Summary
Un approccio semplificato per lo screening per l'espressione di proteine di membrana ricombinanti in Escherichia coli basato sulla fusione di proteina fluorescente verde è presentato.
Abstract
La produzione di proteine di membrana ricombinanti per studi strutturali e funzionali rimane tecnicamente impegnativo a causa dei bassi livelli di espressione e l'instabilità intrinseca di molte proteine di membrana volta solubilizzazione nei detergenti. Un protocollo è descritto, che combina la legatura clonazione indipendente di proteine di membrana come fusioni GFP con espressione in Escherichia coli rilevati da GFP fluorescenza. Questo consente la costruzione e l'espressione di screening di proteine di membrana multiple / varianti per identificare i candidati idonei per un ulteriore investimento di tempo e fatica. Il reporter GFP è utilizzato in una schermata primaria di espressione visualizzando fluorescenza GFP seguente SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Le proteine di membrana che mostrano sia un livello di espressione alto con degradazione minima, come indicato dall'assenza di GFP libera, sono selezionati per uno schermo secondario. Questi costrutti sono in scala e una frazione di membrana totale preparati e solubilizzanod in quattro detergenti diversi. Dopo ultracentrifugazione per rimuovere il materiale detergente-insolubili, lisati sono analizzati per il rilevamento della fluorescenza cromatografia esclusione dimensione (FSEC). Il monitoraggio del profilo di esclusione dimensioni di GFP fluorescenza fornisce informazioni sulla mono-dispersità e l'integrità delle proteine di membrana nei detergenti diversi. Proteine: combinazioni detergenti che eluiscono con un picco simmetrico con poca o nessuna connessione GFP e aggregazione minima sono candidati per la successiva purificazione. Utilizzando la metodologia sopra, l'espressione eterologa in E. coli di SED (forma, l'allungamento, la divisione, e la sporulazione) proteine da 47 diverse specie di batteri è stata analizzata. Queste proteine hanno tipicamente dieci domini transmembrana e sono essenziali per la divisione cellulare. I risultati mostrano che la produzione dei SED ortologhi in E. coli era altamente variabile rispetto ai livelli di espressione e l'integrità delle proteine di fusione GFP. La i esperimentodentified un sottoinsieme per ulteriori indagini.
Introduction
È stato stimato che le proteine di membrana rappresentano circa il 20-30% dei geni codificati in tutti i genomi sequenziati 1, tra il genoma umano 2. Dato il loro ruolo critico in molti processi biologici, ad esempio il trasporto di metaboliti, produzione di energia e come bersagli farmacologici, c'è forte interesse nel determinare la loro struttura tridimensionale. Tuttavia, rispetto alle proteine solubili, proteine di membrana sono molto sottorappresentate nel Protein Data Bank. In realtà, le 99.624 strutture rilasciati nel PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) solo 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) sono classificate come proteine di membrana. Questo riflette le difficoltà tecniche di lavoro con proteine di membrana che sono naturalmente espressi a livelli relativamente bassi; rodopsina è una delle poche eccezioni 3,4. Over-espressione di versione ricombinantes in cellule eterologhe si traduce spesso in misfolding e poveri mirati alla membrana che limita il livello globale della produzione. Selezionando il miglior detersivo per l'estrazione e la solubilizzazione di una proteina di membrana espressa volta successiva purificazione rende difficile e richiede un'attenta ottimizzazione.
Escherichia coli rimane l'espressione ospite più comunemente usata per le proteine di membrana pari al 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) di strutture finora risolto che sono quasi esclusivamente da fonti batteriche. Specific E. ceppi coli, C41 (DE3) e C43 (DE3), sono stati isolati, che non portano alla sovra-espressione di proteine di membrana e quindi evitare gli effetti di tossicità osservati per altre BL21 ceppi 5,6. Ottimizzazione del livello di espressione ricombinante proteina di membrana sembra essere critica per ottimizzare il livello di produzione di 6,7.
6-8. Pertanto, un metodo per lo screening di espressione di proteine di membrana multipli in parallelo è essenziale. Un approccio comunemente utilizzato è di fondere la proteina a proteina fluorescente verde (GFP) espressione permette di tenere traccia senza la necessità di purificare la proteina. In questo modo, informazioni sul livello di espressione, la stabilità e il comportamento in detergenti diversi può essere valutata con piccole quantità di un-purificato materiale 9-12.
In questo articolo descriviamo un protocollo semplificato per la clonazione e l'espressione screening delle proteine di membrana in E. coli con la fusione di GFP come reporter di produzione e la successiva caratterizzazione di detersivo: proteine compLexes (Figura 1).
Protocol
1. Costruzione di vettori di espressione
- Usa PCR Infusion clonazione di costruire fino a 96 plasmidi di espressione in parallelo con i vettori pOPINE-3C-GFP e Popin-N-GFP che aggiungono sia scindibili fusioni GFP-His6 C-terminale o N-terminale alle sequenze 13 rispettivamente.
Nota: La scelta del vettore è dettata dalla topologia della proteina poiché la GFP deve essere espresso nel citosol, quindi per una proteina con un citosolica N-terminale e C-terminale extracellulare useremo Popin-N-GFP e un extracellulare N-terminale e citosolica C-terminale in useremmo pOPINE-3C-GFP. Se i due termini sono citosolico useremmo pOPINE-3C-GFP meno che non vi sia ragione funzionale non per contrassegnare il C-terminale. - Amplificare le sequenze di DNA che codificano per le proteine di membrana con primer che incorporano le seguenti estensioni indicate:
pOPINE-3C-GFP (fondo Forward - AGGAGATATACCATG; Primer Reverse - CAGAACTTCCAGTTT) e Popin-N-GFP (fondo Forward - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Reverse Primer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA). - Analizzare la reazione di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Una volta prodotti puliti di PCR sono stati ottenuti, aggiungere 5 U DpnI a ciascun bene (fare in 5 ml di tampone di reazione 1x DpnI). Purificare i prodotti PCR utilizzando sfere magnetiche in un formato a 96 pozzetti.
Nota: DpnI viene aggiunto per rimuovere il modello vettoriale; questo passaggio non è necessario se il DNA genomico è usato come template. - Aggiungere 1 ml (100 ng) del corrispondente vettore linearizzato a ciascun pozzetto di una piastra PCR.
- Usando una pipetta multicanale add x ml di purificato PCR inserire nei rispettivi pozzetti della piastra PCR. Assicurarsi che tutti i prodotti sono nell'intervallo 10-250 ng.
- Aggiungere (9-x) microlitri di acqua al pozzo e trasferire il tutto 10 microlitri di una provetta contenente secco-down in fusione reagente. Lasciare agire per 30 sec.
- Mescolare contenuti brevemente pipettando su e giù. Trasferimentole reazioni di nuovo alla piastra PCR originale e la guarnizione.
- Incubare per 30 minuti a 42 ° C in un termociclatore.
- Trasferire immediatamente le reazioni in ghiaccio quando la reazione è completa e aggiungere 40 ml di TE (Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Congelare immediatamente o trasformare in cellule competenti. Per la trasformazione, usare 3 ml di reazione diluito per 50 microlitri aliquota di alta competenza (> 5 x 10 9 trasformanti / mg) competente E. coli.
- Aggiungere 1 ml di LB agar integrato con 50 mg / ml carbenicillina per pozzetto di una piastra di coltura tissutale 24-bene (per la clonazione, preparare pozzetti per 2 x numero di costrutti).
- A seguito di conseguenza, seguito piastra escrescenza out 25 ml e 25 ml di una diluizione 1: 5 della cultura sul agar contenente 24 pozzetti piastre di coltura dei tessuti.
- Stendere le cellule inclinando leggermente la piastra.
- Essiccare la piastra con il coperchio per 10-15 minuti a 37 ° C o in un flow cappa a temperatura ambiente.
- Rimettere il coperchio e girare la piastra di testa in giù e incubare una notte a 37 ° C.
- Scegli due colonie e mini-preparazione i vettori.
- PCR verificare i costrutti utilizzando il costrutto specifico primer reverse e un primer forward vettore specifico (ad esempio pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).
2. Trasformazione di E. coli E Ceppi xpression
Nota: Prima di eseguire questo protocollo, E. cellule competenti coli sono fatti, aliquotati e conservati congelati a -80 ° C, come descritto in precedenza 13. Espressione della proteina di membrana viene costantemente controllato in due ceppi, Lemo21 (DE3) e C41 (DE3) pLysS. Per facilitare l'interpretazione dei risultati può essere utile includere un controllo positivo, ad esempio un plasmide che esprime GFP o una proteina di membrana fusa alla GFP noti per esprimere e un controllo negativo vettore vuoto.
- Scongelare la aliquotted E. coli su ghiaccio. Aggiungere 3 ml di mini-prepped plasmide di espressione per ogni aliquota di cellule competenti.
- Incubare la miscela in ghiaccio per 30 min.
- Heat-shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C.
- Consentono alle cellule di recuperare in ghiaccio per 2 minuti e poi aggiungere 300 ml di brodo di potere ad ogni provetta.
- Incubare per 1 ora in un incubatore statico 37 ° C.
- Preparare il LB Agar in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, integrata con 50 mg / ml e carbenicillina 35 mg / ml cloramfenicolo. Aggiungere ramnosio ad una concentrazione finale di 0,25 mM ai pozzetti contenenti Lemo21 (DE3).
Nota: Se il prodotto è probabile che sia tossico i pozzetti contenenti C41 (DE3) pLysS può essere integrato con 1% (w / v) di glucosio. - Trasferire 30 ml di cellule dal mix di trasformazione sulle piastre LB Agar. Stendere e asciugare la piastra come descritto in 1,13-1,15.
3. Preparazione di colture starter Overnight
Nota: preparare sempre le culture durante la notte il giorno dopo la trasformazione mai da una vecchia piastra di trasformazione.
- Aggiungere 0,7 ml di potenza brodo a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti profondi ben integrato con 50 mg / ml carbenicillina e 35 ug / ml di cloramfenicolo. Aggiungere ramnosio ai pozzetti contenenti Lemo21 (DE3) ad una concentrazione finale di 0,25 mM. Facoltativamente, integrare C41 (DE3) pLysS con 1% (w / v) di glucosio; vedi sopra (2.6 nota).
- Scegli una colonia dalle piastre di trasformazione durante la notte in ogni pozzetto. Sigillare il blocco con un sigillo gas-permeabile.
- Agitare il blocco a 250 rpm in un incubatore con un grande lancio (es orbita 25 mm) o a 600 rpm in un incubatore con una piccola laterale (es un'orbita 4,3 millimetri) a 37 ° C durante la notte.
4. La crescita e induzione delle Culture
- Aggiungere 3 ml di brodo di potenza integrato con 50 mg / ml e carbenicillina 35 mg / ml di cloramfenicolo ogni well di 24 pozzetti profondo bene. Aggiungere L-ramnosio (e glucosio), come descritto nella sezione 3.1. Utilizzare 3 ml di coltura per permettere la raccolta in duplicato e per consentire una certa evaporazione dell'acqua attraverso la tenuta permeabile ai gas.
- Impostare le culture di espressione con l'aggiunta di 150 ml di Lemo21 (DE3) o C41 (DE3) pLysS culture durante la notte in ogni pozzetto dei blocchi 24 e profondo bene.
- Agitare i blocchi a 37 ° C finché la OD media a 595 nm è ~ 0,5 attraverso la piastra.
- Indurre l'espressione aggiungendo IPTG alle culture ad una concentrazione finale di 1,0 mM IPTG.
- Far crescere le culture durante la notte (18-20 h) con agitazione a 20 ° C.
5. Analisi di Expression da In-gel fluorescenza
- Raccolto in duplice copia. Trasferire 1 ml della cultura da ogni pozzetto in una, fondo conico, blocco quadrato ben 96 ben profondo bene.
Nota: Harvest in duplice copia in caso di rottura del blocco o per consentire la sperimentazione della correntdetersivo ve se lo si desidera. - Sigillare i blocchi e raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
- Capovolgere il blocco e decantare la media. Toccare il blocco delicatamente su un tovagliolo di carta per drenare supporti rimanenti.
- Sigillare le piastre e conservare a -80 ° C per un minimo di 20 min. Facoltativamente, lasciare l'esperimento a questo punto e il blocco trasformati quando conveniente.
- De-gelo i pellets per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzare una pipetta multicanale o un agitatore orbitale (1000 rpm per 10 min) a 4 ° C per risospendere completamente le cellule in 200 microlitri di tampone di lisi (50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM imidazolo 10 mM 1% v / v Tween 20, regolare il pH a 8,0 con NaOH).
- Aggiungere 20 ml di soluzione DLPI (20 microlitri DNaseI (4.000 unità / ml), 20 mg, lisozima e 20 microlitri cocktail inibitore di proteasi in un volume finale di 2 ml di acqua). Incubare per 10 minuti con agitazione (~ 1000 rpm) a 4 ° C.
- Incubare per 60 minuti con agitazione (~ 1000 rpm) a 4 ° C.
- Centrifugare il blocco profondo bene a 6.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Trasferire 10 ml di lisato eliminato per una piastra di microtitolazione e aggiungere 10 ml di tampone di SDS PAGE gel loading (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v blu di bromofenolo, 10% v / v β -mercaptoethanol, e il 20% v / v glicerolo). ATTENZIONE! Non bollire CAMPIONE.
- Carico 10 microlitri di campione dal punto 5.11 / pozzetto su SDS PAGE gel (s) e funzionano a 100-120 V (tensione costante) in una camera fredda finché il fronte del colorante raggiunge il fondo (2-2,5 ore).
- Posizionare il gel su un imager (ad esempio con un filtro blu-luce per rilevare le proteine GFP fusione). Il tempo di esposizione è scelta in modo che le bande più brillanti non sono saturi.
6. Scale-up di colture cellulari
- Trasformare una aliquota di competenza
- Scegli una colonia in 10 ml di brodo di potenza (integrato come descritto nella sezione 3) e crescere durante la notte a 37 ° C.
- Diluire 5 ml di coltura durante la notte in 500 ml di brodo di alimentazione.
- Grow con agitazione a 250 rpm a 37 ° C finché la densità ottica a 595 nm è ~ 0,5.
- Indurre l'espressione aggiungendo IPTG ad una concentrazione finale di 1,0 mM.
- Crescere una notte con agitazione a 250 rpm a 20 ° C.
- Celle di raccolta per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min.
- Surnatante Rifiuta. Pellet cellulari possono essere conservati a -80 ° C.
7. Preparazione di Membrane
- Cellule Scongelare (se necessario) a temperatura ambiente e risospendere in 1x PBS pH 7,5 ad un volume di 5 ml per grammo di pellet cellulare; Aumentare il volume, se necessario, fino a quando la viscosità si riduce ad una consistenza liquida. Aggiungere MgCl 2 alla concentrazione finale di 1 mM, DNAsi I a concentrazione finale di 10 mg / ml e unopre-confezionati proteasi tablet inibitore per 20 g di pellet. Rottura celle aperte con un disgregatore cella refrigerata ad una pressione di 30 kpsi.
- Agglomerare le cellule intatte e detriti a 30.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un tubo ultra-centrifugazione.
- Raccogliere la frazione totale membrana riducendo la velocità del supernatante in un ultra-centrifugare a 200.000 xg per 1 ora a 4 ° C.
- Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet membrana ghiacciate 10 ml PBS pH 7.5 utilizzando un omogeneizzatore cellulare. 1 ml membrane risospese sono necessari per ogni detersivo. Facoltativamente, in questa fase, flash congelare la sospensione della membrana in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
8. solubilizzazione e Analisi della Frazione Membrane
- Scongelare frazione di membrana (se necessario), e per ogni detersivo da utilizzare per solubilizzazione, aliquote di 900 ml di sospensione di membrana in un 1,5 ml polyallomer micro-centrifugotubo ge.
- Aggiungere 100 pl di ciascun detergente preparata di fresco (10% w / v soluzioni di DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) ad una concentrazione finale di 1% al tubo 1,5 ml specificato. Per solubilizzazione di proteine di membrana eucariotica emisuccinato colesterolo (concentrazione finale 0,2%) può essere aggiunto ai detergenti.
- Incubare le miscele a 4 ° C per 1 ora con blanda agitazione.
- Pellet detergente frazione insolubile con un banco superiore ultra-centrifuga, assicurando tubi sono almeno mezzo pieno, a 150.000 g a 4 ° C per 45 min e mantenere surnatante.
Nota: L'efficacia di detersivo solubilizzazione può essere stimata utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza misurando la fluorescenza GFP delle membrane solubilizzate con il detersivo frazione insolubile risospese nello stesso volume di PBS. - Analizzare il mono-dispersità del diverso detersivo: complessi di proteine di membrana mediante cromatografia fluorescenza rilevati dimensioni esclusione (FSEC).
- Per l'analisi FSEC, equilibrare una colonna esclusione dimensioni con una vasta gamma di frazionamento, ad esempio 5.000 a 5.000.000 nel peso molecolare, con tampone di corsa (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) ad una portata di 0,3 ml / min . Utilizzare questo buffer per tutti i campioni, cioè non è cambiato per ogni detersivo testato.
- Iniettare 100 ul di membrane solubilizzate sulla colonna ad una velocità di flusso di 0,3 ml / min. Monitorare profilo eluizione utilizzando ottiche fluorescenza (eccitazione a 488 nm ed emissione a 512 nm). Se un monitor linea fluorescenza non è disponibile, raccogliere le frazioni e leggere la fluorescenza in un lettore di piastre.
- Importa volume di eluizione e dati intensità di fluorescenza in un foglio di calcolo per la visualizzazione grafica.
- Analizzare restante materiale della membrana solubilizzato da in-gel di fluorescenza come descritto nel capitolo 5.
Representative Results
La famiglia SEDS di proteine (forma, allungamento, divisione, e sporulazione) è essenziale per la divisione cellulare batterica. Queste proteine integrali hanno tipicamente dieci domini transmembrana con entrambi i termini amminici e carbossilici all'interno della cellula. Per esemplificare il protocollo sopra descritto, 47 SED ortologhi sono stati clonati nel vettore pOPINE-3C-eGFP. Un piccolo schermo espressione scala dei costrutti è stata effettuata in due E ceppi .coli, Lemo21 (DE3) coltivate in presenza di 0,25 mM ramnosio per bloccare l'espressione leaky e C41 (DE3) pLysS, che vengono abitualmente utilizzati per l'espressione di membrana proteine 5-8.
Detergente solubilizzati lisati di culture indotte sono stati analizzati mediante elettroforesi SDS-poliacrilammide. Uso in gel di fluorescenza per visualizzare proteine di fusione GFP espresse mostrato che tra i due ceppi 38 dei 47 SED costrutti sono stati prodotti. È interessante notare che ci sono differenze tra i due ceppi di espressione. Dei 38 espresso costrutti, solo 18 sono stati prodotti in entrambi i ceppi, 14 espresse solo in Lemo21 (DE3) e 6 solo in C41 (DE3) pLysS. Nel complesso, ci fu un tasso di successo più elevato per il Lemo21 (DE3) rispetto al pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). Tuttavia l'osservazione che alcune proteine sembravano essere ceppo specifico che lo screening sia utile.
Dati rappresentativi per 24 dei 47 SEDs costrutti sono mostrati in Figura 1. L'intensità delle bande dà un'indicazione del livello di espressione, per esempio la proteina di fusione in C4 bene in figura 1A e 1B si esprime bene in entrambi i ceppi tuttavia l'ulteriore bande con peso molecolare inferiore suggeriscono che la proteina è parzialmente degradata. In molti corsie c'è una banda che corrisponde in dimensioni per GFP solo. Una valutazione qualitativa dell'integrità della proteina può essere effettuata da guardando l'intensità della proteina di fusione rispetto al GFP libero;ad esempio, G4 e H4 sono completamente suddivisi per GFP gratuita in C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), mentre nel Lemo21 (DE3) vi è una certa proteina intatta (Figura 1A). Per 14 dei 38 proteine espresse l'intensità della banda GFP libera è simile a quella della proteina di fusione, per 21 l'intensità della banda GFP libera è maggiore di quella della proteina di fusione e una minoranza delle proteine di fusione (3 / 38 espresso) ad es F6 e G6 in Figura 1A hanno relativamente poco GFP libera rispetto alla proteina di fusione.
Due dei costrutti che esprimono bene nelle B5 schermata principale (fasce ad alta intensità per GFP gratuitamente e proteine di fusione) e G6 (poco gratuito GFP) sono stati espressi e una frazione di membrana totale preparato da 500 ml coltura cellulare. Membrane risospese sono state divise in aliquote e analizzati mediante cromatografia ad esclusione sterica fluorescenza rilevato (FSEC). I profili FSEC sono presentati in Figure rispettivamente e 2A e 2B mostrano che le due proteine SED comportano in modo diverso nelle quattro detergenti testati. In un caso (Figura 2A: campione B5) la proteina dato solo un picco simmetrico con poco aggregazione in DDM che sarebbe quindi il detersivo di scelta per la successiva purificazione. Per contro l'altra proteina di fusione (Figura 2B: campione G6) ha un profilo simile in tutti i detersivi testati.
Figura 1: Schema di flusso di lavoro per lo screening espressione della proteina di membrana in E. coli con un reporter GFP.
Figura 2: schermata primaria di espressione della proteina di membrana utilizzando in-gel fluorescenza. E. coli sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e gel ripreso con illuminazione blu Epi e 530/28 filtro. I risultati sono mostrati per 24 costrutti (etichettati A4-H6 base alla loro posizione in una piastra a 96 pozzetti). Sono indicate le posizioni delle bande per GFP libero e proteine di fusione GFP. (A) Proteine espresse in Lemo21 (DE3). (B) Proteine espresse in C41 (DE3) pLysS.
Figura 3:. Schermo secondario di espressione della proteina di membrana mediante cromatografia di esclusione dimensioni fluorescenza rilevato (FSEC) frazioni di membrana totali sono stati estratti in quattro diversi detergenti e le proteine di membrana solubilizzate analizzato mediante cromatografia di esclusione dimensioni utilizzando un sistema FPLC accoppiato ad un rivelatore a fluorescenza. Profili FSEC per (A) B5 proteina di membrana e (B)
Discussion
Nel protocollo descritto in questo articolo, la legatura clonazione indipendente in un vettore GFP giornalista è combinato con il rilevamento della fluorescenza per lo screening rapidamente l'espressione relativa di più proteine di membrana in E. coli. Vettori possono essere realizzati in quattro giorni lavorativi con schermatura espressione primaria prendere un'altra settimana. In-gel fluorescenza lisati detergenti di cellule intere viene utilizzato per classificare espressione colpisce per ulteriori analisi in uno schermo secondario. La schermata espressione primaria come presentato non richiede attrezzature specialistiche parte un incubatore agitatore adatto per la coltivazione delle cellule in blocchi e profonde. Tutti manipolazione liquidi coinvolge 96 pozzetti piastre SBS può essere effettuata con pipette multicanale. Il protocollo può essere facilmente modificato per includere altri ceppi di E. coli cresciute in diverse condizioni di espressione (ad esempio temperatura bassa). Nel caso del LEMO21 (DE3) titolando il livello di ramnosio (da 0 a 2,0 mm)aggiunta di modulare la velocità di trascrizione può aumentare il livello di espressione di alcune proteine di membrana 7. Detergenti diversi da DDM potrebbero essere utilizzati per l'estrazione nella schermata principale se i detergenti più severe possono solubilizzare le proteine dai corpi di inclusione e quindi dare falsi positivi. Chiaramente, la più elaborata schermata iniziale diventa, più in termini di tempo dell'esperimento.
Lo schermo secondario prevede la preparazione di una frazione di membrana totale dai colpi di espressione identificati nella schermata principale. Questa è una fase critica come sarà confermare la localizzazione delle proteine di fusione della membrana del E. coli. Successiva estrazione della proteina di fusione GFP in detergenti diversi è monitorato da fluorescenza rilevata dimensioni esclusione cromatografia di materiale solubilizzato per valutare la mono-dispersità dei complessi proteici detergente. Questo è un altro aspetto critico poiché identifica il detergente più appropriato persolubilizzazione delle proteine di membrana per la successiva lavorazione a valle. Tuttavia, l'esperienza mostra che ulteriore ottimizzazione della scelta del detersivo (s), potrebbe essere necessario durante la purificazione e cristallizzazione. La prova di un comportamento uniforme nei diversi detergenti, tra cui quelli con una dimensione relativamente piccola micelle (es LDAO) sembra essere un buon indicatore di una propensione a formare bene diffrazione dei cristalli, almeno per le proteine di membrana procariote 14. A questo proposito il profilo indicato per la proteina di membrana in Figura 2B appare molto favorevole.
Il principale vantaggio di utilizzare un reporter GFP è che dà una rapida lettura di espressione in campioni non-purificata. Uno svantaggio è che la proteina di fusione GFP deve essere rimosso durante la purificazione della proteina per la cristallizzazione. Nel caso dei vettori utilizzati qui, un sito proteasi rhinovirus 3C consente di clivaggio della GFP. In alternativa, esso è semplicedi ri-clone proteine candidate, individuate nella schermata, in vettori che aggiungono solo un polyhistidine o altro tag affinità per successiva purificazione. Questo presuppone che la fusione di GFP non è necessaria per l'espressione. La principale alternativa all'utilizzo di fusione GFP per il rilevamento di espressione della proteina di membrana e la solubilizzazione è solo aggiungere un tag istidina. Tuttavia questo approccio richiede generalmente a partire da una frazione di membrana 15 che per la valutazione delle molte varianti diverrebbe molto tempo.
In sintesi, lo scopo principale del protocollo descritto in questo articolo è consentire un gran numero di sequenza della proteina di membrana varianti essere rapidamente valutati in termini di espressione e detergente solubilizzazione e priorità per un'analisi più approfondita.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
| C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
| LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
| In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
| Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
| CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
| DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
| DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
| LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
| E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
| Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
| Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
| Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
| 24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
| XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
| Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
| Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
| ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
| Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
| Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
| Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
| Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
| Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
| TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
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