Summary
En strømlinet tilgang til screening for ekspression af rekombinante membranproteiner i Escherichia coli baseret på fusion til grønt fluorescerende protein præsenteres.
Abstract
Produktionen af rekombinante membranproteiner til strukturelle og funktionelle undersøgelser er stadig teknisk udfordrende på grund af lave niveauer af udtryk og den iboende ustabilitet i mange membranproteiner engang opløst i vaske- og rengøringsmidler. En protokol er beskrevet, der kombinerer ligering uafhængig kloning af membranproteiner som GFP-fusioner med ekspression i Escherichia coli påvist ved GFP-fluorescens. Dette gør det muligt konstruktion og udtryk screening af membranprotein flere / varianter at identificere kandidater, der er egnede til yderligere investering af tid og kræfter. GFP reporter anvendes i en primær screening af ekspression ved at visualisere GFP-fluorescens efter SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Membranproteiner, der viser både et højt ekspressionsniveau med minimum nedbrydning som angivet ved fraværet af frit GFP, er udvalgt til en sekundær skærm. Disse konstruktioner er skaleret og en fraktion total membran fremstillet og solubilisered i fire forskellige rengøringsmidler. Efter ultracentrifugering for at fjerne detergent-uopløseligt materiale, der lysater analyseredes ved fluorescens detektion gelpermeationskromatografi (FSEC). Overvågning af størrelsen udelukkelse profil ved GFP-fluorescens giver oplysninger om mono-dispersitet og integriteten af de membranproteiner i forskellige rengøringsmidler. Protein: vaskemiddel kombinationer, elueres med en symmetrisk top med ringe eller ingen gratis GFP og minimum sammenlægning er kandidater til efterfølgende rensning. Ved hjælp af denne metode, den heterolog ekspression i E. coli af SED (form, forlængelse, division, og sporulation) proteiner fra 47 forskellige arter af bakterier blev analyseret. Disse proteiner har typisk ti transmembrandomæner og er afgørende for celledeling. Resultaterne viser, at produktionen af SEDS orthologer i E. coli var meget variable med hensyn til ekspressionsniveauer og integriteten af de GFP fusionsproteiner. Forsøget identified en delmængde for yderligere undersøgelser.
Introduction
Det er blevet anslået, at membranproteiner udgør ca. 20-30% af generne kodet i alle sekventerede genomer 1, herunder det humane genom 2. I betragtning af deres afgørende rolle i mange biologiske processer, fx transport af metabolitter, energiproduktion og som lægemiddelvirkninger, der er intens interesse i fastlæggelsen af deres tredimensionelle struktur. Men i forhold til opløselige proteiner, membranproteiner er meget underrepræsenteret i Protein Data Bank. Faktisk de 99.624 frigivne strukturer i FBF ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) kun 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ), klassificeres som membranproteiner. Dette afspejler de tekniske vanskeligheder ved at arbejde med membranproteiner, der er naturligt til udtryk på et relativt lavt niveau; rhodopsin er en af de få undtagelser 3,4. Over-ekspression af rekombinant udgaves i heterologe celler resulterer ofte i misfoldning og dårlig målretning til membranen, hvilket begrænser den samlede produktion. At vælge det bedste vaskemiddel til ekstraktion og opløsning af et membranprotein engang udtrykte gør efterfølgende rensning vanskelig og kræver omhyggelig optimering.
Escherichia coli er det mest almindeligt anvendte ekspressionsvært til membranproteiner tegner sig for 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) strukturer løst til dato er næsten udelukkende fra bakterielle kilder. Specifikke E. coli stammer, C41 (DE3) og C43 (DE3), er blevet isoleret, som ikke fører til overekspression af membranproteiner og dermed undgå virkningerne af toksicitet observeret for andre BL21 stammer 5,6. Tuning niveauet af rekombinant membran proteinekspression synes at være kritisk for at optimere produktionsniveauet 6,7.
6-8. Derfor er det nødvendigt med en fremgangsmåde til ekspression screening af flere membranproteiner i parallel. En almindeligt anvendt fremgangsmåde er at fusionere proteinet til grønt fluorescerende protein (GFP), som muliggør ekspression skal spores uden behov for at oprense proteinet. På denne måde kan information om ekspressionsniveau, stabilitet og opførsel i forskellige detergenter vurderes med små mængder af un-oprenset materiale 9-12.
I denne artikel beskriver vi en strømlinet protokol til kloning og ekspression screening af membranproteiner i E. coli ved hjælp af fusion til GFP som en reporter i produktionen og efterfølgende karakterisering af vaskemiddel: protein complexes (figur 1).
Protocol
1. Konstruktion af ekspressionsvektorer
- Anvende PCR Infusion kloning at konstruere op til 96 ekspressionsplasmider parallelt anvendelse af vektorerne pOPINE-3C-GFP og POPIN-N-GFP som tilføjer enten spaltelige C-terminale eller N-terminale GFP-His6 fusioner til sekvenserne henholdsvis 13.
Bemærk: Valget af vektor dikteres af topologien af proteinet, eftersom GFP skal udtrykkes i cytosolen, således for et protein med en cytosolisk N-terminus og ekstracellulære C-terminus vi ville bruge POPIN-N-GFP og en ekstracellulær N-terminus og cytosolisk C-terminus i vi ville bruge pOPINE-3C-GFP. Når begge ender er cytosol ville vi bruge pOPINE-3C-GFP medmindre der er funktionel grund til ikke at mærke C-terminalen. - Forstærke DNA-sekvenser, der koder for membranproteiner med primere, som indeholder de følgende udvidelser vist:
pOPINE-3C-GFP (Forward primer - AGGAGATATACCATG, revers primer - CAGAACTTCCAGTTT) og POPIN-N-GFP (Forward primer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG, revers primer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). - Analyser af PCR-reaktionen ved agarosegelelektroforese. Når ren PCR-produkter er blevet fremstillet, tilsættes 5 U Dpnl til hver brønd (fyldes op i 5 pi 1x Dpnl reaktion buffer). Oprense PCR-produkter under anvendelse af magnetiske perler i en 96-brønds format.
Bemærk: Dpnl tilføjes for at fjerne skabelonen vektor; Dette trin er ikke nødvendigt, hvis genomisk DNA anvendes som template. - Tilsæt 1 pi (100 ng) af passende lineariserede vektor til hver brønd i en PCR-plade.
- Ved hjælp af en multikanal pipette add x pi renset PCR indsætte til de relevante brønde på PCR-plade. Sørg for, at alle produkter er i intervallet 10-250 ng.
- Tilføj (9-X) pi vand til brønden og overføre hele 10 pi til et rør indeholdende det tørre-down in-fusion reagens. Lad i 30 sek.
- Bland indholdet kortvarigt ved pipettering op og ned. Transferreaktionerne tilbage til den oprindelige PCR-plade og segl.
- Inkuber i 30 minutter ved 42 ° C i en thermocycler.
- Umiddelbart overføre reaktioner på is, så snart reaktionen er fuldstændig, og der tilsættes 40 pi TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Frys på én gang eller forvandle kompetente celler. For transformation, bruge 3 pi af den fortyndede reaktion pr 50 pi alikvot af høj kompetence (> 5 x 10 9 transformanter / ug) kompetente E. coli-celler.
- Tilsæt 1 ml LB agar suppleret med 50 ug / ml carbenicillin per brønd i en 24-brønds vævskulturplade (for kloning, forberede brønde i 2 x antal konstruktioner).
- Efter udvækst Efter udvækst plade ud 25 pi og 25 pi af en 1: 5 fortynding af kulturen onto agar indeholdende 24-brønds vævskulturplader.
- Spred cellerne ved langsomt at vippe pladen.
- Tør pladen med låget i 10-15 min ved 37 ° C eller i en flom hætte ved stuetemperatur.
- Sæt låg og dreje pladen på hovedet og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Pick to kolonier og mini-prep vektorerne.
- PCR kontrollere konstruktionerne ved hjælp af konstruktionen specifikke reverse primer og en vektor Specifik fremadrettet primer (f.eks pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).
2. Transformation af E. coli E XPRESSION Stammer
Bemærk: Før udførelse af denne protokol, E. coli kompetente celler fremstilles, aliquotted og opbevaret frosset ved -80 ° C som tidligere beskrevet 13. Membrane proteinekspression rutinemæssigt screenet i to stammer, Lemo21 (DE3) og C41 (DE3) pLysS. For at hjælpe fortolkning af resultaterne kan det være nyttigt at medtage en positiv kontrol, fx et plasmid, der udtrykker GFP eller et membranprotein fusioneret til GFP vides at udtrykke og en tom vektor negativ kontrol.
- Optø aliquotted E. coli på is. Tilsæt 3 pi mini-prepped ekspressionsplasmid til hver alikvot af kompetente celler.
- Inkuber blandingen på is i 30 minutter.
- Varmechok cellerne i 30 sek ved 42 ° C.
- Tillad celler at inddrive på is i 2 minutter og derefter tilsættes 300 pi power bouillon til hvert rør.
- Der inkuberes i 1 time i et 37 ° C statisk inkubator.
- Forbered LB Agar i en 24-brønds vævskulturplade, suppleret med 50 ug / ml carbenicillin og 35 ug / ml chloramphenicol. Tilføj rhamnose til en endelig koncentration på 0,25 mM til brøndene indeholdende Lemo21 (DE3).
Bemærk: Hvis produktet er sandsynligvis er giftigt brøndene indeholdende C41 kan (DE3) pLysS suppleres med 1% (w / v) glucose. - Transfer 30 pi celler fra transformation mix onto LB agarplader. Spred og tør plade som beskrevet i 1,13-1,15.
3. Forberedelse af Overnight starterkulturer
Bemærk: Altid forberede overnatskulturer dagen efter transformation aldrig fra en gammel transformation plade.
- Tilføj 0,7 ml power bouillon til hver brønd i en 96-brønds dybe brønd plade suppleret med 50 ug / ml carbenicillin og 35 pg / ml chloramphenicol. Tilføj rhamnose til brøndene indeholdende Lemo21 (DE3) til en endelig koncentration på 0,25 mM. Eventuelt supplere C41 (DE3) pLysS med 1% (w / v) glucose; se ovenfor (2,6 note).
- Vælg en koloni fra overnight transformation plader i hver brønd. Forsegl blok med en gaspermeabel forsegling.
- Ryst blok ved 250 rpm i en inkubator med en stor indkast (fx en 25 mm kredsløb) eller ved 600 rpm i en inkubator med en lille indkast (fx en 4,3 mm kredsløb) ved 37 ° C natten over.
4. Vækst og induktion af kulturer
- Tilsættes 3 ml magt bouillon suppleret med 50 ug / ml carbenicillin og 35 ug / ml chloramphenicol til hver wEll af 24-brønds dybe brønd plade. Tilføj L-rhamnose (og glukose), som beskrevet i afsnit 3.1. Brug 3 ml kultur for at muliggøre høst i to eksemplarer og for at muliggøre en vis fordampning af vand gennem det gaspermeable forsegling.
- Opsætning udtrykket kulturer ved tilsætning 150 pi Lemo21 (DE3) eller C41 (DE3) pLysS overnatskulturer til hver brønd af 24-brønds dybe brønd blokke.
- Ryst blokkene ved 37 ° C, indtil den gennemsnitlige OD ved 595 nm er ~ 0,5 gennem pladen.
- Inducere ekspression ved tilsætning af IPTG til kulturerne til en slutkoncentration på 1,0 mM IPTG.
- Grow kulturerne natten over (18-20 h) med rystning ved 20 ° C.
5. Analyse af ekspression ved In-gel Fluorescens
- Høst i to eksemplarer. 1 ml af kulturen fra hver brønd i en firkant godt, konisk bund, 96-brønds dybe brønd blok.
Bemærk: Harvest i to eksemplarer i tilfælde af brud på blokken eller til at tillade test af et alternative vaskemiddel hvis det ønskes. - Forsegl blokkene og høste cellerne ved centrifugering ved 6.000 x g i 10 min.
- Vend blokken og dekanteres medierne. Tryk på blokken forsigtigt på et stykke køkkenrulle for at dræne de resterende medier.
- Forsegl pladerne og opbevares ved -80 ° C i mindst 20 min. Eventuelt lade eksperimentet på dette punkt, og blokken behandles, når praktisk.
- Afrimning pellets i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Brug enten en multikanals pipette eller en orbitalryster (1.000 rpm i 10 min) ved 4 ° C for at resuspendere cellerne fuldstændigt i 200 pi lysisbuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCI 10 mM Imidazol 1% v / v Tween 20, pH indstilles til 8,0 under anvendelse af NaOH).
- Der tilsættes 20 ul af DLPI opløsning (20 pi DNasel (4.000 enheder / ml), 20 mg lysozym og 20 pi protease inhibitor cocktail i et slutvolumen på 2 ml vand). Inkuber i 10 minutter med omrystning (~ 1000 rpm) ved 4 ° C.
- Inkuber i 60 minutter med omrystning (~ 1000 rpm) ved 4 ° C.
- Centrifuger dybe brønd blok ved 6.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
- Transfer 10 pi af den klarede lysat til en mikrotiterplade og tilsættes 10 pi SDS-PAGE-gel loading buffer (100 mM Tris, pH 6,8, 4% w / v SDS, 0,2% vægt / volumen bromphenolblåt, 10% v / v β mercaptoethanol og 20% v / v glycerol). ADVARSEL! Ikke koge prøven.
- Load 10 pi prøve fra trin 5.11 / brønd på SDS PAGE gel (r) og kørt ved 100-120 V (konstant spænding) i et koldt rum, indtil farvefronten når bunden (2-2,5 timer).
- Gelen anbringes på en billeddanner (fx med et blåt lys filter til påvisning af GFP fusionsproteiner). Eksponeringstiden er valgt for at sikre, at de lyseste bands ikke er mættet.
6. Opskalering af cellekulturer
- Omdan en portion af kompetente
- Vælg en koloni i 10 ml af magt bouillon (suppleret som beskrevet i afsnit 3) og vokse natten over ved 37 ° C.
- Fortynd 5 ml natten over kultur i 500 ml power bouillon.
- Voks med rystning ved 250 rpm ved 37 ° C, indtil OD ved 595 nm er ~ 0,5.
- Inducere ekspression ved tilsætning af IPTG til en endelig koncentration på 1,0 mM.
- Vokse natten med rystning ved 250 rpm ved 20 ° C.
- Harvest cellerne ved centrifugering ved 5000 xg i 15 min.
- Supernatanten kasseres. Cellepellets kan opbevares ved -80 ° C.
7. Fremstilling af membraner
- Optø celler (om nødvendigt) ved stuetemperatur og resuspender i 1x PBS pH 7,5 i et volumen på 5 ml per gram cellepellet; Øg lydstyrken efter behov, indtil viskositeten reducerer til en løbende konsistens. Læg MgCI2 til en slutkoncentration på 1 mM, DNAse I til slutkoncentration på 10 ug / ml og enfærdigpakket proteaseinhibitortablet per 20 g cellepellet. Bryde åbne celler under anvendelse af en afkølet celle disrupter ved et tryk på 30 Kpsi.
- Pelletere ubrudte celler og debris ved 30.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til en ultra-centrifugerør.
- Saml den samlede membranfraktion ved nedspinning supernatanten i en ultra-centrifuge ved 200.000 xg i 1 time ved 4 ° C.
- Supernatanten fjernes.
- Resuspender membranpelleten i iskold 10 ml PBS pH 7,5 ved anvendelse af en celle-homogenisator. 1 ml resuspenderede membraner kræves for hver detergent. Eventuelt på dette stadium, membransuspensionen i flydende nitrogen og opbevares flash fryse ved -80 ° C.
8. Solubilisering og analyse af membranen Fraktion
- Thaw membranfraktion (om nødvendigt), og for hvert vaskemiddel, der skal anvendes til solubilisering, portion 900 pi af membransuspensionen i et 1,5 ml polyallomer mikro-centrifuge rør.
- Tilsæt 100 pi af hver frisklavet detergent (10% w / v opløsninger af DDM, DM, Cymal-6 og LDAO) til en endelig koncentration på 1% til den angivne 1,5 ml rør. Til solubilisering af eukaryote membranproteiner cholesterolhemisuccinat (0,2% slutkoncentration) tilsættes til vaske- og rengøringsmidler.
- Inkuber blandingen ved 4 ° C i 1 time med mild omrøring.
- Pelletere detergent uopløselige fraktion med en bænk top ultra-centrifuge, der sikrer rør er mindst halvt fyldt, ved 150.000 g ved 4 ° C i 45 minutter og fastholde supernatanten.
Bemærk: Effektiviteten af detergent solubilisering kan estimeres ved anvendelse af en fluorescerende pladelæser ved måling af GFP-fluorescens af de solubiliserede membraner med detergent uopløselige fraktion resuspenderes i det samme volumen PBS. - Analyser mono-dispersitet forskellige rensemidler: membranprotein komplekser under anvendelse af fluorescens-detekteret gelpermeationskromatografi (FSEC).
- For FSEC analyse ækvilibrere en størrelse eksklusion søjle med en bred fraktionering område, f.eks 5.000 til 5.000.000 molekylvægt, med rindende puffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) ved en strømningshastighed på 0,3 ml / min . Brug denne buffer for alle prøver, dvs. det er ikke ændret for hver testet vaskemiddel.
- Indsprøjtes 100 pi solubiliserede membraner på søjlen ved en strømningshastighed på 0,3 ml / min. Overvåg elueringsprofil anvendelse af fluorescens optik (excitation ved 488 nm og emission ved 512 nm). Hvis et inline fluorescens skærm ikke er tilgængelig, indsamle fraktionerne og læse fluorescens i en plade-læser.
- Import elueringsvolumen og fluorescensintensitet data i et regneark til grafisk visning.
- Analysere resterende opløst membran materiale ved in-gel fluorescens, som beskrevet i afsnit 5.
Representative Results
Det SEDS familie af proteiner (figur, forlængelse, division, og sporulering) er afgørende for bakteriel celledeling. Disse integrale proteiner har typisk ti transmembrandomæner med både amino- og carboxyterminale ender inde i cellen. For at eksemplificere den ovenfor beskrevne protokol blev 47 SEDS orthologer klonet ind i vektoren pOPINE-3C-eGFP. En lille skala ekspression skærm konstruktionerne blev udført i to E .coli stammer Lemo21 (DE3) dyrket i nærvær af 0,25 mM rhamnose at blokere utætte ekspression og C41 (DE3) pLysS, som rutinemæssigt anvendes til ekspression af membran proteiner 5-8.
Vaskemiddel solubiliseret lysater af inducerede kulturer blev analyseret ved SDS-polyacrylamid-elektroforese. Brug i-gel fluorescens at visualisere udtrykte GFP fusionsproteiner viste, at mellem de to stammer 38 ud af de 47 SEDS konstruktioner blev fremstillet. Interessant var der forskelle mellem de to ekspressionsstammer. Af de 38 udtrykte konstruktioner, kun 18 blev fremstillet i begge stammer, 14 kun udtrykkes i Lemo21 (DE3) og 6 kun i C41 (DE3) pLysS. Samlet set var der en højere succesrate for Lemo21 (DE3) sammenlignet med C41 (DE3) pLysS (38 vs 24). Den iagttagelse, at nogle proteiner viste sig at være specifikke for hver stamme betyder imidlertid, at screening i både er nyttigt.
Repræsentative data for 24 af de 47 SED'er konstruktioner er vist i figur 1. Intensiteten af båndene giver en indikation af niveauet af ekspression, fx fusionsproteinet i godt C4 i figur 1A og 1B udtrykkes godt i begge stammer dog yderligere lavere molekylvægt bånd tyder på, at proteinet er delvist nedbrudt. I mange baner der er et bånd, der svarer i størrelse til GFP alene. En kvalitativ vurdering af integriteten af proteinet kan udføres ved at kigge på intensiteten af fusionsprotein i forhold til den frie GFP;fx G4 og H4 er helt brudt ned til gratis GFP i C41 (DE3) pLysS (figur 1B), mens i Lemo21 (DE3) der er nogle intakte protein (figur 1A). For 14 ud af de 38 udtrykte proteiner intensiteten af den frie GFP båndet svarer til af fusionsproteinet for 21 intensiteten af den frie GFP båndet er større end af fusionsproteinet og et mindretal af fusionsproteinerne (3 / 38 udtrykt), f.eks F6 og G6 i figur 1A har relativt lidt fri GFP i forhold til fusionsproteinet.
To af de konstruktioner, der er udtrykt godt i de primære skærm B5 (høj intensitet bands gratis GFP og fusionsproteiner) og G6 (lille gratis GFP) blev udtrykt og en total membranfraktion fremstillet fra 500 ml cellekultur. Resuspenderede membraner blev opdelt i portioner og analyseret ved fluorescens-detekteret gelpermeationskromatografi (FSEC). De FSEC profiler præsenteres i Figure 2A og 2B henholdsvis og vise, at de to SEDS proteiner opfører sig anderledes i de fire testede vaskemidler. I ét tilfælde (figur 2A: prøve B5) proteinet kun gav en symmetrisk top med lidt aggregering i DDM som ville derfor være detergent valg for efterfølgende oprensning. Derimod den anden fusionsproteinet (figur 2B: prøve G6) gav en lignende profil i alle testede vaskemidler.
Figur 1: Diagram over workflow til screening membranprotein ekspression i E. coli under anvendelse af et GFP reporter.
Figur 2: Primær skærm membranprotein ekspression under anvendelse i-gel fluorescens. E. coli-celler blev analyseret ved SDS-PAGE og geler filmede med Blå Epi belysning og en 530/28 filter. Resultaterne er vist for 24 konstruktioner (mærket A4-H6 baseret på deres position i en 96-brønds plade). Positionerne af båndene til fri GFP og GFP fusionsproteiner er indikeret. (A) Proteiner udtrykt i Lemo21 (DE3). (B) Proteiner udtrykt i C41 (DE3) pLysS.
Figur 3:. Sekundær screening membranprotein ekspression under anvendelse af Fluorescens-detekteret gelpermeationskromatografi (FSEC) Total membranfraktioner blev ekstraheret i fire forskellige vaske- og de solubiliserede membranproteiner analyseret ved gelpermeationskromatografi ved anvendelse af en FPLC-system koblet til en fluorescensdetektor. FSEC profiler for (A) membranprotein B5 og (B)
Discussion
I protokollen beskrevet i denne artikel, er ligering uafhængig kloning i en GFP reporter vektor kombineret med fluorescensdetektion til hurtigt at screene den relative ekspression af multiple membranproteiner i E. coli. Vektorer kan ske i fire dage med primær udtryk screening tage endnu en uge. In-gel fluorescens af detergentlysater af hele celler anvendes til at rangordne ekspression rammer til yderligere analyse i en sekundær skærm. Den primære udtryk skærmen som præsenteres ikke kræver nogen specialudstyr bortset fra en rysteinkubator egnet til dyrkning celler i dybe godt blokke. Alle andre væskehåndtering involverer 96-brønds SBS plader kan udføres ved anvendelse af multi-kanal pipetter. Protokollen kan let modificeres til at omfatte andre E. coli-stammer dyrket under forskellige ekspressionssystemer betingelser (f.eks lavere temperatur). I tilfælde af LEMO21 (DE3) titrering niveauet af rhamnose (fra 0 til 2,0 mM)tilsat til at modulere hastigheden af transkription kan øge niveauet af ekspression af nogle membranproteiner 7. Andre end DDM Rengøringsmidler kan anvendes til ekstraktion i den primære screening selvom strengere vaskemidler kan solubilisere proteiner fra inklusionslegemer og giver derfor falske positiver. Er klart, at mere omfattende den første skærm bliver, jo mere tidskrævende eksperimentet.
Den sekundære skærm indebærer fremstilling af en total membranfraktion fra udtrykket hits identificeret i den primære screening. Dette er et kritisk trin, som det vil bekræfte lokalisering af fusionsproteinerne til membranen af E. coli-celler. Efterfølgende ekstraktion af GFP-fusionsproteinet i forskellige detergenter overvåges ved fluorescens-detekteret gelpermeationskromatografi af solubiliseret materiale at vurdere mono-dispersitet detergent-protein-komplekser. Dette er endnu et afgørende skridt, da den identificerer den mest hensigtsmæssige vaskemiddel tilsolubilisering af membranprotein til efterfølgende nedstrøms forarbejdning. Erfaringen viser dog, at kan være nødvendig yderligere optimering af valget af vaskemiddel (r) under oprensning og krystallisering. Bevis for ensartet adfærd i forskellige detergenter, herunder dem med en relativt lille micelle størrelse (f.eks LDAO) synes at være god indikator for en tilbøjelighed til at danne godt diffrakterende krystaller mindste for prokaryote membranproteiner 14. I denne henseende viste profil for membranprotein i figur 2B vises meget positiv.
Den største fordel ved at anvende en GFP reporter er, at det giver en hurtig udlæsning af ekspression i un-oprensede prøver. En ulempe er, at GFP-fusionsproteinet skal fjernes under oprensning af proteinet til krystallisation. I tilfælde af vektorer, der anvendes her, en rhinovirus 3C protease-site muliggør spaltning af GFP. Alternativt er det ligetilat re-clone kandidat proteiner, der er identificeret i skærmen, i vektorer, som kun tilføjer en polyhistidin eller anden affinitetstag til efterfølgende rensning. Dette forudsætter, at fusion til GFP er ikke nødvendig til ekspression. Det vigtigste alternativ til fusion til GFP til påvisning af membranprotein udtryk og opløselighed er at tilsætte kun en histidinmærke. Men denne fremgangsmåde kræver typisk starter med en membran fraktion 15, som til evaluering af mange varianter vil blive meget tidskrævende.
Sammenfattende er det vigtigste formål med protokollen beskrevet i denne artikel for at gøre det muligt for et stort antal membranprotein sekvensvarianter til hurtigt evalueres med hensyn til udtryk og vaskemiddel solubilization og prioriteres til nærmere analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
| LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
| In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
| Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
| CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
| DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
| DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
| LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
| E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
| Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
| Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
| Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
| 24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
| XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
| Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
| Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
| ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
| Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
| Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
| Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
| Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
| TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
References
- Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).
- Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
- Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
- Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).
