Summary
ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر.
Abstract
يبقى إنتاج بروتينات الغشاء المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية تحديا تقنيا بسبب انخفاض مستويات التعبير وعدم الاستقرار المتأصل في العديد من البروتينات الغشاء يذوب مرة واحدة في المنظفات. ووصف البروتوكول الذي يجمع بين ربط الاستنساخ مستقلة عن بروتينات الغشاء كما اندماج مع GFP التعبير في الإشريكية القولونية الكشف عنها بواسطة GFP مضان. وهذا يتيح للبناء والتعبير فحص متعددة بروتين الغشاء / المتغيرات لتحديد المرشحين المناسبين لمزيد من الاستثمار من الوقت والجهد. يستخدم مراسل GFP في الشاشة الرئيسية التعبير من خلال وضع تصور GFP مضان التالية SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). بروتينات غشاء التي تظهر سواء على مستوى التعبير عالية مع الحد الأدنى من التدهور كما يدل على ذلك عدم وجود GFP مجانا ويتم اختيار، على شاشة الثانوية. يتم تحجيم هذه التركيبات ومجموع جزء الغشاء إعداد وذوباند في أربعة المنظفات المختلفة. وبعد تنبيذ فائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان، المنظفات، ويتم تحليل لست] من خلال الكشف مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC). رصد الملف الشخصي حجم الإقصاء من قبل GFP مضان يوفر معلومات حول أحادية التبعثر وسلامة بروتينات الغشاء في المنظفات المختلفة. البروتين: تركيبات المنظفات التي أزل مع ذروة متناظرة مع ضئيلة أو معدومة مجانا GFP والحد الأدنى التجميع هي المرشحين لتنقية اللاحقة. باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه، والتعبير مغاير في E. تم تحليل القولونية من SED (الشكل، استطالة، وتقسيم، وتبوغ) البروتينات من 47 نوع مختلف من البكتيريا. يكون لهذه البروتينات عادة عشرة المجالات عبر الغشاء وضرورية لانقسام الخلايا. وتظهر النتائج أن إنتاج orthologues عنيزة في E. كان القولونية اختلافا كبيرا فيما يتعلق مستويات التعبير وسلامة البروتينات GFP الانصهار. ط التجربةdentified مجموعة فرعية لمزيد من التحقيق.
Introduction
وتشير التقديرات إلى أن البروتينات الغشاء تمثل حوالي 20-30٪ من الجينات المشفرة في جميع الجينوم التسلسل 1، بما في ذلك الجينوم البشري (2). نظرا لدوره الحاسم في العديد من العمليات البيولوجية، لنقل مثلا من نواتج الأيض، وتوليد الطاقة وكأهداف المخدرات، وهناك اهتمام كبير في تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد الخاصة بهم. ومع ذلك بالمقارنة مع البروتينات القابلة للذوبان، والبروتينات الغشاء هي غاية ممثلة تمثيلا ناقصا في بنك معلومات البروتين. في الواقع، من 99624 الهياكل صدر في PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) فقط 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ تصنف)، والبروتينات الغشاء. وهذا يعكس الصعوبات التقنية في العمل مع بروتينات غشاء التي يتم التعبير عنها بشكل طبيعي في مستويات منخفضة نسبيا؛ رودوبسين هي واحدة من عدد قليل من الاستثناءات 3،4. وعلى مدى التعبير عن النسخة المؤتلف الصورة في الخلايا مغاير غالبا ما يؤدي إلى misfolding والفقراء استهداف لغشاء مما يحد من المستوى العام للإنتاج. اختيار أفضل المنظفات لاستخراج والإذابة من بروتين الغشاء مرة واحدة وأعرب يجعل تنقية اللاحقة صعبة وتتطلب التحسين دقيق.
لا تزال القولونية المضيف التعبير الأكثر استخداما للبروتينات غشاء يمثل 72٪ ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) هياكل حلها حتى الآن والتي هي على وجه الحصر تقريبا من مصادر بكتيرية. E. محدد سلالات القولونية، C41 (DE3) وC43 (DE3)، وقد تم عزل التي لا تؤدي إلى الإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء، وبالتالي تجنب آثار سمية لوحظ لBL21 آخر سلالات 5،6. ضبط مستوى المؤتلف التعبير البروتين غشاء يبدو أن تكون حاسمة لتحسين مستوى الإنتاج 6،7.
"jove_content"> وفي كثير من الحالات قد يتطلب إنتاج الناجح للبروتينات الغشاء لتحديد هيكل تقييم إصدارات متعددة بما في ذلك جذر الأمينو والحذف-كربوكسي المحطة، orthologues متعددة لاستغلال الاختلاف التسلسل الطبيعي والبروتينات الانصهار المختلفة 6-8. لذلك، وهي طريقة لفحص التعبير عن بروتينات الغشاء متعددة في نفس الوقت أمر ضروري. واحد النهج المتبع عادة هو صهر البروتين لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) التعبير تمكين لتعقبها دون الحاجة لتنقية البروتين. وبهذه الطريقة، معلومات عن مستوى التعبير والاستقرار والسلوك في المنظفات المختلفة يمكن تقييمها مع كميات صغيرة من المواد النقية الامم المتحدة 9-12.
في هذه المقالة وصفنا بروتوكول مبسط للاستنساخ والتعبير فحص بروتينات الغشاء في E. القولونية باستخدام الانصهار لGFP كمراسلة الإنتاج وتوصيف لاحق من المنظفات: البروتين شركاتLEXES (الشكل 1).
Protocol
1. بناء ناقلات التعبير
- استخدام PCR تسريب استنساخ لبناء ما يصل الى 96 البلازميدات التعبير بالتوازي باستخدام ناقلات pOPINE-3C-GFP وشبكة المعلومات السكانية-N-GFP التي تضيف إما شطورة اندماج GFP-His6 C-الطرفية أو N-محطة لتسلسل 13 على التوالي.
ملاحظة: يتم تمليها اختيار ناقل من قبل طوبولوجيا من البروتين منذ GFP يحتاج إلى أن تتجلى في العصارة الخلوية، وبالتالي لبروتين مع عصاري خلوي N-محطة وخارج الخلية C-محطة سوف نستخدم شبكة المعلومات السكانية-N-GFP ولل وخارج الخلية N-محطة وعصاري خلوي C-محطة في أننا سوف تستخدم pOPINE-3C-GFP. على حد سواء حيث مصطلحات هي عصاري خلوي سوف نستخدم pOPINE-3C-GFP ما لم يكن هناك سبب وظيفي لا لوضع علامة على C-محطة. - تضخيم تسلسل الحمض النووي ترميز البروتينات الغشاء مع الاشعال دمج الملحقات التالية هو مبين:
pOPINE-3C-GFP (التمهيدي إلى الأمام - AGGAGATATACCATG، إستعادة التمهيدي - CAGAACTTCCAGTTT) وشبكة المعلومات السكانية-N-GFP (التمهيدي إلى الأمام - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG، عكس التمهيدي - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). - تحليل PCR رد فعل من قبل الاغاروز الكهربائي للهلام. مرة واحدة وقد تم الحصول على المنتجات PCR نظيفة، وإضافة 5 U DpnI إلى كل بئر (يشكلون في 5 ميكرولتر من 1X DpnI عازلة رد فعل). تنقية المنتجات PCR باستخدام حبات مغناطيسية في شكل 96-جيدا.
ملاحظة: يضاف DpnI لإزالة قالب النواقل؛ هذه الخطوة غير ضرورية إذا تم استخدام الحمض النووي الجيني كقالب. - إضافة 1 ميكرولتر (100 نانوغرام) من ناقلات خطي المناسبة لكل بئر من لوحة PCR.
- باستخدام pipettor الأقنية إضافة X ميكرولتر من المنقى PCR تضاف إلى آبار المناسبة من لوحة PCR. التأكد من أن جميع المنتجات هي في حدود 10-250 نانوغرام.
- إضافة (9-X) ميكرولتر من الماء إلى البئر ونقل كلها 10 ميكرولتر إلى أنبوب يحتوي على الجاف إلى أسفل كاشف في الانصهار. يترك لمدة 30 ثانية.
- خلط محتويات لفترة وجيزة قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقلردود الفعل إلى لوحة PCR الأصلية والختم.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في 42 ° C في thermocycler.
- نقل على الفور ردود الفعل على الجليد في أقرب وقت رد الفعل كاملة وإضافة 40 ميكرولتر من TE (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA).
- تجميد دفعة واحدة أو تتحول إلى خلايا المختصة. للتحول، استخدم 3 ميكرولتر من رد الفعل المخفف لكل 50 ميكرولتر قسامة من الكفاءة عالية (> 5 × 10 9 transformants / ميكروغرام) المختص E. خلايا القولونية.
- إضافة 1 مل من LB أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين لكل بئر من 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (للاستنساخ، وإعداد الآبار لل2 × عدد من يبني).
- التالية ثمرة، وبعد لوحة ثمرة من 25 ميكرولتر و 25 ميكرولتر من 1 في 5 التخفيف من الثقافة على أجار التي تحتوي على 24-جيدا لوحات زراعة الأنسجة.
- تنتشر الخلايا عن طريق إمالة بلطف لوحة.
- تجف لوحة مع الغطاء لمدة 10-15 دقيقة عند 37 ° C أو في فلوغطاء ث في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال الغطاء وتحويل لوحة رأسا على عقب واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- اختيار اثنين من المستعمرات ومصغرة الإعدادية ناقلات.
- PCR التحقق من بنيات باستخدام بناء التمهيدي العكس معين والتمهيدي إلى الأمام محدد ناقلات (على سبيل المثال pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).
2. التحول من E. القولونية E سلالات xpression
ملاحظة: قبل أداء هذا البروتوكول، E. مصنوعة الخلايا المختصة القولونية، aliquotted وتخزينها في المجمد -80 ° C كما هو موضح سابقا (13). يتم فحص البروتين غشاء التعبير بشكل روتيني في سلالتين، Lemo21 (DE3) وC41 (DE3) pLysS. للمساعدة تفسير النتائج التي يمكن أن تكون مفيدة لتشمل مراقبة إيجابية، على سبيل المثال البلازميد معربا عن GFP أو بروتين الغشاء تنصهر إلى GFP المعروفة للتعبير عن والسيطرة السلبية ناقلات الفارغة.
- ذوبان الجليد علي quotted E. القولونية على الجليد. إضافة 3 ميكرولتر من-هيأهم مصغرة التعبير البلازميد كل قسامة من الخلايا المختصة.
- احتضان هذا المزيج على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- للحرارة صدمة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية.
- تسمح للخلايا للتعافي على الجليد لمدة 2 دقيقة ثم قم بإضافة 300 ميكرولتر من مرق السلطة لكل أنبوب.
- احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية.
- إعداد LB أجار في 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة، على أن تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و 35 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. إضافة رامنوز إلى تركيز النهائي من 0.25 ملم إلى الآبار التي تحتوي على Lemo21 (DE3).
ملاحظة: إذا كان المنتج هو من المحتمل أن تكون سامة الآبار التي تحتوي على C41 (DE3) pLysS يمكن أن تستكمل مع 1٪ (ث / ت) الجلوكوز. - نقل 30 ميكرولتر من الخلايا من مزيج التحول على لوحات LB أجار. نشر وتجفيف اللوحة كما هو موضح في 1،13-1،15.
3. التحضير للثقافات كاتب ليلة وضحاها
= "jove_content"> ملاحظة: إعداد دائما الثقافات بين عشية وضحاها في اليوم التالي تحول أبدا من لوحة التحول القديمة.
- إضافة مرق 0.7 مل القدرة على كل بئر من لوحة 96-بئر عميقة جيدا تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و 35 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. إضافة رامنوز إلى الآبار التي تحتوي على Lemo21 (DE3) إلى تركيز النهائي من 0.25 ملم. اختياريا، تكملة C41 (DE3) pLysS مع 1٪ (ث / ت) الجلوكوز. انظر أعلاه (2.6 المذكرة).
- اختيار مستعمرة واحدة من لوحات تحول بين عشية وضحاها في كل بئر. ختم كتلة مع ختم المنفذة للغازات.
- يهز كتلة في 250 دورة في الدقيقة في حاضنة برمية كبير (مثل 25 مم المدار) أو في 600 دورة في الدقيقة في حاضنة برمية صغير (مثل 4.3 ملم مدار) عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
4. النمو وتحريض الثقافات
- إضافة 3 مل من مرق السلطة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و 35 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول لكل ثالذراع من 24 جيدا لوحة من الآبار العميقة. إضافة L-رامنوز (والجلوكوز) كما هو موضح في القسم 3.1. استخدام 3 مل من الثقافة للسماح للحصاد في نسختين والسماح لبعض تبخر المياه من خلال ختم نفاذية الغاز.
- إعداد الثقافات التعبير من خلال إضافة 150 ميكرولتر من Lemo21 (DE3) أو C41 (DE3) pLysS الثقافات بين عشية وضحاها إلى كل بئر من 24-جيدا الكتل العميقة أيضا.
- هز كتل عند 37 درجة مئوية حتى متوسط OD في 595 نانومتر هو ~ 0.5 من خلال لوحة.
- حمل التعبير بإضافة IPTG على ثقافات إلى تركيز النهائي من 1.0 ملي IPTG.
- تنمو الثقافات بين عشية وضحاها (18-20 ساعة) مع اهتزاز عند 20 درجة مئوية.
5. تحليل التعبير من قبل في جل الإسفار
- الحصاد في مكررة. نقل 1 مل من الثقافة من كل بئر في بئر مربع، أسفل المخروطية، 96-جيدا كتلة العميقة جيدا.
ملاحظة: الحصاد في نسختين في حالة الكسر من كتلة أو السماح للاختبار والتدقيقلقد المنظفات اذا شئت. - ختم الكتل وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 6،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- عكس كتلة وصب وسائل الإعلام. اضغط على كتلة بلطف على منشفة ورقية لتجفيف وسائل الاعلام المتبقية.
- ختم لوحات وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 20 دقيقة. اختياريا، وترك التجربة في هذه النقطة، وكتلة معالجة عند مريحة.
- دي الصقيع الكريات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام إما ماصة متعدد القنوات أو شاكر المداري (1،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة) في 4 ° C إلى resuspend الخلايا تماما في 200 ميكرولتر من تحلل العازلة (50 ملي ناه 2 PO 4، 300 مم كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول 1٪ ضد / ت توين 20، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم).
- إضافة 20 ميكرولتر من الحل DLPI (20 ميكرولتر DNaseI (4،000 وحدة / مل)، و 20 ملغ الليزوزيم، و 20 ميكرولتر مثبط البروتياز الكوكتيل في الحجم النهائي من 2 مل من الماء). احتضان لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز (~ 1،000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
- احتضان لمدة 60 دقيقة مع اهتزاز (~ 1،000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي كتلة العميقة جيدا في 6،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل 10 ميكرولتر من المحللة تطهيرها إلى لوحة التلازن وإضافة 10 ميكرولتر من SDS عازلة هلام PAGE تحميل (100 ملي تريس، ودرجة الحموضة 6.8، 4٪ ث / ت SDS، 0.2٪ ث / ت برموفينول الأزرق، و 10٪ ت / ت β -mercaptoethanol، و 20٪ ت / ت الجلسرين). تنبيه! لا تغلي العينة.
- تحميل 10 ميكرولتر من عينة من الخطوة 5.11 / جيد على SDS هلام PAGE (ق) وتعمل في 100-120 V (الجهد المستمر) في غرفة باردة حتى تصل الجبهة صبغ أسفل (2-2.5 ساعة).
- وضع الجل على لتصوير (على سبيل المثال مع فلتر الأزرق الضوء للكشف عن البروتينات GFP الانصهار). يتم اختيار وقت التعرض للتأكد من أن ألمع العصابات لا المشبعة.
6. مقياس المتابعة من الثقافات خلية
- تحويل قسامة من الكفاءة
- اختيار مستعمرة إلى 10 مل من مرق السلطة (تستكمل كما هو موضح في القسم 3) وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تمييع 5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 500 مل مرق السلطة.
- تنمو مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية حتى OD في 595 نانومتر هو ~ 0.5.
- حمل التعبير بإضافة IPTG إلى تركيز النهائي من 1.0 ملم.
- تنمو بين عشية وضحاها مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية.
- خلايا الحصاد بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
- طاف تجاهل. ويمكن تخزين كريات خلية في -80 ° C.
7. إعداد الأغشية
- خلايا ذوبان الجليد (إذا لزم الأمر) في درجة حرارة الغرفة وresuspend في برنامج تلفزيوني 1X 7.5 درجة الحموضة في حجم 5ML في كل غرام من بيليه الخلية؛ زيادة حجم حسب الضرورة حتى يقلل اللزوجة إلى الاتساق سيلان. إضافة MgCl 2 إلى تركيز النهائي من 1 ملم، أنا الدناز إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل واحدالمعبأة مسبقا البروتيني قرص المانع لكل 20 غراما من بيليه الخلية. كسر خلايا مفتوحة باستخدام ديسروبتر خلية المبردة عند ضغط 30 kpsi.
- بيليه الخلايا غير منقطعة والحطام في 30،000 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل طاف لأنبوب الطرد المركزي البنفسجية.
- جمع مجموع جزء الغشاء من قبل الغزل أسفل طاف في أجهزة الطرد المركزي-المتطرف في 200،000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف.
- اعادة تعليق بيليه الغشاء في الجليد الباردة 10 مل PBS درجة الحموضة 7.5 باستخدام الخالط الخلية. ويلزم 1 مل معلق الأغشية لكل المنظفات. اختياريا، في هذه المرحلة، فلاش تجميد تعليق الغشاء في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C.
8. الإذابة وتحليل الكسر غشاء
- جزء الغشاء ذوبان الجليد (إذا لزم الأمر)، ولكل المنظفات التي تستخدم في إذابة، قسامة 900 ميكرولتر من تعليق الغشاء إلى 1.5 مل polyallomer centrifu الصغيرةجنرال الكتريك الأنبوب.
- إضافة 100 ميكرولتر من كل المنظفات الطازجة (10٪ ث / حلول v من DDM، DM، Cymal-6 وLDAO) إلى تركيز النهائي من 1٪ إلى المحدد أنبوب 1.5 مل. للذوبان في حقيقية النواة البروتينات الغشاء الكولسترول hemisuccinate (0.2٪ تركيز النهائي) ويمكن أن يضاف إلى المنظفات.
- احتضان مخاليط عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الإثارة معتدل.
- بيليه جزء غير قابلة للذوبان المنظفات مع مقعد كبار فائقة الطرد المركزي، وأنابيب ضمان هي على الأقل نصف كاملة، في 150،000 غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة والاحتفاظ طاف.
ملاحظة: يمكن تقدير فعالية المنظفات الإذابة باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت من خلال قياس مضان GFP الأغشية تذوب مع جزء غير قابلة للذوبان المنظفات معلق في نفس الحجم من برنامج تلفزيوني. - تحليل أحادية التبعثر من المنظفات مختلفة: مجمعات البروتين غشاء باستخدام-الكشف عن مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC).
- لتحليل FSEC، تتوازن عمود حجم الإقصاء مع مجموعة التجزئة واسع، على سبيل المثال 5،000 إلى 5،000،000 في الوزن الجزيئي، مع تشغيل العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.03٪ DDM) بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة . استخدام هذا المخزن المؤقت لجميع العينات، أي لا يتم تغييره لكل المنظفات التي تم اختبارها.
- ضخ 100 ميكرولتر من الأغشية يذوب على العمود بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة. مراقبة الشخصي شطف باستخدام البصريات مضان (الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 512 نانومتر). إذا شاشة مضمنة مضان غير متوفر، وجمع الكسور وقراءة مضان في قارئ لوحة.
- استيراد حجم شطف والبيانات كثافة مضان في برنامج جدول بيانات للعرض رسومية.
- تحليل المواد المتبقية غشاء بالفاعلات مضان في جل كما هو موضح في القسم 5.
Representative Results
الأسرة عنيزة من البروتينات (الشكل، واستطالة، وتقسيم، وتبوغ) ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. يكون لهذه البروتينات لا يتجزأ عادة عشرة المجالات عبر الغشاء مع كل الأمينية وكربوكسي مصطلحات داخل الخلية. لتجسيد بروتوكول المذكورة أعلاه، تم استنساخ 47 عنيزة orthologues في ناقلات pOPINE-3C-EGFP. وأجري الشاشة الصغيرة التعبير حجم يبني في اثنين E سلالات .coli، Lemo21 (DE3) نمت في وجود 0.25 ملي رامنوز لمنع التعبير المتسرب وC41 (DE3) pLysS، والتي تستخدم بشكل روتيني للتعبير عن غشاء البروتينات 5-8.
وقد تم تحليل المنظفات تذوب لست] من الثقافات التي تحدثها الكهربائي SDS-بولكرلميد. باستخدام مضان في جل لتصور أظهرت أعرب GFP البروتينات الانصهار التي تم إنتاجها بين سلالتين 38 من عنيزة يبني 47. ومن المثير للاهتمام كانت هناك اختلافات بين سلالات التعبير اثنين. من 38 أعرب يبني، أنتجت فقط 18 في كل من السلالات، وأعرب 14 فقط في Lemo21 (DE3) و 6 فقط في C41 (DE3) pLysS. وعموما، كان هناك نسبة نجاح أعلى للLemo21 (DE3) مقارنة C41 (DE3) pLysS (38 مقابل 24). ومع ملاحظة أن ظهرت بعض البروتينات لتكون سلالة معينة تعني أن الفرز في كل أمر مفيد.
وأظهرت بيانات تمثيلية لل24 من 47 عنيزة يبني في الشكل 1. وكثافة من عصابات يعطي مؤشرا لمستوى التعبير، مثل البروتين الانصهار في C4 جيدا في الشكل 1A و 1B يتم التعبير بشكل جيد في كل سلالات إلا أن إضافية وتشير أقل العصابات الوزن الجزيئي أن البروتين هو المتدهورة جزئيا. في العديد من الممرات وجود الفرقة والتي تتطابق في الحجم إلى GFP وحده. ويمكن إجراء تقييم نوعي لسلامة البروتين من خلال النظر في كثافة البروتين الانصهار نسبة إلى GFP الحرة؛على سبيل المثال G4 وH4 وانهارت تماما لGFP الحرة في C41 (DE3) pLysS (الشكل 1B) في حين أنه في Lemo21 (DE3) هناك بعض سليمة البروتين (الشكل 1A). 14 من أصل 38 البروتينات أعرب عن شدة الفرقة GFP الحرة هي مماثلة لتلك التي من البروتين الانصهار، لمدة 21 شدة الفرقة GFP الحر أكبر من أن البروتين الانصهار وأقلية من البروتينات الانصهار (3 / 38 أعرب) على سبيل المثال F6 وG6 في الشكل 1A يكون قليل نسبيا GFP الحرة مقارنة مع البروتين الانصهار.
اثنين من التركيبات التي أعرب جيدا في B5 الشاشة الابتدائي (العصابات كثافة عالية لGFP الحر والبروتينات الانصهار) وG6 (قليلا الحرة GFP) وأعرب عن ومجموع جزء غشاء المعدة من 500 مل ثقافة الخلية. تم تقسيم الأغشية معلق إلى مأخوذة وتحليلها بواسطة-الكشف عن مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC). وقدم لمحات FSEC في شملت رقمالبريد 2A و 2B على التوالي، وتبين أن اثنين عنيزة البروتينات تتصرف بشكل مختلف في المنظفات أربعة اختبارها. في حالة واحدة (الشكل 2A: عينة B5) البروتين أعطى فقط ذروة متناظرة مع تجميع يذكر في DDM الذي من شأنه بالتالي أن يكون المنظفات المفضل لتنقية اللاحقة. على النقيض من ذلك الآخر انصهار بروتين (الشكل 2B: عينة G6) أعطى صورة مماثلة في كافة المنظفات التي تم اختبارها.
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل لفحص غشاء البروتين التعبير في E. القولونية باستخدام مراسل GFP.
الشكل 2: شاشة الرئيسي للبروتين الغشاء التعبير باستخدام مضان في جل. E. خلايا القولونية تم تحليلها بواسطة SDS-PAGE والمواد الهلامية تصوير تستخدم برنامج التحصين الموسع الأزرق الإضاءة و530/28 مرشح. وأظهرت نتائج 24 يبني (المسمى A4-H6 على أساس وضعهم في لوحة 96-جيدا). يشار إلى مواقف العصابات لGFP مجاني وGFP البروتينات الانصهار. (A) والبروتينات التي أعرب عنها في Lemo21 (DE3). (ب) البروتينات التي أعرب عنها في C41 (DE3) pLysS.
الرقم 3: الشاشة الثانوية من غشاء البروتين التعبير باستخدام-الكشف عن الإسفار استبعاد حجم اللوني (FSEC) تم استخراج مجموع الكسور الغشاء في أربعة المنظفات المختلفة وبروتينات الغشاء تذوب تحليلها بواسطة استبعاد حجم اللوني باستخدام نظام FPLC بالإضافة إلى جهاز الكشف عن مضان. لمحات FSEC ل(A) بروتين الغشاء B5 و (ب)
Discussion
في بروتوكول الموضحة في هذه المقالة، يتم الجمع بين ربط الاستنساخ مستقل في ناقلات مراسل GFP مع الكشف عن مضان للكشف بسرعة التعبير النسبي للبروتينات الغشاء متعددة في E. القولونية. ناقلات ويمكن إجراء في أربعة أيام عمل مع الفحص التعبير الأساسي تتخذ أسبوع آخر. في جل يستخدم مضان لست] المنظفات الخلايا بأكملها إلى رتبة التعبير يضرب لمزيد من التحليل في الشاشة الثانوية. الشاشة التعبير الأساسية كما وردت لا يتطلب أي معدات متخصصة وبصرف النظر عن حاضنة شاكر مناسبة للخلايا تنمو في كتل بئر عميقة. جميع مناولة السائل الآخر تنطوي 96-جيدا لوحات SBS يمكن القيام بها باستخدام الماصات متعدد القنوات. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لتشمل سلالات القولونية E. أخرى نمت في ظل ظروف التعبير المختلفة (مثل انخفاض درجة الحرارة). في حالة LEMO21 (DE3) المعايرة مستوى رامنوز (0-2،0 ملم)وأضاف لتعديل معدل النسخ يمكن أن تزيد من مستوى التعبير عن بعض البروتينات الغشاء 7. المنظفات الأخرى من DDM يمكن أن تستخدم لاستخراج في الشاشة الرئيسية على الرغم من المنظفات أقسى قد ذوبان البروتينات من الهيئات إدراج وبالتالي تعطي ايجابيات كاذبة. ومن الواضح أن أكثر وضع تصبح الشاشة الأولي، والمزيد من التجربة تستغرق وقتا طويلا.
ينطوي على الشاشة الثانوية إعداد إجمالي جزء من الغشاء يضرب التعبير المحددة في الشاشة الرئيسية. هذا هو خطوة حاسمة لأنها سوف تأكيد توطين البروتينات الانصهار إلى غشاء من E. خلايا القولونية. ويتم رصد استخراج احق من البروتين GFP الانصهار في المنظفات مختلفة كل مضان الكشف عن حجم الإقصاء اللوني من المواد تذوب لتقييم أحادية التبعثر من المجمعات المنظفات البروتين. هذا هو خطوة حاسمة أخرى نظرا لأنه يحدد المنظفات الأنسب لذوبانية البروتين غشاء لالتجهيز النهائي لاحق. ومع ذلك، تبين التجربة أن المزيد من التحسين من اختيار المنظفات (ق) قد لا تزال هناك حاجة خلال تنقية والتبلور. دليل السلوك موحد في المنظفات المختلفة بما في ذلك تلك التي تحتوي على حجم مذيلة صغير نسبيا (على سبيل المثال LDAO) ويبدو أن مؤشر جيد على الميل لتشكيل جيدا الانعراج بلورات على الأقل للبروتينات غشاء أولية النواة 14. وفي هذا الصدد الشخصى تعرض لبروتين الغشاء في الشكل 2B يبدو مواتية للغاية.
والميزة الرئيسية لاستخدام مراسل GFP هو أنه يعطي قراءة التدريجي السريع التعبير في عينات تنقيته الامم المتحدة. والعيب هو أن البروتين GFP الانصهار لابد من إزالتها خلال عملية تنقية البروتين لبلورة. في حالة ناقلات المستخدمة هنا، وهو موقع البروتيني فيروسات الانف 3C تمكن الانقسام من GFP. بدلا من ذلك، فإنه واضح ومباشرلإعادة استنساخ البروتينات مرشح، التي تم تحديدها في الشاشة، إلى ناقلات التي تضيف فقط polyhistidine أو غيرها من العلامة تقارب لتنقية اللاحقة. وهذا يفترض أن الاندماج لGFP ليس من الضروري للتعبير. البديل الرئيسي لاستخدام الانصهار لGFP للكشف عن التعبير بروتين الغشاء والإذابة هو فقط إضافة علامة الحامض الاميني. ولكن هذا النهج يتطلب عادة بدءا من جزء غشاء 15 التي لتقييم العديد من المتغيرات سيصبح جدا تستغرق وقتا طويلا.
وباختصار، فإن الغرض الرئيسي من بروتوكول الموضحة في هذه المقالة هو تمكين عدد كبير من تسلسل البروتين غشاء المتغيرات التي سيتم تقييمها بسرعة من حيث التعبير والمنظفات الإذابة والأولوية لتحليل أعمق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
| LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
| In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
| Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
| CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
| DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
| DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
| LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
| E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
| Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
| Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
| Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
| 24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
| XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
| Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
| Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
| ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
| Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
| Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
| Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
| Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
| TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
References
- Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).
- Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
- Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
- Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).
