiore legame tra il complesso e la rispettiva destinazione, verificare se le qualità inibitive complessi sono coinvolti nel DNA polimerasi o vincolante, rispettivamente.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dott Cindy N. Chiu aiuto per elettroforesi su gel, e Andy Zhou e Michael Grodick per la loro generosa donazione di DNA e di enzima di restrizione. Noi riconosciamo con gratitudine il professor J. Heath e il professor D. Prober per l'accesso generoso attrezzature e materiali. Ringraziamo il Dott Karn Sorasaenee per utili suggerimenti. Ringraziamo Mary H. Tang per creare la figura utilizzata nella panoramica schematica nel video. Il finanziamento è stato fornito da Johnson & Johnson e USC Y86786.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actinomycin D Sigma-Aldrich A1410 Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide Sigma-Aldrich T3652 Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O  Life Technologies AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit Life Technologies AM1334 Store at –20 °C 
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate Sigma-Aldrich T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich EDS
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-100
mini Quick Spin RNA Columns Roche Life Science 11814427001 Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S Store at –20 °C 

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References

  1. American Cancer Society. , American Cancer Society. Atlanta. Available from: http://www.cancer.org (2014).
  2. Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
  3. Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
  4. Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
  5. Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
  6. Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
  7. Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
  8. Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
  9. Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
  10. Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
  11. Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
  12. Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  13. Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
  14. Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
  15. Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
  16. Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
  17. Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
  18. Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
  19. Sorasaenee, K., Fu, P. K. -L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
  20. Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
  21. Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
  22. Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
  23. Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
  24. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
  25. Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
  26. Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
  27. Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
  28. Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
  29. Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
  30. Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
  31. Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
  32. Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
  33. Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
  34. Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
  35. Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
  36. Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
  37. Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
  38. Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
  39. Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
  40. Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
  41. MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , Life Technologies. Carlsbad. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/1330M_G.pdf (2014).
  42. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
  43. Quick Spin Columns Protocol. , Roche Diagnostics GmbH. Mannheim. Available from: https://pim-eservices.roche.com/LifeScience/Document/95c2b1f8-7cf1-e311-98a1-00215a9b0ba8 (2013).
  44. RNA quality control. , KU Leuven: Biomedical Genomics. Leuven. Available from: http://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html (2007).
  45. Sabris, R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , Wiley. Hoboken, NJ. (2010).

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Bioingegneria Corrole RNA la trascrizione l'inibizione anti-cancro il DNA legame Actinomicina D triptolide
Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles
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Tang, G. Y., Pribisko, M. A.,… More

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