Abstract
De combinatie van patch clamp opnamen van twee (of meer) synaptically gekoppeld neuronen (gepaarde opnames) bij acute hersenen slice bereidingen met gelijktijdige intracellulaire biocytine vulling maakt een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen. Met deze methode is het mogelijk om zowel pre- en postsynaptische neuronen identificeren en karakteriseren door hun morfologie en elektrofysiologische respons patroon. Gepaarde opnames toe de connectiviteitspatronen tussen deze neuronen alsook de eigenschappen van zowel chemische en elektrische synaptische transmissie. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om betrouwbare gepaarde opnames samen te verkrijgen met een optimaal herstel van het neuron morfologie procedures. We zullen beschrijven hoe paren van neuronen die via chemische synapsen of gap junctions zijn geïdentificeerd in de hersenen slice preparaten. We zullen aangeven hoe neuronen worden gereconstrueerd om hun 3D-morfologie van de Dendrit verkrijgenic en axonale domein en hoe synaptische contacten worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. We bespreken ook de valkuilen en beperkingen van de gepaarde opnametechniek, met name die in verband met dendritische en axonale afknottingen tijdens de voorbereiding van de hersenen plakjes, omdat deze sterk beïnvloeden connectiviteit schattingen. Vanwege de veelzijdigheid van de gepaarde opname benadering zal een waardevol hulpmiddel bij het karakteriseren van verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen blijft.
Introduction
Neuronale microschakelingen tussen twee synaptically gekoppeld neuronen zijn de bouwstenen van grootschalige netwerken in de hersenen en zijn de fundamentele eenheden van synaptische informatieverwerking. Voorwaarde voor het karakteriseren van dergelijke neuronale microcircuits is de morfologie en functionele eigenschappen van zowel de pre- en postsynaptische neuronen partner, het type synaptische verbinding (en) en de structuur en werkingsmechanisme kennen. In veel studies van synaptische verbindingen ten minste één van de neuronen in een microschakeling niet goed gekarakteriseerd. Dit resulteert uit de betrekkelijk onspecifieke stimulatieprotocollen vaak gebruikt in studies van synaptische connectiviteit. Daarom worden de structurele en functionele eigenschappen van het presynaptische neuron ofwel niet geïdentificeerd of slechts een vrij klein gedeelte (bijvoorbeeld, de expressie van merker eiwitten etc.). Gepaarde opnames in combinatie met intracellulaire kleuring door markers sUch als biocytine, neurobiotin of fluorescerende kleurstoffen zijn beter geschikt voor het bestuderen van kleine neuronale microschakelingen. Deze techniek maakt het mogelijk om vele structurele en functionele parameters van een morfologisch geïdentificeerd synaptische verbinding tegelijkertijd te onderzoeken.
Zogenaamde 'unitaire' monosynaptic verbindingen tussen twee neuronen zijn onderzocht in zowel corticale en subcorticale hersengebieden 1-10 behulp van acute slice voorbereiding. Aanvankelijk werden scherpe micro-elektroden gebruikt in deze experimenten; later werd patch clamp toegepast om opname van synaptische signalen te verkrijgen met een lager geluidsniveau en een verbeterde tijdsresolutie.
Een belangrijke technische vooruitgang is het gebruik van infrarode differentiële interferentie contrast (IR-DIC) optiek 11-14, microscopische techniek die aanzienlijk verbeterd de zichtbaarheid en de identificatie van neuronen in de hersenen slice zodat het mogelijk werd to verkrijgen opnames van visueel geïdentificeerde synaptische verbindingen 15-17. In het algemeen gepaard opnamen uitgevoerd bij acute slice preparaten; slechts zeer weinig publicaties zijn verkrijgbaar rapportage opnamen van synaptically verbonden neuronen in vivo 18-20.
Het belangrijkste voordeel van gepaarde opnames is het feit dat een functionele karakterisering kan worden gecombineerd met een morfologische analyse op zowel het licht en elektronen microscopisch niveau (zie bv., 7,16,21). Na histochemische verwerking, wordt de dendritische en axonale morfologie van de synaptically verbonden neuron paar getraceerd. Vervolgens is het mogelijk om morfologische kenmerken zoals lengte, ruimtelijke dichtheid, oriëntatie, vertakking enz kwantificeren Deze parameters kunnen dan een basis voor een objectieve classificatie van een specifiek synaptische verbinding. Bovendien, in tegenstelling tot de meeste andere technieken voor het bestuderen van neuronale verbviteit, gepaarde opnames toestaan ook de identificatie van synaptische contacten voor unitaire synaptische verbindingen. Dit kan direct worden gedaan met behulp van een combinatie van licht en elektronenmicroscopie 16,21-27 of met behulp van calcium beeldvorming 28,29 van dendritische spines. Echter, met deze benadering enige prikkelende maar niet remmende verbindingen kunnen worden bestudeerd als het vereist calcium influx via de postsynaptische receptor kanalen.
Naast een gedetailleerde analyse van synaptische transmissie bij een bepaalde neuronale microcircuit gepaarde opnames ook de studie van synaptische plasticiteit regels 30,31 toestaan of - in combinatie met agonist / antagonist toepassing - de modulatie van synaptische transmissie door neurotransmitters zoals acetylcholine 32 en adenosine 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn inzake de bescherming van dieren, de Duitse Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz) en de richtsnoeren van de Federation of European Laboratory Animal Science Association uitgevoerd.
1. Set-up voor Electrophysiology
Voordat u begint met gepaarde opname, een elektrofysiologie set-up moet worden gebouwd. Een korte schets hoe een dergelijke set-up wordt geassembleerd wordt hieronder gegeven:
- Installeer een antivibratietafel waarop de microscoop, de manipulatoren en andere apparaten worden geplaatst.
OPMERKING: Trillingen of enige andere vorm van beweging moet zo klein mogelijk zijn bij het opnemen van synaptische verbindingen omdat een wijziging vereist van pipetten (zoeken elektrode vervangen door opname elektrode). - Plaats een Faraday kooi rond de antivibratietafel elektrische ruis. Sluit alle apparatuur in de Faraday cage met de elektrische gemalen.
- Installeer een microscoop met een motorische scherpstelling as die is gebaseerd op een gemotoriseerde xy tafel op de antivibratietafel volgens de richtlijnen van de fabrikant. Hierdoor betrouwbaar verplaatsen de microscoop neuronen die niet in hetzelfde gezichtsveld zoals het geval is voor translaminar verbindingen in de neocortex.
- Installeer een video camera op de camera-poort van de microscoop en sluit deze aan en / of digitale schermen analoog aan de slice voorbereiding en de beweging van de elektroden te observeren. Gebruik een camera, die kan worden geschakeld tussen een lage en een high-power vergroting om een overzicht te krijgen en het beeld van een close-up, respectievelijk van de synaptically gekoppeld neuronale cel paar. Daarenboven maakt de beweging van de strookelektrodes regelen.
- Installeer een specimen tabel met een inzet voor het bad kamer (geboord in-huis van een perspex blok) voor de hersenen slice voorbereiding. Dit exemplaar tabel moet niet worden aangesloten op demicroscoop, dwz moeten worden bevestigd aan de lucht tafel en de microscoop moet wendbaar eronder zijn.
- Mount twee (of meer indien nodig) hoge precisie micromanipulators dat in alle drie dimensies kan worden verplaatst. Installeer patch-clamp voorversterker op de manipulatoren en sluit ze aan de belangrijkste versterker.
OPMERKING: Indien nodig extra manipulatoren kan worden geïnstalleerd voor bijvoorbeeld meer dan twee voorversterkers, extracellulaire stimulatie-elektroden, drug-delivery systemen, etc. - Plaats de bad kamer in het specimen tafel. Installeer een oplossing inlaat en uitlaat en sluit ze aan op de perfusie-systeem.
- Gebruik een peristaltische pomp aan de perfusie van de opname kamer met kunstmatige cerebrospinale vloeistof handhaven (ACSF; tabel 1) op een stabiele stroomsnelheid van 4-6 ml / min voor optimale levensvatbaarheid segment.
OPMERKING: Neem niet meer dan dit debiet aanzienlijk omdat het zal leiden tot turbulentie in de ASCF en dus beweging van de snee. Installeer houders voor de temperatuursensor en Ag / AgCl massa-elektrode op het monster tafel. Dit is nodig om de sonde en elektrode laat het bad in de kamer proeven. - Voor een goede zichtbaarheid van neuronen in de slice voorbereiding gebruiken infrarood belichting in de microscoop. Dit vermindert licht diffractie en dus onscherpte. Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met differentieel interferentie contrast optiek om een '3D'-achtige visualisatie te bereiken. Dit zal helpen bij het patchen van neuronen en laat targeting neuronen diep in de slice (60 micrometer of dieper).
- Tijdens het experiment te houden hersencoupes in een experimentele kamer met een glazen dekglaasje onderaan. Plaats een "platina harp 'bovenop slice plakjes voorkomen drijven. Een platina harp uit U-vormige, afgeplatte platinadraad met koorden van tandzijde gelijmd is.
- Houd de ACSF perfuseren de plak bij een temperatuur van 32-35 ° C om opt waarborgenimal controle van zuurstof en pH. Dit kan door verwarming van de oplossing met een Peltier apparaat montage van de ACSF instroom in het bad kamer.
OPMERKING: Gebruik ultradunne dekglaasjes zodat zelfs microscoop condensors met een hoge numerieke opening en korte werkafstand kan worden gericht op het monster. Dit is nodig voor een optimale verlichting van de slice.
Voor een afbeelding en een beschrijving van een elektrofysiologie set-up geoptimaliseerd voor gepaarde opnames in de hersenen slice voorbereiding zie figuur 4 in Ref. 34.
2. Brain Slice Voorbereiding
- Mild verdoven het dier waarvan het hersenweefsel moet worden genomen met isofluraan (uiteindelijke concentratie <0,1%).
OPMERKING: Andere anesthetica kunnen ook worden gebruikt. Gebruik van de narcose moeten voldoen aan de aanbevelingen en regels van de respectieve dier commissie. Zorg er altijd voor dat het dier is niet geïrriteerd of onder stress na het toevoegen vande verdoving. - Onthoofden het dier, opent de schedel en verwijder de hersenen zo snel mogelijk met de in referentie beschreven. 34,35.
- Breng de hersenen in gekoelde (4 ° C) kunstmatige cerebrospinale vloeistof belucht met een mengsel van carbogen gas met 95% O2 en 5% CO2.
- Isoleer het hersengebied die moeten worden bestudeerd.
OPMERKING: De parameters voor optimaal behoud en minimale inkorting van dendrieten en axonen van pre- en postsynaptische neuronen te behalen moet vooraf worden bepaald voor elke neurale verbinding en het ontwikkelingsstadium in onderzoek. In een optimaal ontleed hersenen slice, wordt de axon van de presynaptische neuron niet verplicht parallel aan de slice oppervlak te zijn. Veeleer moeten zij verwijzen naar de plakken met een kleine hoek. Het geldt voor de apicale dendriet van postsynaptische piramidale neuronen; Dit moet worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop. Dit is vooral belangrijk voor niet-lokale of translaminar synaptische verbindingen, bijv., waar pre- en postsynaptische somata meer dan 200 micrometer uit elkaar en de kans op dendritische en axonale inkortingen waarschijnlijk aanzienlijk hoger dan voor lokale verbindingen zijn. - Breng de hersenen naar de microtoom kamer. Op basis van empirische bevindingen worden verschillende extracellulaire slicing oplossingen gebruikt, afhankelijk van de leeftijd van het dier (zie tabellen 2 en 3; u nuttige informatie is ook te vinden onder ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Trim de hersenen tot het doelgebied zichtbaar is.
- Om plakjes te verkrijgen met een goede mobiele zichtbaarheid, gesneden 300-400 pm dikke plakjes hersenen als het dier volwassen is (> 3 weken). Als het dier onrijpe (1e tot 2e postnatale week muizen en ratten) segmenten kan worden gesneden tot een dikte van ~ 600-800 urn zonder wezenlijk afbreuk cel visibiliteit.
LET OP: Dit zal de stabiliteit van 'onvolwassen' plakjes te verbeteren en het aantal mogelijke inkortingen van lange-afstands dendritische en axonale zekerheden. - Breng segmenten van de microtoom kamer naar een incubatie kamer gevuld met snijden oplossing belucht met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2. Bewaar de segmenten in de incubatiekamer minstens 30 minuten tot 1 uur of bij kamertemperatuur of bij -30 ° C, afhankelijk van het soort experiment.
3. Paired patch-clamp-opname en biocytine Vullen
Afhankelijk van het type synaptische verbinding drie benaderingen gebruikt om synaptisch gekoppelde neuronen vinden. Als de verbinding kans is laag (zoals te verwachten voor de meest prikkelende verbindingen), gaat u als volgt te werk:
- Neuronale verbindingen met een lage connectiviteit
- Vul het pleister pipetten met een interne oplossing van het preparaat opgenomenTabel 4 Voor alle opnames in de gehele-cel configuratie toe biocytine bij concentraties tussen 3 -. 5 mg / ml van de interne (pipet) oplossing goede kleuringen voor de pre- en postsynaptische neuronen verkrijgen. Laat biocytine diffuse in de cel ten minste 15-30 minuten (afhankelijk van de grootte van de neuron).
OPMERKING: Voeg geen biocytine aan de oplossing die in de hieronder vermelde 'zoeken' pipetten. - Patch een vermeende postsynaptische neuron in de whole-cell-modus. Gebruik patch pipetten met een lange en slanke schacht. Dit vergemakkelijkt de manoeuvreerbaarheid van de pipet onder de doelstelling en vermindert bewegingsartefacten die optreden wanneer de elektrode wordt ingebracht in de slice.
- Dan, patch een potentiële presynaptische neuron in een cel bevestigd configuratie met behulp van een 'zoek' patch pipet van 8 - 10 MQ weerstand en een kleine tip diameter. Met deze pipetten oprichting van een 'losse' cel bevestigd patch. Fill het "zoeken" pipet met een inwendige oplossing waarin K + wordt vervangen door Na + (tabel 5) om geen neuronen depolariseren tijdens het zoeken naar een presynaptische cel.
OPMERKING: De 'losse' seal weerstand is niet in de GQ bereik, maar meestal rond de 30-300 MQ. - Houd de membraanpotentiaal onder de 'losse' zegel tot ongeveer -30 tot -60 mV in stroomtang modus. Dan passen grote stroom pulsen (0,2-2 nA) om een actiepotentiaal in het potentieel presynaptische cel ontlokken. Observeer deze actie potentieel als een klein aartje van de spanning reactie.
- Stel de stimulatie frequentie tot 0,1 Hz tot afbouw van een postsynaptische reactie te voorkomen. Met lagere stimulatiefrequenties wanneer het hersenweefsel zeer jonge of de synaptische verbinding niet erg betrouwbaar.
- Indien de "postsynaptische" neuron niet reageren op stimulatie van de geteste "presynaptische 'neuron, patch een nieuw neuron in 'losse' seal-modus. Niet in de plaats van de 'zoek' patch elektrode zolang de afdichting met een weerstand van> 30 MQ is gevestigd. Test tot 30 mogelijk presynaptische neuronen op deze manier.
OPMERKING: Om beschadiging van de neuron tijdens de zoekprocedure met losse patch clamp voorkomen, alleen voorzichtig zuigkracht moet worden toegepast om het zoeken pipet vergeleken met die toegepast op de whole-cell patch pipet. - Als stimulatie in de 'losse' zegel modus resulteert in een EPSP / IPSP met een latency <5 msec in de postsynaptische neuron verwijder het 'zoeken' pipet uit de presynaptische neuron.
- Vervang het 'zoeken' patch pipet met een patch elektrode gevuld met-biocytine bevatten, regelmatige interne oplossing. Zorgen deze opname patch pipet heeft een weerstand van 4 - 8 MQ; hoe groter de soma formaat hoe lager de weerstand elektrode kan zijn.
- Patch het presynaptischeneuron en opnemen in whole-cell, stroom-clamp-modus. Ontlokken actiepotentialen door de huidige injectie in de presynaptische neuronen en noteer de postsynaptische respons. Sla de gegevens op een computer voor latere off-line analyse.
- Vul het pleister pipetten met een interne oplossing van het preparaat opgenomenTabel 4 Voor alle opnames in de gehele-cel configuratie toe biocytine bij concentraties tussen 3 -. 5 mg / ml van de interne (pipet) oplossing goede kleuringen voor de pre- en postsynaptische neuronen verkrijgen. Laat biocytine diffuse in de cel ten minste 15-30 minuten (afhankelijk van de grootte van de neuron).
- Neuronale verbindingen met een hoge connectiviteit
LET OP: Voor neuronale microschakelingen met een hoge connectiviteit verhouding (> 30%) maken gebruik van een andere procedure om synaptische verbindingen te vinden. Deze procedure wordt hieronder beschreven en wordt vaak gebruikt voor remmende synaptische verbinding die hebben gemiddeld een hogere verhouding dan verbindingen prikkelende verbindingen 36. Het mag niet worden gebruikt wanneer de verbinding verhouding onder deze waarde.- Patch een presynaptische neuron direct in de whole-cell-modus. Vervolgens patch potentiële postsynaptische neuron, ook geheel celmodus. Beide cellen moet onder stroomklem controle. Ontlokken een actiepotentiaal in de presynaptische cel. Bewaken van de aspirant postsynaptische neuron voor een postsynaptic potentieel.
- In het geval dat het neuron niet een reactie op presynaptische stimulatie tonen, patchen een nieuw neuron in whole-cell-modus met behulp van een patch elektrode gevuld met regelmatige interne oplossing. Als er een verbinding wordt gevonden, hoeft de patch pipet niet veranderen, maar door te gaan met de opname. Ga dan verder zoals in stap 3.1.9.
- Neuronale verbindingen via gap-junctions
OPMERKING: Voor het zoeken van elektrische (gap-junction) aansluitingen gebruikt u de volgende procedure die is een aangepaste versie van die gebruikt worden voor lage waarschijnlijkheid verbindingen.- Patch een postsynaptische neuron in de whole-cell patch clamp-configuratie.
- Vervolgens patch een vermeende presynaptische neuron in de losse-seal configuratie (laag zegel weerstand van 30-300 MQ) met behulp van een 'zoek' patch pipet van 7-10 MQ weerstand. Deze pipet moet worden gevuld met de gewijzigde hoge Na + interne oplossing voor losse-seal stimulatie.
- Inject 100-300 msec lang hyperpolariserende huidige pulsen via de 'losse' zegel; de pipet commando potentieel moet worden ingesteld op ongeveer -60 tot -70 mV. Observeer een gap junction verbinding als dit stimulatie resultaten in een kleine hyperpolarizing reactie in het 'postsynaptische' neuron.
- Repatch het "presynaptische" neuron in de gehele-cel functie en ga verder zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Om een goede kleuring van de axonen en dendrieten processen te waarborgen, gebruik dan de onderstaande protocol gegeven. Dit protocol wordt beschreven in het kort hier echter een gedetailleerd protocol voor histochemische verwerking in ons laboratorium is gegeven in ref. 37.
4. Histochemische Processing
- Breng de hersenen slice met het paar synaptisch gekoppelde neuronen in een flacon met 4% paraformaldehyde opgelost in 0,1 M fosfaatbuffer en fixeren de plak gedurende 24 uur. Voor elektronenmicroscopie, fixeren de slice met 2,5% glutaraldehyde en 1% paraformaldehyde.
- Op de volgende dag, dragen de plakjes in normale fosfaatbuffer die geen fixeermiddel. Was segmenten met fosfaatbuffer gedurende 6-8 keer gedurende 10-15 minuten elk om overmaat fixeermiddel verwijderd.
- Incubeer plakken voor 20 min in een 3% H 2 O 2-oplossing in 0,1 M fosfaatbuffer bij de endogene peroxidase reactie minimaliseren. Observeren sterke formatie zeepbel. Zet de destructie tot geen verdere belletjes worden geproduceerd. Vervolgens spoel de plakken in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 6-8 keer (10 minuten elk) om alle overblijvende H 2 O 2 verwijderen.
- Immuuncytochemische en chromogene reacties
Visualisatie van biocytine gevulde neuronen is gebaseerd op een streptavidine-gebiotinyleerd mierikswortel peroxidase gekatalyseerde reactie met diaminobenzidine; Dit produceert een donkere neerslag die een scherpe vlek met een hoge ruimtelijke resolutie produceert. De volgende procedures worden toegepast voor de chromogene reactie <ol> - Bereid de ABC oplossing volgens het protocol van de fabrikant. Naar 14.55 ml fosfaatbuffer aangevuld met 150 ui 10% Triton X100 (Tabel 6, alleen voor lichtmicroscopie) en houden van de oplossing gedurende ongeveer 30 minuten in het donker. Incubeer segmenten in deze oplossing O / N voor gebruik.
- Incubeer segmenten in ABC oplossing op een schudder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en in het donker. Vervolgens houden plakjes O / N bij 4 ° C in een koelkast. De volgende ochtend, incubeer schijfjes bij kamertemperatuur een uur.
- Daarna afspoelen plakken minstens vier maal gedurende 10 minuten elk in fosfaatbuffer. Vervolgens incuberen op een schudinrichting gedurende 30 minuten in het donker in 2 ml van een nikkel geïntensiveerd 3-3'-diaminobenzidine oplossing (Tabel 7). Wees zeer voorzichtig bij het hanteren van diaminobenzidine en gebruik alleen onder de zuurkast; het zeer kankerverwekkend, zelfs bij zeer lage concentraties.
- Voeg 6,5 gl 3% H 2 O 2 de diaminobenzidine bevattendeoplossing. Toezien op de chromogene reactie onder een lichtmicroscoop tot bruin-zwart gebeitst neuronen zijn duidelijk zichtbaar. Vervolgens stopt de reactie onmiddellijk door wassen segmenten meerdere malen in fosfaatbuffer.
- Mount plakjes met lood neuronen op zelfklevende, silaan gecoate Histobond of gelatinized standaard object dia's.
- Houd de objectglaasjes in een vochtige kamer met ten minste 80% vochtigheid O / N. Op de volgende dag, laat de plakjes lucht drogen voor een verdere 10 min. Vóór inbedden overdracht dia in oplossingen met toenemende concentraties ethanol (20-100%) om ze te drogen.
OPMERKING: Het droogproces moet langzaam anders verstoringen in de dendritische en axonale processen zijn te verwachten 37. Als een alternatief inbedding procedure wordt gekozen, bijvoorbeeld een met de glycerol gebaseerde Moviol een dehydratatie niet nodig; maar dit is waarschijnlijk resulteren in een inhomogeen compressie van de slice en dus een vertekend neuronale morphology. - Tenslotte Incubeer 10 minuten in xyleen, verankeren de plakjes in een hydrofoob inbedding medium voor lichtmicroscopie en plaats een ultradunne dekglaasjes bovenaan. Laat slides drogen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
5. Neuronale Wederopbouw en Synaptic Contact Localization
- Onderzoek slides met biocytine gelabelde neuronen onder een lichtmicroscoop uitgerust met een 60X / 100x olie-immersie objectief en een condensor met een hoge numerieke apertuur voor optimale ruimtelijke resolutie. Zorg ervoor dat axonale boutons en dendritische stekels zijn duidelijk zichtbaar.
- Trace neuronen of synaptically gekoppeld neuron paren met behulp van een commercieel neuron tracing systeem (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur) naar 3D neuronale reconstructies te verkrijgen. Voeren tracing handmatig onder voortdurende visuele inspectie om zelfs kleine axonale of dendritische zekerheden te detecteren. Voor gepaarde opnames van synaptically gekoppeld neuronen handleiding tracing is nog steeds de methode vankeuze, omdat de toekenning van bijvoorbeeld een axonale profiel om ofwel de pre- of postsynaptische neuron vereist substantiële reconstructie ervaring.
- Indien nodig, maken tellingen van axonale boutons en / of dendritische stekels. Omdat stekels of zelfs subtypes wervelkolom en axonale boutons een specifieke verdeling en dichtheid kan vertonen met betrekking tot bijvoorbeeld corticale laag of gebied, kan dit bijdragen tot neuronale celtypen karakteriseren.
- Voor synaptically gekoppeld neuron paren, controleer dan de presynaptische axon en postsynaptische dendrieten voor close apposities op het hoogste vergroting beschikbaar. Observeer een axonale bouton en een postsynaptische dendritische wervelkolom of as is in hetzelfde focal plane kan worden beschouwd als een vermeende synaptische contact. Markeer deze contactpersoon bij de wederopbouw.
- Corrigeer de neuronale reconstructies voor krimp in alle drie ruimtelijke dimensies in het desbetreffende gedeelte van de tracing programma.
OPMERKING: Tijdens fixatie, histochemische verwerkingen uitdroging aanzienlijke mechanische vervorming en krimp optreden; dit zal axonen en dendrieten lengte metingen beïnvloeden en ernstig vervormen hun ruimtelijke opstelling. Krimp correctiefactoren voor de inbeddingmedium zijn ~ 1.1 voor x en y richtingen en ~ 2.1 voor de z-richting 37. - Voor een kwantitatieve morfologische analyse gebruik maken van een data-analyse programma voor de neurofysiologie (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gepaarde opnamen de voorkeursmethode voor een grondige karakterisering van morfologisch geïdentificeerd uni- of bidirectionele synaptische verbindingen alsmede gap junction (elektrische) aansluitingen (figuur 1). Een voorbeeld van een gepaarde opname laag 4 van de somatosensorische cortex vat wordt getoond in figuur 1A. Zowel unidirectionele prikkelende en remmende synaptische verbindingen worden gekarakteriseerd (Figuur 1B, C). Verder gepaarde opnames laten opnemen bidirectionele synaptische verbindingen, dwz van verbindingen waarin zowel neuronen in een paar zijn pre- en postsynaptische elkaar. Dit wordt geïllustreerd in figuur 1D, waarbij opnamen van een remmende interneuronen en een exciterende neuron geeft. Opwekken van een actiepotentiaal in de prikkelende neuron (rode sporen) resulteert in een EPSP in de postsynaptische remmende interneuron (zwarte sporen). Echter, wanneer een actiepotentiaal is evoked in de interneuronen, kan een IPSP opgenomen in de prikkelende neuron. Figuur 1E toont dat het ook mogelijk opnemen neuronen gekoppeld via gap junction of via een gap junction en een chemische synaps. Wederzijdse en gap junction verbindingen kunnen alleen worden geïdentificeerd door gepaarde elektrofysiologische opnames tot nu toe, maar niet door een andere techniek.
De combinatie van biocytine vulling van gekoppelde neuronen via de patch pipet en de elektrofysiologische opnames maakt een correlatie van morfologische eigenschappen van de neuronen te synaptische eigenschappen. Na histochemische verwerkingsneuronen zichtbaar donkere structuren in het gefixeerd segment (Figuur 2A). Daarna wordt het opgenomen neuronale cel paar kan morfologisch worden gereconstrueerd en de neuronale celtypen kunnen worden geïdentificeerd. Bovendien is het mogelijk om het aantal en de locatie van putatieve synaptische contacten (Figuur 2A rechter panelen en Figur identificerene 2B inzet). Het neuron pair weergegeven in figuur 2B is wederzijds verbonden en dus synaptische contacten gelegd op zowel neuronen. In onze handen werden vermeende licht microscopisch geïdentificeerd synaptische contacten bevestigd waar synaptische contacten met de elektronenmicroscoop met 80 - nauwkeurigheid 16,21,26 90%.
Figuur 3 toont een voorbeeld van een gepaarde opname van een presynaptische piramidale neuron in neocortical laag 6 van het vat cortex en een exciterende stekelige neuronen in laag 4. Deze translaminar neuronale microcircuit heeft een lage waarschijnlijkheid verbinding zelf maar wel met gebruik van de zoekprocedure stappen 3.1.1 - 3.1.9 voor neuronale verbindingen met een lage connectiviteit. Met de gepaarde opnametechniek is het mogelijk synaptische verbindingen identificeren met een zeer lage connectiviteit is voor bepaalde lange afstand translaminar verbindingen (dit voorbeeld) of verbindingen tussen neurons zich in verschillende corticale 'kolommen' (inter-zuilvormige synaptische verbindingen).
Figuur 1. Gekoppelde opnamen van synaptisch gekoppelde celparen. (A) Links, IR-DIC beeld van een brein slice. Rechts, een interneuron (boven) en een prikkelende neuron (onder). (B) A presynaptische actiepotentiaal (boven) in een prikkelende neuron ontlokt een monosynaptic prikkelende postsynaptische potentiaal (EPSP) in een andere prikkelende neuron (onder). (C) een actiepotentiaal (boven) in een presynaptische remmende interneuron roept een monosynaptic remmende postsynaptische potentiaal (IPSP) in een prikkelende neuron (onder). (D) een actiepotentiaal (linksboven) in een presynaptische prikkelende neuron roept een EPSP (linksonder) in een remmende interneuron. Op zijn beurt, een actiepotentiaalin de remmende interneuron (rechtsboven) lokt een IPSP in de prikkelende neuron (rechtsonder). (E) Een reeks van hyper- en depolariserende spanningsstappen uitgelokt door de huidige injecties in een neuron (linksboven) wordt weerspiegeld in een gap-junction gekoppelde tweede neuron (linksonder). Bovendien, een presynaptische actiepotentiaal (rechtsboven) in de eerste neuron roept een vroege klein depolarisatie (aartjes, bijvoegsel) gevolgd door een late diepe hyperpolarisatie (IPSP) in de membraanpotentiaal van het tweede neuron (rechtsonder). Ook schaalbalken in (B) van toepassing zijn op (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Identificatie van synaptische contacten en morfologische reconstruction van-biocytine gevulde cel paren. (A) Links, low-power microfoto van een onderling gekoppelde cel paar bestaande uit een stekelige stellaatcellen en een fast-stekelige interneuron in laag 4 die waren gevuld met biocytine tijdens de opname. Licht microscopisch geïdentificeerd vermeende prikkelende synaptische contacten tussen de presynaptische stekelige neuron en de postsynaptische interneuron zijn gemarkeerd door groene stippen. Vermeende wederzijdse remmende synaptische contacten worden aangegeven met blauwe stippen. Rechts, high-power beelden van synaptische contacten. Groene open cirkels, prikkelende contacten; blauw open cirkels, remmende contacten. Layer grenzen werden bepaald door de cytoarchitectonic structuur van vlekken hersenplakje onder lage kracht microscoop. (B) Neurolucida reconstructie van dezelfde cel pair getoond in (A) en figuur 1C. Blauw, interneuron axon; rood, interneuron soma en dendrieten; groene, stekelige neuron axon; wit, stekelige neuron soma en dendrieten. De inzettoont de somatodendritische compartimenten van de pre- en postsynaptische neuronen met het vermeende synaptische contacten. Vat contouren werden geïdentificeerd in de low power bright-field microfoto gemaakt van de acute slice hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Een vertegenwoordiger synaptische verbinding met een zeer lage connectiviteit verhouding. (A) Een presynaptische actiepotentiaal (boven) in een laag 6 Piramidecellen roept een monosynaptic prikkelende postsynaptische potentiaal (onderkant) in een laag 4 ster piramidale neuron. Let op de lange latentie (> 3.0 msec) van de trans-laminaire verbinding vergeleken met die van de lokale intra-laminaire verbindingen (≈1.0 msec). (B) Postsynaptische response van laag 4 sterren piramidale neuron tot twee actiepotentialen bij 10 Hz opgewekt in een laag 6 piramidale cellen. Let op de korte termijn vergemakkelijken van deze verbinding in vergelijking met de korte termijn depressie lokale verbindingen (gegevens niet getoond). (C) Extended scherptediepte beeldvorming van dezelfde verbinding als in (A, B). Inzet, de somato / dendritische domein van een laag 4-sterren piramidale neuron. Let op de aanwezigheid van een prominente apicale dendriet gemarkeerd met een pijl. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| mM | g / l | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 2 | 0.294 |
| MgCl2 | 1 | 0.095 |
| Osmolariteit ~ 310 mOsmol / L | ||
| Belucht met 95% O2 en 5% CO2 | ||
Tabel 1. Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor perfusie tijdens het opnemen.
| mM | g / l | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-pyruvaat | 2 | 0.22 |
| Ascorbinezuur (vitamine C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolariteit ~ 310 mOsmol / L | ||
| Belucht met 95% O2 en 5% CO2 | ||
Tabel 2. extracellulaire oplossing voor acute hersenen plakjes onvolwassen dieren.
| mM | g / l | |
| Sucrose | 206 | 70,51 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-pyruvaat | 2 | 0.22 |
| Ascorbinezuur (vitamine C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolariteit ~ 310 mOsmol / L | ||
| Belucht met 95% O2 en 5% CO2 | ||
Tabel 3. extracellulaire oplossing voor acute plakjes hersenen van volwassen dieren (sucrose zoutoplossing).
| mM | g / l | g / 50 ml | |
| K-gluconaat | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Phosphocreatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP, Mg2 + | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Stel de pH tot 7,3 met KOH | |||
| Osmolariteit -300 mOsmol / L | |||
| Voeg 3-5 mg / ml biocytine | |||
Tabel 4. Lage chloride pipet oplossing.
| mM | g / l | g / 50 ml | |
| Na-gluconaat | 105 | 22.92 | 1.146 |
| NaCl | 30 | 1.76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Phosphocreatine | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP, Mg2 + | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Stel de pH tot 7,3 met NaOH | |||
| Osmolariteit -300 mOsmol / L | |||
Tabel 5. Hoge Napipet oplossing zoeken synaptisch gekoppelde neuronen.
| verhouding | ml | |
| reagens A | 1 | 0.15 |
| reagens B | 1 | 0.15 |
| 10% Triton X100 | 1 | 0.15 |
| 0,1 M fosfaatbuffer | 97 | 14.55 |
| Gedurende 30 minuten in het donker voor gebruik | ||
Tabel 6. ABC oplossing voor histochemische reacties.
| gewicht | volume | |
| 3-3'-diaminobenzidine | 10 mg | - |
| 0,1 M fosfaatbuffer | - | 20 ml |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO4) 2 | - | 5-10 ul |
| 1% CoCl2 | - | 5 gl |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 en 1% CoCl2 wordt druppel voor druppel toegevoegd onder roeren van de oplossing. | ||
Tabel 7. Oplossing voor diaminobenzidine (DAB) reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde prikkelende en / of remmende neuronen een zeer veelzijdige benadering voor de studie van neuronale microschakelingen. Niet alleen heeft deze benadering mogelijk maken om schatten synaptische verbindingen tussen soorten neuronen, maar maakt ook de bepaling van de functionele eigenschappen van de verbinding en de morfologie van pre- en postsynaptische neuronen. Bovendien kunnen agonist en / of antagonist eenvoudig worden toegepast op neuronen in slice preparaat. Hierdoor kan men de effecten van neuromodulatoren studie over de eigenschappen van synaptische transmissie 32 of een diepgaande karakterisering van een gedefinieerde unitaire synaptische verbinding via bijvoorbeeld quantale analyse van synaptische afgifte 16,17,38,39. Het vinden van de chemische en / of elektrische (gap junction) synaptische verbindingen is de meest kritische fase van dit protocol. We hebben daarom opgesomd verschillende benaderingen voor het vinden synaptische verbindingen, afhankelijk van de verbinding en de verhoudingtype (chemisch / elektrisch).
Een groot nadeel van slice preparaat is het vaak aanzienlijke afknotting lange afstand axonale uitsteeksels zodat slechts kleine delen van de totale axonale lengte van het axon teruggewonnen. Voor sommige piramidale celtypen, de mate van afknotting kan tot 90% of zelfs meer bij het nemen uitsteeksels andere corticale gebieden en subcorticale gebieden wordt gehouden. Dit maakt de slice preparaat geschikt voor de studie van synaptische verbindingen tussen neuronen de cellichamen waarvan meer dan> 300 urn uit elkaar. Echter, in acute slice voorbereiding, lokale axonale projecties, in het bijzonder die van lokale interneuronen zijn over het algemeen hersteld met een relatief lage mate van dendritische en axonale truncatie (~ 10% of minder) als gevolg van de beperkte horizontale en verticale vlak overspanning van hun axonale priëlen . Verbindingen waarbij deze soorten neuronen kan derhalve worden gekenmerkt door een hoge graad van nauwkeurigheid en reliabiliteit en de opbrengst grotendeels correct connectiviteit schattingen. Met uitzondering van deze lokale synaptische verbindingen absolute waarden voor verbindingen verhoudingen tussen twee typen neuronen verkregen slice preparaten zeer problematisch, met name voor neuronen met grote inter-somatische afstanden in translaminar of niet-lokale, lange afstand intra- laminaire synaptische verbindingen . Dit probleem wordt verergerd wanneer snijden voorwaarden niet geoptimaliseerd voor een bepaalde synaptische verbinding op een bepaalde leeftijd. Voor realistischere verbinding geschatte nieuwe methodologieën zoals dichte elektronenmicroscopische reconstructies 40 en structurele axo dendritische overlap 41 ontwikkeld. Maar zelfs deze technieken moeten rekening houden met de grote verscheidenheid van remmende interneuronen ook exciterende neuronen.
Een bijkomend probleem met connectiviteit schattingen is dat distale synaptische contacten, bijvoorbeeld die op apicale plukje piramidale neuronen, kanontsnappen detectie. Gemeten in de soma de amplitude van de synaptische respons is zeer klein en zal waarschijnlijk verdwijnen in de ruis (Qi et al., 2014 indiening). Echter, dit soort problemen niet beperkt tot de gepaarde opname benadering maar ook bij andere technieken synaptische connectiviteit bestuderen.
De laatste licht geïnduceerde activering van neuronale microschakelingen (dwz door foto-afgifte gekooide glutamaat of door activering van channelrhodopsin) jaar is gebruikt om neuronale verbindingen te onderzoeken, zelfs op grotere schaal 42-52. Echter, met deze optische benaderingen is het niet mogelijk om de structurele eigenschappen van het presynaptische neuron soort identificeren. Bovendien kan het aantal en de plaats van synaptische contacten die door een neurale verbinding niet worden geïdentificeerd, althans tot op heden. Gepaarde opnamen, anderzijds, kan de karakterisering van zowel pre- en postsynaptische Neurop types in een synaptische microschakeling. Dit is bijzonder belangrijk omdat veel studies hebben aangetoond dat zowel GABAerge interneuronen en exciterende neuronen zijn zeer divers met betrekking tot hun morfologie en synaptische fysiologie 53-56. De identificatie van zowel pre- en postsynaptische neuronen is een voorwaarde voor de beschrijving van een synaptische verbinding 57. Tenslotte gepaarde opnames toestaan dat de opname van verschillende configuraties van synaptische verbinding (wederkerige verbindingen, met samen gap junctions en chemische synapsen). Daarom zal de gepaarde opnametechniek een belangrijke benadering voor het bestuderen van neuronale microschakelingen blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
