Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

Published: January 10, 2015 doi: 10.3791/52358
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

Abstract

השילוב של הקלטות מהדק תיקון משני (או יותר) נוירונים בשילוב synaptically (הקלטות לזווג) בהכנות פרוסה מוח חריפות עם מילוי biocytin תאיים בו זמנית מאפשר ניתוח מתואם של התכונות המבניות והתפקודיות שלהם. בשיטה זו אפשר לזהות ולאפיין את שני נוירונים טרום postsynaptic על ידי המורפולוגיה שלהם ודפוס תגובת אלקטרו. הקלטות לזווג מאפשרות ללמוד את דפוסי הקישוריות בין תאי העצב האלה, כמו גם את המאפיינים של שני שידור סינפטי הכימי וחשמלי. הנה, אנחנו נותנים תיאור צעד-אחר-צעד של ההליכים הנדרשים להשגת הקלטות לזווג אמינות יחד עם התאוששות אופטימלית של מורפולוגיה תא העצב. אנו מתארים כיצד זוגות של הנוירונים המחוברים דרך סינפסות כימיות או צמתים פער מזוהים בהכנות פרוסה מוח. אנו מתארים כיצד תאי עצב משוחזרים להשיג מורפולוגיה 3D של dendritic ותחום axonal ואיך הסינפטי קשר מזוהה ומקומי. נדונו גם באזהרות ומגבלות של טכניקת ההקלטה לזווג, בפרט אלה הקשורים לtruncations הדנדריטים וaxonal במהלך תקופת ההכנה של פרוסות המוח כי אלה חזקים משפיעים הערכות קישוריות. עם זאת, בגלל הרבגוניות של גישת ההקלטה לזווג הוא יישאר כלי רב ערך באפיון היבטים שונים של העברת הסינפטית בשבבים עצביים מזוהים במוח.

Introduction

שבבים עצביים בין שני תאי עצב בשילוב synaptically הם אבני הבניין של רשתות בקנה מידה גדולה במוח והם היחידות הבסיסיות של עיבוד מידע הסינפטי. תנאי מוקדם לאפיון של שבבים עצביים כזו הוא לדעת את המורפולוגיה ותכונות פונקציונליות של שני נוירונים השותף טרום postsynaptic, הסוג של החיבור הסינפטי (ים) ואת המבנה שלה ומנגנון תפקודי. עם זאת, במחקרים רבים של קשרים סינפטיים לפחות אחד מתאי העצב בmicrocircuit אינו מאופיין היטב. זה נובע מפרוטוקולי הגירוי יחסית הנוקבים המשמשים לעתים קרובות במחקרים של קישוריות הסינפטי. לכן, התכונות המבניות ותפקודיות של נוירון presynaptic הם גם לא זיהו כלל או רק במידה קטנה למדי (כלומר, הביטוי של חלבוני סמן וכו '). הקלטות מותאמים בשילוב עם מכתים תאיים על ידי סמנים שלuch כמו biocytin, Neurobiotin או צבעי ניאון מתאים יותר ללימוד שבבים עצביים קטנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור פרמטרים רבים מבניים ותפקודיים של חיבור הסינפטי זיהה מורפולוגית באותו הזמן.

מה שנקרא חיבורים 'אחידים' monosynaptic בין שני תאי עצב נחקרו בשני אזורים במוח בקליפת המוח וקורטיקליים 1-10 באמצעות הכנות פרוסה חריפות. בתחילה, microelectrodes החדה שימשה בניסויים אלה; מאוחר יותר, הקלטת מהדק התיקון הועסקה כדי להשיג הקלטות של אותות הסינפטי עם רמת רעש נמוכה ורזולוציה של זמן השתפרה.

מראש טכניים משמעותיים היה השימוש בניגוד להפרעות ההפרש אינפרא אדום (IR-DIC) אופטיקה 11-14, טכניקה מיקרוסקופית ששיפרה באופן משמעותי את הנראות וזיהוי של תאי עצב במוח הפרוסה כך שהוא הפך t האפשריo להשיג הקלטות מקשרים סינפטיים מזוהים מבחינה ויזואלית 15-17. באופן כללי, הקלטות לזווג נעשות בהכנות פרוסה חריפות; רק מעט מאוד פרסומי הקלטות דיווח זמינות מהנוירונים מחוברים synaptically in vivo 18-20.

היתרון החשוב ביותר של הקלטות לזווג הוא העובדה שאפיון פונקציונלי יכול להיות משולב עם ניתוח מורפולוגי בשני האור ורמה מיקרוסקופית אלקטרונים (ראה, למשל., 7,16,21). לאחר עיבוד histochemical, המורפולוגיה הדנדריטים וaxonal של זוג נוירון מחובר synaptically היא לייחס. בהמשך לכך, ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות כגון אורך, צפיפות מרחבית, אורינטציה, הסתעפות דפוס וכו 'פרמטרים אלה עשויים לאחר מכן לספק בסיס לסיווג אובייקטיבי של קשר הסינפטי ספציפי. יתר על כן, בניגוד לרוב הטכניקות אחרות המשמשות ללימוד connecti העצביהקלטות vity, לזווג גם לאפשר זיהוי של קשרים סינפטיים לקשרים סינפטיים יחידתי. ניתן לעשות זאת ישירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ אלקטרונים 16,21-27 או באמצעות ההדמיה סידן 28,29 של קוצים הדנדריטים. עם זאת, עם הגישה השנייה רק ​​מעורר אבל ניתן ללמוד לא קשרים מעכבים כפי שהוא דורש זרימת סידן באמצעות ערוצי קולט postsynaptic.

בנוסף לניתוח מפורט של העברת הסינפטית בהקלטות microcircuit לזווג עצביות מוגדרות גם לאפשר המחקר של כללי פלסטיות הסינפטית 30,31 או - בשילוב עם יישום אגוניסט / אנטגוניסט - האפנון של שידור סינפטי על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון אצטילכולין 32 ואדנוזין 33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להוראה של האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים, בעלי החיים הגרמנים הרווחה Act (Tierschutzgesetz) וההנחיות של האיגוד אירופאי בעלי חיים במעבדת מדע האגודה.

1. סט-אפ לאלקטרופיזיולוגיה

לפני תחילת הקלטה לזווג, הגדרת אלקטרופיזיולוגיה צריכה להיות בנויה. בקצרה כיצד הגדרה כזו מורכבת היא כדלקמן:

  1. התקן שולחן נגד רעידות שבמיקרוסקופ, מניפולטורים וכל הציוד האחר יוצבו.
    הערה: רטט או כל סוג של תנועה אחרת צריך להיות קטן ככל האפשר בעת הקלטה מקשרים סינפטיים, כי זה דורש שינוי של טפטפות (חיפוש אלקטרודה הוחלף על ידי אלקטרודה הקלטה).
  2. מניחים כלוב פאראדיי סביב השולחן נגד הרעידות כדי להפחית את הרעש חשמלי. לחבר את כל הציוד בתוך ca פאראדייge עם הקרקע החשמלית.
  3. התקן מיקרוסקופ עם ציר מוקד ממונע המבוסס על שולחן XY ממונע על השולחן נגד הרעידות על פי הנחיות היצרן. זה מאפשר לנוע באופן מהימן את המיקרוסקופ לנוירונים שאינם באותו שדה הראייה כפי שהוא במקרה של חיבורי translaminar בהניאוקורטקס.
  4. התקן מצלמת וידאו על יציאת המצלמה של המיקרוסקופ ולחבר אותו לאנלוגיים ודיגיטליים או מסכי / לצפות בהכנת פרוסה והתנועה של אלקטרודות. השתמש במצלמה, שניתן להעביר בין נמוך והגדלת הספק גבוה כדי להשיג סקירה ותמונת תקריב, בהתאמה, של צמד תאים העצבי בשילוב synaptically. זה גם עוזר לשלוט על התנועה של אלקטרודות התיקון.
  5. התקן שולחן דגימה המכיל הבלעה לחדר האמבטיה (נקדח בבית מהבלוק פרספקס) להכנת פרוסה המוח. שולחן דגימה זה לא חייב להיות מחובר למיקרוסקופ, כלומר, חייב להיות קבוע לשולחן האוויר ומיקרוסקופ צריך להיות יכולת תמרון מתחתיה.
  6. הר שני (או יותר אם נדרש) micromanipulators דיוק גבוה שניתן להעביר בכל שלושת הממדים. להתקין תיקון מהדק קדם מגבר על מניפולטורים ולחבר אותם למגבר הראשי.
    הערה: אם ניתן להתקין מניפולטורים נוספים הנדרשים לדוגמה, יותר משני מגברים מראש, אלקטרודות גירוי תאיים, מערכות להולכת תרופות, וכו '
  7. מניחים את חדר האמבטיה בטבלת הדגימה. התקן כניסה ויציאת פתרון ולחבר אותם למערכת זלוף.
  8. השתמש במשאבת peristaltic לשמור זלוף של חדר ההקלטה עם נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF; טבלת 1) בקצב זרימה יציב של 4-6 מיליליטר / דקה לכדאיות פרוסה אופטימלית.
    הערה: אל תחרוג קצב זרימה זה כמשמעותי זה יגרום למערבולת בASCF ולכן תנועה של הפרוסה. התקן בעלים לבדיקת הטמפרטורה ואלקטרודה קרקע Ag / AgCl על שולחן הדגימה. זה הכרחי כדי לאפשר הבדיקה ואלקטרודה כדי לדגום את האמבטיה בחדר.
  9. לנראות טובות של נוירונים בהכנת פרוסה להשתמש תאורת אינפרא אדום במיקרוסקופ. הפעולה זו מפחיתה את עקיפת אור ולכן טשטוש תמונה. ודא שמיקרוסקופ מצויד באופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת כדי להשיג "הדמיה כמו-3D'. זה יעזור לי תיקון תאי עצב ומאפשר מיקוד נוירונים עמוקים בפרוסה (60 מיקרומטר או עמוק יותר).
  10. במהלך הניסוי, לשמור על פרוסות מוח בתא ניסוי עם coverslip זכוכית בתחתית. הנח 'נבל פלטינה' בחלק העליון של הפרוסה לפרוסות למנוע מצפים. נבל פלטינה עשוי בצורת U חוט פלטינה שטוחה, עם מחרוזות של חוט דנטלי מודבקות על גבי זה.
  11. שמור ACSF מרוסס הפרוסה בטמפרטורה של 32 - C ° 35 כדי להבטיח optשליטת imal של חמצון וpH. ניתן לעשות זאת על ידי חימום הפתרון עם מכשיר פלטייה המותקן קרוב לזרם ACSF לתוך תא האמבטיה.
    הערה: כיסוי דק במיוחד שימוש מחליק כך שגם מעבי מיקרוסקופ עם צמצם מספרי גבוה ומרחק עבודה קצר יכולים להיות ממוקדים בדגימה. זה הכרחי לתאורה אופטימלית של הפרוסה.
    לתמונה ותיאור של הגדרת אלקטרופיזיולוגיה מותאמת להקלטות לזווג בהכנת פרוסה המוח ראה איור 4 בRef. 34.

2. מוח Slice הכנה

  1. במתינות להרדים את החיה שממנה רקמת המוח צריך לקחת עם isoflurane (ריכוז סופי <0.1%).
    הערה: ניתן להשתמש גם הרדמה אחרות. שימוש בהרדמה צריכה לעמוד בהמלצות הוועדה בבעלי החיים המתאימות וכללים. ודא תמיד שבעלי החיים הוא לא מגורה או תחת לחץ לאחר הוספהההרדמה.
  2. לערוף את החיה, לפתוח את הגולגולת ולהסיר את המוח במהירות אפשרית באמצעות ההליך המתואר בשופטים. 34,35.
  3. העבר את המוח לנוזל מקורר (4 מעלות צלזיוס) מלאכותי השדרה מוגזים בתערובת של גז carbogen עם 95% O 2, 5% CO 2.
  4. לבודד את האזור במוח שיש ללמוד.
    הערה: הפרמטרים להשגת שימור אופטימלי ועיצור מינימאלי של דנדריטים והאקסונים של תאי עצב טרום postsynaptic צריכה להיקבע מראש עבור כל חיבור עצבי ושלב ההתפתחותי תחת חקירה. בפרוסת מוח גזור בצורה אופטימלית, האקסון של הנוירון presynaptic אינו נדרש להיות מקביל למשטח הפרוסה. במקום זאת, הם צריכים להצביע לפרוסות עם זווית רדודה. חל על דנדריט פסגת פירמידה של נוירונים postsynaptic; זה צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ האור. הדבר חשוב במיוחד עבור המים שאינם מקומי או tקשרים סינפטיים ranslaminar, כלומר., שבו somata טרום postsynaptic יותר מ -200 מיקרומטר לגזרים והסתברות truncations הדנדריטים וaxonal עשויה להיות גבוה יותר באופן משמעותי מאשר לחיבורים מקומיים.
  5. העבר את המוח לתא microtome. בהתבסס על ממצאים אמפיריים, פתרונות חיתוך תאי שונים משמשים בהתאם לגילו של בעל החיים (ראה לוחות 2 ו -3; ניתן למצוא גם מידע מועיל תחת 'http://www.brainslicemethods.com/').
  6. חתוך את המוח עד אזור היעד הוא גלוי.
  7. כדי לקבל פרוסות עם נראות תא טובות, לחתוך 300 - פרוסות מוח עבות מיקרומטר 400 אם בעל החיים בוגר (> 3 שבועות). אם בעל החיים הוא לא בוגר (st 1 עד 2 nd שבוע לעכברים וחולדות לאחר לידה) פרוסות ניתן לחתוך עד עובי של ~ 600-800 מיקרומטר ללא visib תא באופן משמעותי פוגע בility.
    הערה: זה ישפר את היציבות של פרוסות 'בשלה' ולצמצם את מספר truncations האפשרי של הדנדריטים ארוך טווח ובטחונות axonal.
  8. העבר את הפרוסות מתא microtome לתא דגירה מלאות פתרון חיתוך מוגזים בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2. שמור את הפרוסות בתא הדגירה במשך שעה לפחות 30 דקות עד 1 או ב RT או ב ~ 30 ° C, בהתאם לסוג של ניסוי.

3. מותאמת Patch-קלאמפ הקלטה ומילוי Biocytin

בהתאם לסוג של חיבור הסינפטי שלוש גישות שונות משמשות לאיתור תאי עצב בשילוב synaptically. אם הסתברות החיבור היא נמוכה (כפי שניתן לצפות לחיבורים מעוררים ביותר), פעל באופן הבא:

  1. קשרים עצביים עם קישוריות נמוכה
    1. מלא את pipettes התיקון עם פתרון פנימי של הרכב הרשוםבלוח 4 לכל ההקלטות בתצורה כל התא להוסיף biocytin בריכוזים בין 3 -. 5 מ"ג / מיליליטר לפתרון הפנימי (פיפטה) כדי להשיג תוצאות טובות לצביעת תאי העצב טרום postsynaptic. בואו biocytin מפוזר לתוך התא לפחות 15 - 30 דקות (תלוי בגודל של תא העצב).
      הערה: אל תוסיף biocytin לפתרון בשימוש בטפטפות 'חיפוש' שהוזכר להלן.
    2. תיקון תא עצב פוסט-סינפטי המשוערת במצב כל התא. השתמש בטפטפות תיקון עם שוק ארוך ודק. זה מקל על התמרון של פיפטה תחת המטרה ומפחית חפצי תנועה שעלולה להתרחש כאשר האלקטרודה הוא הציג בפרוסה.
    3. לאחר מכן, תיקון נוירון presynaptic פוטנציאלי בתצורה המצורפת תא באמצעות פיפטה 'חיפוש' תיקון של 8 - 10 התנגדות MΩ וקוטר טיפ קטן. עם טפטפות אלה להקים תיקון מצורף תא "חופשי". Fill פיפטה 'החיפוש' עם פתרון פנימי שבי K + הוא הוחלף על ידי Na + (לוח 5) על מנת שלא depolarize נוירונים במהלך חיפוש אחר תא presynaptic.
      הערה: התנגדות החותם "חופשית" היא לא בטווח GΩ אבל בדרך כלל סביב 30-300 MΩ.
    4. החזק את פוטנציאל הממברנה תחת החותם "החופשי" לכ -30 ל -60 mV במצב מהדק נוכחי. לאחר מכן, החל פולסים נוכחי גדול (0.2-2 Na) כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא presynaptic הפוטנציאלי. שים לב פוטנציאל פעולה זו כspikelet קטן בתגובת המתח.
    5. הגדר את תדירות גירוי 0.1 הרץ כדי למנוע מוזנח של תגובת פוסט-סינפטי. שימוש בתדרי גירוי נמוכים יותר במקרה רקמת המוח היא מאוד לא בוגרת או החיבור הסינפטי לא מאוד אמינה.
    6. במקרה נוירון "postsynaptic 'אינו מגיב לגירוי של neu' presynaptic 'נבדקרון, תיקון נוירון חדש במצב חותם "חופשי". אינו מחליף את האלקטרודה תיקון 'חיפוש' כל עוד את החותם עם התנגדות של> 30 MΩ היא הוקמה. לבדוק עד 30 נוירונים פוטנציאל presynaptic בדרך זו.
      הערה: כדי למנוע נזק לתאי העצב במהלך חיפוש ההליך עם מהדק תיקון רופף, רק בעדינות יניקה צריכה להיות מוחלת על חיפוש פיפטה לעומת שחל על פיפטה התיקון כל התא.
    7. אם גירוי בתוצאות "חופשיות" מצב החותם בEPSP / IPSP עם חביון <5 אלפית שני בנוירון postsynaptic להסיר את פיפטה 'חיפוש' מתא עצב presynaptic.
    8. החלף את פיפטה 'חיפוש' התיקון עם אלקטרודה תיקון מלא פתרון פנימי המכיל biocytin, רגיל. ודא פיפטה תיקון הקלטה זו יש התנגדות של 4-8 MΩ; גדול יותר גודל סומה נמוך התנגדות האלקטרודה יכולה להיות.
    9. תיקון presynapticנוירון ולהקליט בכל התא, במצב נוכחי מהדק. לעורר פוטנציאל פעולה על ידי הזרקה נוכחית בתאי עצב presynaptic ולהקליט את תגובת postsynaptic. לאחסן את הנתונים במחשב לניתוח מאוחר יותר off-line.
  2. קשרים עצביים עם קישוריות גבוהה
    הערה: לשבבים עצביים עם יחס גבוה קישוריות (> 30%) להשתמש בהליך שונה כדי למצוא קשרים סינפטיים. הליך זה מפורט להלן ומשמש לעתים קרובות לחיבור מעכב הסינפטי שיש לי בממוצע יחס קישוריות גבוהה יותר מחיבורים מעוררים 36. אין להשתמש בזה כאשר יחס הקישוריות נופל מתחת לערך זה.
    1. תיקון תא עצב presynaptic ישירות במצב כל התא. לאחר מכן, תיקון נוירון postsynaptic פוטנציאלי, גם במצב תא כולו. שני התאים צריכים להיות בשליטת מהדק הנוכחית. לעורר פוטנציאל פעולה בתא presynaptic. צג נוירון postsynaptic הפוטנציאלי לpostsyפוטנציאל naptic.
    2. במקרה נוירון לא מראה תגובה לגירוי presynaptic, תיקון נוירון חדש במצב כל התא באמצעות אלקטרודה תיקון מלאה פתרון פנימי קבוע. אם חיבור נמצא, אינו משנה את פיפטה התיקון אך להמשיך בהקלטה. לאחר מכן, להמשיך כמו בשלב 3.1.9.
  3. קשרים עצביים באמצעות פער-צמתים
    הערה: כדי לחפש את חיבורי חשמל (פער צומת) השתמש בהליך הבא שהוא גרסה שונה של זה המשמש לחיבורי הסתברות נמוכה.
    1. תיקון תא עצב פוסט-סינפטי בתצורת מהדק תיקון כל התא.
    2. בהמשך לכך, תיקון נוירון משוער presynaptic בתצורה הרופף החותם (התנגדות חותם נמוכה של 30-300 MΩ) בעזרת פיפטה 'חיפוש' תיקון של 7-10 התנגדות MΩ. פיפטה זה צריכה להיות מלא עם הפתרון שונה הגבוה Na + הפנימי לגירוי רופף-חותם.
    3. Inject 100-300 msec פולסים נוכחי hyperpolarizing ארוכה באמצעות החותם "החופשי"; פוטנציאל פקודת פיפטה צריך להיות מוגדר על -60 ל-70 mV. שים לב חיבור צומת פער אם תוצאות גירוי זה בתגובת hyperpolarizing קטנה בנוירון "postsynaptic '.
    4. Repatch נוירון "presynaptic 'במצב כל התא ולהמשיך כפי שתואר לעיל.
      הערה: כדי להבטיח מכתים טוב של תהליכי axonal והדנדריטים, משתמשת בפרוטוקול כדלקמן. פרוטוקול זה מתואר בקצרה כאן, לעומת זאת, פרוטוקול מפורט לעיבוד histochemical משמש במעבדה שלנו ניתן בRef. 37.

4. histochemical עיבוד

  1. להעביר את פרוסת המוח עם הזוג של נוירונים בשילוב synaptically לתוך בקבוקון המכיל paraformaldehyde 4% מומסים בחיץ פוספט 0.1 M ולקבע את הפרוסה למשך 24 שעות. למיקרוסקופ אלקטרונים, לקבע את הפרוסה באמצעות glutar 2.5%אלדהיד וparaformaldehyde 1%.
  2. ביום שלמחרת, להעביר את הפרוסות לחיץ פוספט רגיל המכיל לא מקבע. לשטוף פרוסות עם חיץ פוספט ל6-8 פעמים במשך 10 - 15 דקות כל אחד כדי להסיר מקבע עודף.
  3. דגירה פרוסות במשך 20 דקות בH 3% 2 O 2 פתרון במאגר M 0.1 פוספט כדי למזער את תגובת peroxidase אנדוגני. שים לב היווצרות בועה חזקה. המשך התגובה עד אין בועות נוספות מיוצרות. לאחר מכן, יש לשטוף את הפרוסות בחיץ פוספט 0.1 M ל6-8 פעמים (10 דקות כל אחד) כדי להסיר כל שנותר H 2 O 2.
  4. תגובות Immunocytochemical וchromogenic
    הדמיה של נוירונים מלאים biocytin מבוססת על תגובת peroxidase חזרת streptavidin-biotinylated זרז עם diaminobenzidine; זה מייצר משקע כהה שמייצר כתם פריך עם רזולוציה מרחבית גבוהה. הנהלים הבאים משמשים לתגובת chromogenic: <ol>
  5. הכן את פתרון ABC לפי הפרוטוקול של הייצור. הוסף לחיץ פוספט 14.55 מיליליטר בתוספת 150 μl 10% Triton X100 (לוח 6; רק למיקרוסקופ אור) ולשמור את הפתרון לכ -30 דקות בחושך. דגירה פרוסות בO פתרון זה / N לפני השימוש.
  6. דגירה פרוסות בפתרון ABC על שייקר לשעה 1 בRT ובחושך. כתוצאה מכך, לשמור על פרוסות O / N ב 4 ° C במקרר. בבוקר שלמחרת, דגירה פרוסות בRT במשך שעה נוספת.
  7. אחרי זה, לשטוף פרוסות לפחות ארבע פעמים במשך 10 דקות כל אחד בחיץ פוספט. ואז, דגירה על שייקר במשך כ -30 דקות בחושך ב 2 מיליליטר של פתרון-התעצם ניקל 3-3'-diaminobenzidine (לוח 7). להיות זהיר מאוד בעת טיפול diaminobenzidine ולהשתמש רק מתחת למכסת מנוע קטר; זה מאוד מסרטנים גם בריכוזים נמוכים מאוד.
  8. להוסיף 6.5 μl 3% H 2 O 2 הלמכיל diaminobenzidineפתרון. לפקח על תגובת chromogenic תחת מיקרוסקופ אור עד נוירונים מוכתמים בצבע חום-שחורים נראים בבירור. לאחר מכן, לעצור את התגובה באופן מיידי על ידי שטיפת פרוסות מספר פעמים בחיץ פוספט.
  9. פרוסות הר עם נוירונים מוכתמים בדבק, Histobond מצופה silane או שקופיות אובייקט סטנדרטיים gelatinized.
  10. שמור את השקופיות בתא לח עם לפחות 80% O לחות / N. ביום המחרת, בואו פרוסות אוויר-יבשה לעוד 10 דקות. לפני ההטבעה, מגלשות העברה בפתרונות עם ריכוזים גוברים של אתנול (20 - 100%) על מנת ליבש אותם.
    הערה: תהליך ההתייבשות צריך להיות איטי אחרת עיוותים בתהליכים דנדריטיים וaxonal צפויות להופיע 37. אם הליך הטבעה חלופי נבחר, למשל, אחד עם Moviol מבוסס גליצרול, התייבשות אינה נדרשת; אולם זה עשוי לגרום לדחיסת הומוגניות של הפרוסה ולכן morpholo עצבי מעוותGY.
  11. לבסוף, דגירה של 10 דקות בxylol, להטביע את הפרוסות במדיום הטבעה הידרופובי למיקרוסקופ אור ולמקם את coverslips דק על גבי. בואו שקופיות להתייבש במשך 20 דקות ב RT.

לוקליזציה 5. עצבי השיקום וSynaptic לתקשר

  1. בדוק שקופיות עם הנוירונים שכותרתו biocytin תחת מיקרוסקופ אור מצוידת מטרת טבילת שמן 60x / 100X וקבל עם צמצם מספרי גבוה לרזולוציה מרחבית אופטימלית. ודא שboutons axonal וקוצים הדנדריטים גלויים לעין.
  2. עקוב אחר תאי עצב או זוגות נוירון בשילוב synaptically באמצעות נוירון מסחרי התחקות מערכת (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי) כדי להשיג שחזורים עצביים 3D. לבצע מעקב באופן ידני תחת בדיקה ויזואלית קבועה כדי לזהות axonal אפילו קטן או בטחונות דנדריטים. להקלטות לזווג מתאי עצב בשילוב synaptically מעקב ידני הוא עדיין השיטה שלברירה כי הייחוס לדוגמא, פרופיל axonal לאו נוירון מראש או postsynaptic דורש ניסיון שיקום משמעותי.
  3. במידת הצורך, לבצע ספירה של boutons axonal ו / או קוצים הדנדריטים. בגלל קוצים או אפילו תת עמוד השדרה וboutons axonal עשויים להפגין הפצה וצפיפות מסוימות ביחס לדוגמה, שכבת קליפת המוח או באזור, זה יכול לעזור לאפיין סוגים עצביים תא.
  4. לזוגות נוירון בשילוב synaptically, לבדוק את האקסון presynaptic ודנדריטים postsynaptic קרוב appositions בהגדלה הגבוהה ביותר הקיימת. שים לב אוטון axonal ועמוד השדרה דנדריטים postsynaptic או פיר הוא באותו מישור המוקד יכול להיחשב כאיש קשר הסינפטי משוער. סמן איש קשר זה בשיקום.
  5. תקן את השחזורים עצביים להתכווצות בכל שלושת הממדים מרחביים בסעיף המתאים של תכנית המעקב.
    הערה: במהלך קיבעון עיבוד, histochemicalומתרחשים עיוות ההתייבשות משמעותית מכאנית והצטמקות; זה ישפיע על מדידות אורך axonal והדנדריטים וקשים לעוות הסידור המרחבי שלהם. גורמי תיקון הצטמקות למדיום ההטבעה הם ~ 1.1 x ולכיווני y ו~ 2.1 לz-הכיוון 37.
  6. לניתוח מורפולוגי כמותית להשתמש בתכנית ניתוח נתונים לנוירופיזיולוגיה (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקלטות לזווג הן את שיטת הבחירה לאפיון מעמיק של קשרים סינפטיים חד-או דו כיוונית זיהו מורפולוגית כמו גם צומת פער חיבורים (חשמל) (איור 1). דוגמא של הקלטה לזווג בשכבת 4 של קליפת החבית החושית מוצגת באיור 1 א. שניהם מעורר חד-כיווני וקשרים סינפטיים מעכבים ניתן לאפיין (איור 1 ב, ג). הקלטות לזווג יתר על כן מאפשרות להקליט מקשרים סינפטיים דו-כיווניים, כלומר, מחיבורים שבה שני תאי העצב בזוג הם טרום postsynaptic אחד לשני. זו באה לידי ביטוי באיור 1D, אשר מציג הקלטות מinterneuron מעכב ונוירון מעורר. לעורר פוטנציאל פעולה בנוירון מעורר (עקבות אדומות) תוצאות בEPSP בinterneuron המעכב postsynaptic (עקבות שחורות). עם זאת, כאשר פוטנציאל פעולה הוא Evoked בinterneuron, ניתן להקליט IPSP בנוירון מעורר. איור 1E מראה שאפשר גם להקליט מתאי העצב בשילוב באמצעות צומת פער או באמצעות צומת פער וסינפסה. ניתן לזהות קשרי גומלין צומת ופער רק על ידי קלטות אלקטרו מותאמות עד כה, אך לא בכל טכניקה אחרת.

השילוב של מילוי biocytin של נוירונים בשילוב באמצעות פיפטה את התיקון וקלטות אלקטרו מאפשר התאמה של נכסים מורפולוגי של תאי העצב לנכסים הסינפטי. לאחר נוירונים עיבוד histochemical נראים כמבנים כהים בפרוסה מקובעת (איור 2 א). לאחר מכן צמד תאים העצבי שנרשם ניתן לשחזר מורפולוגית וניתן לזהות סוגים עצבי התא. יתר על כן, ניתן לזהות את המספר והמיקום של אנשי קשר משוערים הסינפטי (לוחות מימין איור 2 א ו figurהבלעה 2B ה). זוג נוירון שמוצג באיור 2 ב מחובר הדדי וקשרים סינפטיים ומכאן נוצרים משני תאי העצב. בידיים שלנו, אנשי קשר משוערים, אור זיהו מיקרוסקופי הסינפטי אושרו כקשרים סינפטיים אמיתיים עם מיקרוסקופ האלקטרונים עם 80 - תואר 90% מדיוק 16,21,26.

איור 3 מראה דוגמא של הקלטה לזווג מתא עצב presynaptic פירמידה בשכבת neocortical 6 של קליפת החבית ונוירון הקוצני מעורר בשכבה 4. יש microcircuit העצבי translaminar זה הסתברות חיבור נמוכה, אך ניתן לזהות באמצעות חיפוש ההליך המתואר ב צעדים 3.1.1 - 3.1.9 לקשרים עצביים עם קישוריות נמוכה. עם טכניקת ההקלטה לזווג אותו ניתן לזהות קשרים סינפטיים עם קישוריות נמוכה מאוד כמו במקרה של כמה קשרים ארוך טווח translaminar (דוגמא זו) או קשרים בין נוירוns ממוקם ב'טורים 'בקליפת המוח שונה (קשרים סינפטיים בין-עמודים).

איור 1
איור 1. הקלטות מותאמים מזוגות תא יחד synaptically. () שמאל, תמונת IR-דסק"ש של פרוסת מוח. נכון, interneuron (למעלה) ונוירון מעורר (למטה). פוטנציאל פעולת presynaptic (למעלה) (ב) בנוירון מעורר מעורר פוטנציאל monosynaptic מעורר postsynaptic (EPSP) באחר נוירון מעורר (תחתונה). (C) פוטנציאל פעולה (למעלה) בinterneuron המעכב presynaptic מעורר פוטנציאל פוסט-סינפטי מעכב monosynaptic (IPSP) בנוירון מעורר (תחתון). (ד) פוטנציאל פעולה (למעלה משמאל) בנוירון מעורר presynaptic מעורר EPSP (משמאל למטה) interneuron מעכב. בתורו, פוטנציאל פעולהבinterneuron המעכב (למעלה מימין) מעורר IPSP בנוירון מעורר (מימין למטה). (E) שורה של צעדי מתח היפר וdepolarizing שהושרו על ידי זריקות הנוכחיות לנוירון (למעלה משמאל) באה לידי ביטוי בפער-צומת נוירון השני בשילוב (למטה משמאל). בנוסף, פוטנציאל פעולת presynaptic (למעלה מימין) בתא העצב הראשון מעורר שלילת קוטביות מוקדמת קטנה (spikelet, הבלעה) ואחריו hyperpolarization העמוק מאוחר (IPSP) בפוטנציאל הממברנה של תא העצב השני (מימין למטה). ברים בקנה מידה (B) יחולו גם על (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
זיהוי איור 2. של קשרים סינפטיים וreconstr מורפולוגייםuction של זוגות תא מלא biocytin. () שמאל, צריכת החשמל נמוך photomicrograph של זוג תא יחד הדדי הכולל stellate קוצני וinterneuron המהיר spiking בשכבה 4 שהיו מלאים בbiocytin במהלך הקלטה. אנשי קשר אור זיהו מיקרוסקופי משוערים מעוררים הסינפטי בין נוירון הקוצני presynaptic וinterneuron postsynaptic מסומנים על ידי נקודות ירוקות. קשרים סינפטיים מעכבים גומלין משוערים מסומנים על ידי נקודות כחולות. הספק גבוה של תמונות הנכונות, של קשרים סינפטיים. עיגולים ירוקים פתוחים, אנשי קשר מעוררים; עיגולים כחולים פתוחים, אנשי קשר מעכבים. גבולות שכבה נקבעו על ידי מבנה cytoarchitectonic של פרוסת המוח המוכתמת מתחת למיקרוסקופ הכח הנמוך. שיקום (B) Neurolucida של אותו זוג התא שמוצג () ותרשים 1C. האקסון הכחול, interneuron; , סומה האדומה interneuron ודנדריט; האקסון הירוק, נוירון הקוצני; , סומה לבנה נוירון הקוצני ודנדריט. הבלעהמציג את תאי somatodendritic של הנוירונים טרום postsynaptic יחד עם אנשי הקשר המשוערת הסינפטי. קווי המתאר חבית זוהו בphotomicrographs בהיר שדה צריכת החשמל הנמוך עשוי מפרוסת המוח החריפה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. חיבור הסינפטי נציג עם יחס קישוריות נמוך מאוד. () פוטנציאל presynaptic פעולה (למעלה) בתא פירמידלי שכבת 6 מעורר פוטנציאל monosynaptic מעורר postsynaptic (למטה) בנוירון פירמידלי כוכב שכבת 4. שים לב חביון הארוכה (> 3.0 אלפית השנייה) של חיבור טרנס-עלעלים זה בהשוואה לזו של קשרי פנים-למינרית המקומיים (≈1.0 אלפיות שני). Respons Postsynaptic (B)דואר של שכבת נוירון פירמידלי 4 כוכבים לשני פוטנציאל פעולה ב -10 הרץ שהושרו בשכבת 6 תאים פירמידליים. שים לב לסיוע לטווח הקצר של חיבור זה בהשוואה לדיכאון לטווח הקצר של קשרים מקומיים (מידע לא מוצג). עומק (C) מורחב של הדמיה מוקד באותו החיבור כמו ב( A, B). הבלעה, somato / תחום הדנדריטים של נוירון פירמידלי כוכב שכבת 4. שים לב לנוכחות של דנדריט הפסגה בולט המסומן בחץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מ"מ g / L
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 .186
גלוקוז 25 4.5
NaHCO 3 2.1
לאא 2 PO 4 1.25 0.173
CaCl 2 2 .294
MgCl 2 1 0.095
Osmolarity ~ 310 mOsmol / L
בגז עם 95% O 2, 5% CO 2

1. נוזל השדרתי שולחן מלאכותי (ACSF) לזלוף במהלך הקלטה.

מ"מ g / L
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 .186
גלוקוז 25 4.5
NaHCO 3 25 2.1
לאא 2 PO 4 1.25 0.173
CaCl 2 1 .147
MgCl 2 5 .476
מיו-אינוסיטול 3 0.54
Na-פירובט 2 0.22
חומצה אסקורבית (ויטמין C) 0.4 0.07
Osmolarity ~ 310 mOsmol / L
בגז עם 95% O 2, 5% CO 2

טבלת 2. פתרון תאי לפרוסות מוח חריפות של בעלי חיים בוגרים.

מ"מ g / L
סוכרוז 206 70.51
KCl 2.5 .186
גלוקוז 25 4.5
NaHCO 3 25 2.1
לאא 2 PO 4 1.25 0.173
CaCl 2 1 .147
MgCl 2 3 .286
מיו-אינוסיטול 3 0.54
Na-פירובט 2 0.22
חומצה אסקורבית (ויטמין C) 0.4 0.07
Osmolarity ~ 310 mOsmol / L
בגז עם 95% O 2, 5% CO 2

פתרון טבלת 3. תאי לפרוסות מוח חריפות של בעלי חיים בוגרים (יםמלוח ucrose).

מ"מ g / L g / 50 מיליליטר
K-גלוקונאט 135 31.622 1.5811
KCl 4 0.298 .0149
HEPES 10 2.384 .1192
Phosphocreatine 10 2.552 .1276
ATP-Mg 2 + 4 2.028 .1014
GTP-Na 0.3 0.156 .0078
התאם ל- pH 7.3 עם KOH
Osmolarity ~ 300 mOsmol / L
להוסיף 3-5 מ"ג / מיליליטר biocytin

לוח 4. פתרון פיפטה כלוריד נמוך.

מ"מ g / L g / 50 מיליליטר
Na-גלוקונאט 105 22.92 1.146
NaCl 30 1.76 .088
HEPES 10 2.384 .1192
Phosphocreatine 10 2.552 .1276
ATP-Mg 2 + 4 2.028 .1014
GTP-Na 0.3 0.156 .0078
התאם ל- pH 7.3 עם NaOH
Osmolarity ~ 300 mOsmol / L

לוח 5: הגבוה Naפתרון פיפטה לחיפוש נוירונים בשילוב synaptically.

יחס מיליליטר
מגיב 1 0.15
מגיב B 1 0.15
10% Triton X100 1 0.15
0.1 חיץ פוספט M 97 14.55
המשיך במשך 30 דקות בחושך לפני השימוש

לוח 6. פתרון ABC לתגובת histochemical.

משקל נפח
3-3'-diaminobenzidine 10 מ"ג -
0.1 חיץ פוספט M - 20 מיליליטר
1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 - 5 - 10 μl
1% CoCl 2 - 5 μl
1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 ו -1% CoCl 2 מתווספים טיפה אחרת טיפה תוך ערבוב הפתרון.

לוח 7: פתרון לdiaminobenzidine תגובה (DAB).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקלטות לזווג ממעורר בשילוב synaptically ו / או נוירונים מעכבים הן גישה מאוד תכליתית ללימוד שבבים עצביים. לא רק בגישה זו אינה מאפשרת אחד כדי להעריך קישוריות הסינפטי בין סוגי תאי עצב, אלא גם מאפשרת קביעת המאפיינים הפונקציונליים של החיבור והמורפולוגיה של תאי עצב טרום postsynaptic. יתר על כן, אגוניסט ו / או אנטגוניסט יכול בקלות להיות מיושם על תאי עצב בהכנות פרוסה. זה מאפשר לאדם לחקור את ההשפעות של neuromodulators על המאפיינים של שידור סינפטי 32 או אפיון מעמיק של קשר הסינפטי אחיד מוגדר באמצעות, למשל, ניתוח quantal של 16,17,38,39 שחרור הסינפטי. ממצא של כימי ו / או (צומת פער) חשמלית קשרים סינפטיים הוא השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה. לכן יש לנו מפורט גישות שונות למציאת קשרים סינפטיים, בהתאם ליחס שלה והקישוריותסוג (כימי / חשמלי).

חסרון עיקרי של הכנות פרוסה הוא עיצור לעתים קרובות משמעותי של תחזיות axonal ארוך טווח, כך שרק חלקים קטנים של אורך axonal הכולל של האקסון הם התאוששו. עבור סוגים מסוימים פירמידה תא, את מידת עיצור יכול עד 90% או אפילו יותר כאשר לוקחים תחזיות לאזורים בקליפת המוח אחרים או אזורים קורטיקליים בחשבון. זה הופך את הכנת פרוסה אינה מתאימה למחקר של קשרים סינפטיים בין הנוירונים גופי התא של שהם יותר מאשר בנפרד> 300 מיקרומטר. עם זאת, בהכנות פרוסה חריפות, תחזיות axonal מקומיות, בפרט אלה של interneurons המקומית בדרך כלל התאוששו עם תואר נמוך יחסית של הדנדריטים ועיצור axonal (~ 10% או פחות) בגלל אורך השדה האופקי ואנכי המוגבל של סוכות axonal . חיבורים מעורבים סוגים אלה של תאי עצב ולכן יכולים להיות מאופיינים ברמה גבוהה של דיוק וreliability ולהניב הערכות קישוריות נכונות במידה רבה. למעט קשרים סינפטיים המקומיים אלה, ערכים מוחלטים ליחסי קישוריות בין שני סוגי תאי עצב שהתקבלו בהכנות פרוסה הם בעייתיים מאוד, בפרט לנוירונים עם מרחקים בין-גופניים גדולים כמו בtranslaminar או ארוך טווח שאינו מקומי, תוך-שכבתי קשרים סינפטיים . בעיה זו מחריפה כאשר תנאי חיתוך לא היו מותאמים לחיבור הסינפטי ניתנו בגיל מוגדר. למתודולוגיות רומן ריאליסטית יותר קישוריות המוערכת כגון שחזורי אלקטרונים צפופים מיקרוסקופיים 40 וחפיפת axo-דנדריטים מבנית 41 פותחו. עם זאת, גם בטכניקות אלה יש לקחת בחשבון את הגיוון הגבוה של interneurons המעכבת וגם הנוירונים מעוררים.

בעיה נוספת עם הערכות קישוריות היא שקשרים סינפטיים דיסטלי, למשל, אלה בציצת הפסגה של תאי עצב בצורת פירמידה, רשאילהתחמק מזיהוי. כאשר נמדדו בסומה המשרעת של התגובה הסינפטי שלהם היא קטנה מאוד והוא צפוי להיעלם ברעש (Qi et al., 2014, בהגשה). עם זאת, זה סוג של בעיה אינו מוגבל לגישת ההקלטה לזווג אלא גם יתרחש עם טכניקות אחרות המשמשות ללמוד קישוריות הסינפטי.

בהפעלה מושרה אור האחרונה השנה של שבבים עצביים (כלומר, על ידי צילום שחרור של גלוטמט בכלוב או על ידי הפעלה של channelrhodopsin) נעשה שימוש כדי לחקור קישוריות עצבית, אפילו בקנה מידה גדולה יותר 42-52. עם זאת, עם גישות אופטיות אלה לא ניתן לזהות את המאפיינים המבניים של סוג תא עצב presynaptic. יתר על כן, לא ניתן לזהות את המספר והמיקום של קשרים סינפטיים שהוקמו על ידי חיבור עצבי, לפחות לא עד היום. הקלטות לזווג, לעומת זאת, מאפשרות האפיון של שני neur טרום postsynapticעל סוגים בmicrocircuit הסינפטי. הדבר חשוב במיוחד שכן מחקרים רבים הראו ששני interneurons GABAergic ונוירונים מעוררים מגוונים מאוד ביחס למורפולוגיה שלהם ופיזיולוגיה הסינפטי 53-56. כך, זיהוי של שני נוירונים טרום postsynaptic הוא תנאי הכרחי לתיאורו של קשר הסינפטי 57. לבסוף, הקלטות לזווג מאפשרות ההקלטה של ​​תצורות שונות של חיבור הסינפטי (קשרי גומלין, דו-קיום וצומת פער סינפסות כימיות). לכן, טכניקת ההקלטה לזווג תישאר גישה חשובה ללימוד שבבים עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2 - 3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
  2. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
  3. Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
  4. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  5. Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
  6. Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
  7. Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
  8. Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
  9. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  10. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
  11. MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
  12. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  13. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  14. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
  15. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  16. Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
  17. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
  18. Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
  19. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
  21. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
  22. Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
  23. Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
  24. Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
  25. Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
  26. Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
  27. Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
  28. Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
  29. Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
  30. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
  31. Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
  32. Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
  33. Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
  34. Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
  35. Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
  36. Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
  37. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  38. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
  39. Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
  40. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  41. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  42. Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
  43. Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
  44. Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
  45. Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
  46. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  47. Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
  48. Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
  49. Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
  50. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  51. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  52. Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
  53. Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
  54. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
  55. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
  56. Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
  57. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).

Tags

Neuroscience גיליון 95 תיקון מהדק הקלטות לזווג תאי עצב קשרים סינפטיים צמתים פער biocytin תיוג מתאמי מבנה פונקציה
אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D.… More

Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter