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Neuroscience

तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग

Published: January 10, 2015 doi: 10.3791/52358
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

Abstract

एक साथ इंट्रासेल्युलर biocytin भरने के साथ तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में दो (या अधिक) synaptically युग्मित न्यूरॉन्स (बनती रिकॉर्डिंग) से पैच दबाना रिकॉर्डिंग के संयोजन उनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक संपत्तियों की एक सहसंबद्ध विश्लेषण की अनुमति देता है। इस विधि के साथ यह उनकी आकृति विज्ञान और electrophysiological प्रतिक्रिया पैटर्न से दोनों पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए संभव है। बनती रिकॉर्डिंग इन न्यूरॉन्स के बीच कनेक्टिविटी पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से दोनों रासायनिक और बिजली synaptic प्रसारण के गुणों का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यहाँ, हम न्यूरॉन आकृति विज्ञान की एक इष्टतम वसूली के साथ एक साथ विश्वसनीय बनती रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का एक कदम-दर-कदम विवरण देते हैं। हम रासायनिक अन्तर्ग्रथन या अंतराल जंक्शनों के माध्यम से जुड़ा न्यूरॉन्स के जोड़े मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में पहचान कर रहे हैं कि कैसे वर्णन करेंगे। हम न्यूरॉन्स dendrit के अपने 3 डी आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए खंगाला कर रहे हैं कि कैसे की रूपरेखा तैयार करेंगेआईसी और axonal डोमेन और कैसे synaptic संपर्कों की पहचान की है और स्थानीय कर रहे हैं। हम भी विशेष रूप से मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के दौरान वृक्ष के समान और axonal truncations से जुड़े लोगों के लिए इन दृढ़ता से कनेक्टिविटी अनुमानों को प्रभावित है, क्योंकि बनती रिकॉर्डिंग तकनीक के निरंतर और सीमाओं पर चर्चा करेंगे। हालांकि, क्योंकि बनती रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा की यह मस्तिष्क में पहचान न्यूरोनल microcircuits पर synaptic प्रसारण के विभिन्न पहलुओं निस्र्पक में एक महत्वपूर्ण उपकरण रहेगा।

Introduction

दो synaptically युग्मित न्यूरॉन्स के बीच neuronal microcircuits मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर नेटवर्क के निर्माण खंड हैं और synaptic सूचना संसाधन के मौलिक इकाइयां हैं। ऐसे न्यूरोनल microcircuits के लक्षण वर्णन के लिए एक शर्त आकृति विज्ञान और पूर्व और postsynaptic साथी न्यूरॉन्स दोनों के कार्यात्मक संपत्तियों, synaptic कनेक्शन (एस) और इसकी संरचना और कार्यात्मक तंत्र के प्रकार का पता करने के लिए है। हालांकि, synaptic कनेक्शन के कई अध्ययनों में एक Microcircuit में न्यूरॉन्स की कम से कम एक अच्छी तरह से विशेषता नहीं है। इस बार synaptic कनेक्टिविटी के अध्ययन में इस्तेमाल अपेक्षाकृत unspecific उत्तेजना प्रोटोकॉल का परिणाम है। इसलिए, प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण या तो सब पर या केवल एक नहीं बल्कि छोटे हद तक पहचान नहीं कर रहे हैं (यानी, मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति आदि)। मार्कर द्वारा intracellular धुंधला के साथ संयोजन में बनती रिकॉर्डिंगbiocytin, neurobiotin या फ्लोरोसेंट रंगों के रूप में uch छोटे न्यूरोनल microcircuits के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल हैं। इस तकनीक को एक ही समय में एक आकृति विज्ञान पहचान अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के कई संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों की जांच करने की अनुमति देता है।

दो न्यूरॉन्स के बीच तथाकथित 'एकात्मक' monosynaptic कनेक्शन तीव्र टुकड़ा तैयारी का उपयोग करते हुए दोनों cortical और subcortical मस्तिष्क क्षेत्रों 10/01 में जांच की गई है। प्रारंभ में, तेज microelectrodes इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था; बाद में, पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक कम शोर स्तर और एक बेहतर अस्थायी समाधान के साथ synaptic संकेतों की रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए नियुक्त किया गया था।

एक महत्वपूर्ण तकनीकी अग्रिम अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर-डीआईसी) प्रकाशिकी 11-14, काफी यह संभव टी बन गया है, ताकि मस्तिष्क टुकड़ा में न्यूरॉन्स की दृश्यता और पहचान में सुधार हुआ है कि एक सूक्ष्म तकनीक का उपयोग किया गया थाओ नेत्रहीन पहचान synaptic कनेक्शन 15-17 से रिकॉर्डिंग प्राप्त करते हैं। सामान्य में, बनती रिकॉर्डिंग तीव्र टुकड़ा तैयारी में किया जाता है; केवल बहुत कुछ प्रकाशनों विवो 18-20 में synaptically जुड़े न्यूरॉन्स से उपलब्ध रिपोर्टिंग रिकॉर्डिंग कर रहे हैं।

बनती रिकॉर्डिंग का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर दोनों पर एक रूपात्मक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है कि इस तथ्य है (उदाहरण के लिए देखते हैं।, 7,16,21)। Histochemical प्रसंस्करण के बाद, synaptically जुड़े न्यूरॉन जोड़ी के वृक्ष के समान और axonal आकृति विज्ञान का पता लगाया जाता है। बाद में, यह इन मापदंडों तो एक विशिष्ट synaptic कनेक्शन का एक उद्देश्य वर्गीकरण के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है आदि जैसे लंबाई, स्थानिक घनत्व, अभिविन्यास, शाखाओं में बंटी पैटर्न के रूप में रूपात्मक सुविधाओं यों के लिए संभव है। इसके अलावा, न्यूरोनल connecti के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है सबसे अन्य तकनीकों के विपरीतvity, बनती रिकॉर्डिंग भी एकात्मक synaptic कनेक्शन के लिए synaptic संपर्कों की पहचान की अनुमति। यह प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 16,21-27 का एक संयोजन का उपयोग कर या वृक्ष के समान कांटा की कैल्शियम इमेजिंग 28,29 का उपयोग कर सीधे किया जा सकता है। हालांकि, बाद दृष्टिकोण के साथ ही उत्तेजक नहीं बल्कि निरोधात्मक कनेक्शन अध्ययन किया जा सकता है कि यह पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर चैनलों के माध्यम से कैल्शियम बाढ़ की आवश्यकता के रूप में।

एक परिभाषित न्यूरोनल Microcircuit बनती रिकॉर्डिंग पर synaptic प्रसारण का एक विस्तृत विश्लेषण के अलावा भी अन्तर्ग्रथनी plasticity के नियमों 30,31 के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं - या ऐसे acetylcholine की 32 और एडेनोसाइन के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर द्वारा synaptic प्रसारण के मॉडुलन - एगोनिस्ट / प्रतिपक्षी आवेदन के साथ संयोजन में 33।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु के संरक्षण, जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के लिए यूरोपीय संघ के निर्देशक (Tierschutzgesetz) और यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान एसोसिएशन के संघ के दिशा-निर्देशों के अनुसार बाहर किया गया है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए 1. सेट अप

बनती रिकॉर्डिंग के साथ शुरू करने से पहले, एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट-अप का निर्माण किया जाना है। इस तरह के एक सेट अप के नीचे दी गई है इकट्ठा किया है कि कैसे एक संक्षिप्त रूपरेखा:

  1. माइक्रोस्कोप, चालाकी और अन्य सभी उपकरण रखा जाएगा जिस पर एक विरोधी कंपन तालिका को स्थापित करें।
    नोट: कंपन या आंदोलन के किसी भी अन्य प्रकार इस (रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के द्वारा प्रतिस्थापित खोज इलेक्ट्रोड) pipettes के एक बदलाव की आवश्यकता है क्योंकि synaptic कनेक्शन से जब रिकॉर्डिंग के रूप में संभव के रूप में छोटे होने की जरूरत है।
  2. बिजली के शोर को कम करने के लिए विरोधी कंपन मेज के चारों ओर एक फैराडे पिंजरे रखें। फैराडे सीए के अंदर सभी उपकरण कनेक्टबिजली जमीन के साथ जीई।
  3. निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार विरोधी कंपन मेज पर एक मोटर चालित XY टेबल पर आधारित है कि एक मोटर चालित फोकस अक्ष के साथ एक खुर्दबीन स्थापित करें। इस मज़बूती से यह neocortex में translaminar कनेक्शन के लिए मामला है के रूप में देखने का एक ही क्षेत्र में नहीं हैं कि न्यूरॉन्स के लिए माइक्रोस्कोप स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है।
  4. माइक्रोस्कोप के कैमरे बंदरगाह पर एक वीडियो कैमरा स्थापित करें और यह टुकड़ा तैयारी और इलेक्ट्रोड के आंदोलन का निरीक्षण करने और / या डिजिटल स्क्रीन अनुरूप करने के लिए कनेक्ट। Synaptically युग्मित neuronal सेल जोड़ी की, क्रमशः, एक निम्न और एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए एक उच्च शक्ति बढ़ाई और एक क्लोज़-अप छवि के बीच स्विच किया जा सकता है, जो एक कैमरा, का प्रयोग करें। यह भी पैच इलेक्ट्रोड के आंदोलन को नियंत्रित करने में मदद करता है।
  5. स्नान कक्ष के लिए एक क्षेपक युक्त एक नमूना तालिका स्थापित करने के मस्तिष्क टुकड़ा तैयार करने के लिए (एक Perspex ब्लॉक से घर में drilled)। यह नमूना तालिका से जुड़ा होना नहीं चाहिएमाइक्रोस्कोप, यानी, हवा की मेज पर तय किया जाना चाहिए और माइक्रोस्कोप के तहत यह maneuverable होना चाहिए।
  6. माउंट दो (या यदि आवश्यक हो तो अधिक) सभी तीन आयामों में ले जाया जा सकता है कि उच्च परिशुद्धता micromanipulators। Manipulators पर पैच दबाना पूर्व एम्पलीफायर स्थापित करें और मुख्य एम्पलीफायर के लिए उन्हें कनेक्ट।
    नोट: आवश्यक अतिरिक्त manipulators, उदाहरण के लिए अधिक से अधिक दो पूर्व एम्पलीफायरों, बाह्य उत्तेजना इलेक्ट्रोड, दवा वितरण प्रणाली, आदि स्थापित किया जा सकता है, तो
  7. नमूना तालिका में स्नान चैम्बर रखें। एक समाधान इनलेट स्थापित करें और आउटलेट और छिड़काव प्रणाली के लिए उन्हें कनेक्ट।
  8. / मिनट इष्टतम टुकड़ा व्यवहार्यता के लिए 6 मिलीग्राम - 4 के एक स्थिर प्रवाह दर पर; (1 टेबल ACSF) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ रिकार्डिंग कक्ष के छिड़काव बनाए रखने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करें।
    नोट: यह ASCF में अशांति और टुकड़ा इसलिए आंदोलन में परिणाम होगा काफी के रूप में इस प्रवाह की दर को पार न करें। नमूना मेज पर तापमान जांच और एजी / AgCl जमीन इलेक्ट्रोड के लिए धारकों को स्थापित करें। इस कक्ष में स्नान करने के लिए नमूना जांच और इलेक्ट्रोड की अनुमति आवश्यक है।
  9. टुकड़ा तैयारी में न्यूरॉन्स का एक अच्छा दृश्यता के लिए माइक्रोस्कोप में अवरक्त रोशनी का उपयोग करें। यह इसलिए प्रकाश विवर्तन और छवि कलंक कम कर देता है। माइक्रोस्कोप एक '3D'-तरह के दृश्य प्राप्त करने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित है कि सुनिश्चित करें। यह न्यूरॉन्स पट्टी में मदद मिलेगी और टुकड़ा (60 माइक्रोन या गहरा) में गहरी न्यूरॉन्स को लक्षित कर सकेंगे।
  10. प्रयोग के दौरान, तल पर एक गिलास coverslip के साथ एक प्रायोगिक कक्ष में मस्तिष्क स्लाइस रहते हैं। फ्लोटिंग से स्लाइस को रोकने के लिए टुकड़ा के शीर्ष पर एक 'प्लैटिनम वीणा' रखें। एक प्लेटिनम वीणा इसे पर चिपके दंत सोता के तार के साथ यू के आकार, चपटा प्लैटिनम तार से बनाया गया है।
  11. ऑप्ट सुनिश्चित करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस - 32 के तापमान पर टुकड़ा perfusing ACSF रखेंoxygenation और पीएच के imal नियंत्रण। इस स्नान के चेंबर में ACSF आमद के करीब स्थापित एक Peltier डिवाइस के साथ समाधान हीटिंग द्वारा किया जा सकता है।
    नोट: उपयोग ultrathin कवर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर और कम काम दूरी के साथ भी माइक्रोस्कोप condensers नमूना पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है, ताकि निकल जाता है। यह टुकड़ा की एक इष्टतम रोशनी के लिए आवश्यक है।
    एक छवि और मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में बनती रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट-अप की एक विवरण के लिए रेफरी। 34 में चित्रा 4 देखते हैं।

2. ब्रेन टुकड़ा तैयारी

  1. हल्का मस्तिष्क के ऊतकों isoflurane (अंतिम एकाग्रता <0.1%) के साथ लिया जाना चाहिए, जहां से पशु anesthetize।
    नोट: अन्य एनेस्थेटिक्स का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। संवेदनाहारी का प्रयोग संबंधित जानवर समिति की सिफारिशों और नियमों का पालन करना चाहिए। हमेशा पशु जोड़ने के बाद चिढ़ या तनाव में नहीं है कि यह सुनिश्चित करेंसंवेदनाहारी।
  2. , पशु सिर काटना खोपड़ी खुला और refs में वर्णित प्रक्रिया। 34,35 का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में जल्दी मस्तिष्क को हटा दें।
  3. 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ carbogen गैस का एक मिश्रण के साथ वातित ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में मस्तिष्क स्थानांतरण।
  4. अध्ययन किया जाना चाहिए कि मस्तिष्क क्षेत्र पृथक।
    नोट: मापदंडों इष्टतम संरक्षण और dendrites और पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की axons की न्यूनतम ट्रंकेशन प्राप्त करने के लिए जांच के तहत प्रत्येक न्यूरोनल कनेक्शन और विकास के चरण के लिए अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए। एक बेहतर विच्छेदित मस्तिष्क टुकड़ा में, प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन के अक्षतंतु टुकड़ा सतह के समानांतर होने की आवश्यकता नहीं है। बल्कि, वे एक उथले कोण के साथ स्लाइस में बात करनी चाहिए। पोस्टअन्तर्ग्रथनी पिरामिड न्यूरॉन्स के शिखर डेन्ड्राइट के लिए लागू होता है; इस प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जाँच की जानी चाहिए। इस गैर-स्थानीय या टी के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैranslaminar synaptic कनेक्शन, अर्थात्।, पूर्व और postsynaptic somata 200 से अधिक माइक्रोन अलग कर रहे हैं और वृक्ष के समान और axonal truncations की संभावना स्थानीय कनेक्शन के लिए की तुलना में काफी अधिक होने की संभावना है, जहां।
  5. सूक्ष्म चैम्बर के लिए मस्तिष्क स्थानांतरण। अनुभवजन्य निष्कर्षों के आधार पर, विभिन्न कोशिकी टुकड़ा करने की क्रिया समाधान जानवर की उम्र के आधार पर उपयोग किया जाता है (; उपयोगी जानकारी भी 'के अंतर्गत पाया जा सकता है टेबल्स 2 और 3 देखें http://www.brainslicemethods.com/ ')।
  6. लक्ष्य क्षेत्र से दिखाई देता है जब तक मस्तिष्क ट्रिम।
  7. पशु परिपक्व है अगर (3 सप्ताह>) 400 माइक्रोन मोटी मस्तिष्क स्लाइस - एक अच्छा सेल दृश्यता के साथ स्लाइस प्राप्त करने के लिए, 300 में कटौती। काफी हद तक आई सेल visib बिना 800 माइक्रोन - पशु (1 से 2 सेंट एन डी चूहों और चूहों के लिए प्रसव के बाद सप्ताह) स्लाइस अपरिपक्व है, तो ~ 600 की मोटाई तक की कटौती की जा सकती हैility।
    नोट: यह 'अपरिपक्व' स्लाइस की स्थिरता में सुधार और लंबी दूरी वृक्ष के समान और axonal collaterals के संभव truncations की संख्या कम हो जाएगा।
  8. 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के एक मिश्रण के साथ वातित टुकड़ा करने की क्रिया समाधान के साथ भरा एक ऊष्मायन चैम्बर के लिए सूक्ष्म कक्ष से स्लाइस स्थानांतरण। प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है, आरटी पर या ~ 30 डिग्री सेल्सियस पर या तो कम से कम 30 मिनट के लिए एक घंटे के लिए ऊष्मायन कक्ष में स्लाइस रखें।

3. बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग और Biocytin भरने

अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के प्रकार पर निर्भर करता है कि तीन अलग अलग दृष्टिकोण synaptically युग्मित न्यूरॉन्स को खोजने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (सबसे उत्तेजक कनेक्शन के लिए उम्मीद की जा सकती रूप में) कनेक्शन संभावना कम है, तो इस प्रकार है, के रूप में आगे बढ़ना:

  1. एक कम कनेक्टिविटी के साथ neuronal कनेक्शन
    1. सूचीबद्ध रचना की एक आंतरिक समाधान के साथ पैच pipettes भरेंतालिका 4 में पूरे सेल विन्यास में सभी रिकॉर्डिंग के लिए 3 के बीच सांद्रता में biocytin जोड़ -। पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स के लिए अच्छा धुंधला परिणाम प्राप्त करने के लिए आंतरिक (पिपेट) समाधान करने के लिए मिलीलीटर 5 मिलीग्राम /। (न्यूरॉन के आकार पर निर्भर करता है) 30 मिनट - कम से कम 15 के लिए सेल में फैलाना biocytin करते हैं।
      नोट: नीचे उल्लेख 'खोज' pipettes में इस्तेमाल समाधान के लिए biocytin न जोड़ें।
    2. पूरे सेल मोड में एक ख्यात पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन पैच। एक लंबा और पतला टांग के साथ पैच pipettes का प्रयोग करें। इस उद्देश्य के तहत पिपेट की गतिशीलता की सुविधा और इलेक्ट्रोड टुकड़ा में पेश किया है जब कि हो सकता है आंदोलन कलाकृतियों को कम करता है।
    3. 10 MΩ प्रतिरोध और एक छोटी सी टिप व्यास - तो फिर, 8 की 'खोज' पैच पिपेट का उपयोग कर एक सेल संलग्न विन्यास में एक संभावित प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन पैच। इन pipettes के साथ एक 'ढीला' सेल संलग्न पैच स्थापना। Filएल + K एक प्रीसानेप्टिक सेल के लिए खोज के दौरान न्यूरॉन्स बिगाड़ना नहीं क्रम में ना + (तालिका 5) द्वारा बदल दिया है, जिसमें एक आंतरिक समाधान के साथ 'खोज' पिपेट।
      नोट: 'ढीला' मुहर प्रतिरोध GΩ श्रेणी में नहीं है, लेकिन आम तौर पर लगभग 30-300 MΩ।
    4. वर्तमान दबाना मोड में के बारे में -30 एम वी -60 के लिए करने के लिए 'ढीला' सील के तहत झिल्ली क्षमता होती है। संभावित प्रीसानेप्टिक सेल में एक संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना - (2 एनए 0.2) फिर, बड़े वर्तमान दालों लागू होते हैं। वोल्टेज की प्रतिक्रिया पर एक छोटी सी छोटी बाल के रूप में इस संभावित कार्रवाई को ध्यान से देखें।
    5. एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रिया के रन नीचे रोकने के लिए 0.1 हर्ट्ज के लिए उत्तेजना आवृत्ति निर्धारित करें। मस्तिष्क के ऊतकों बहुत अपरिपक्व या अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन बहुत विश्वसनीय नहीं है मामले में कम उत्तेजना आवृत्तियों का उपयोग करें।
    6. मामले में 'पोस्टअन्तर्ग्रथनी' न्यूरॉन परीक्षण किया 'प्रीसानेप्टिक' Neu की उत्तेजना का जवाब नहीं हैरॉन, 'ढीला' सील मोड में एक नया न्यूरॉन पैच। 30 MΩ स्थापित है> के प्रतिरोध के साथ मुहर के रूप में लंबे समय के 'खोज' पैच इलेक्ट्रोड की जगह नहीं है। इस तरह से 30 संभावित प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन्स अप करने के लिए टेस्ट।
      नोट: ढीला पैच दबाना के साथ खोज की प्रक्रिया के दौरान न्यूरॉन को नुकसान पहुँचाए रोकने के लिए, केवल धीरे चूषण पूरे सेल पैच पिपेट के लिए आवेदन किया है कि के साथ तुलना में खोज पिपेट करने के लिए लागू किया जाना चाहिए।
    7. एक विलंबता के साथ एक EPSP / IPSP में 'ढीला' सील मोड परिणामों में उत्तेजना <पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन में 5 मिसे प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन से 'खोज' पिपेट निकालते हैं।
    8. Biocytin युक्त, नियमित रूप से आंतरिक समाधान के साथ भरा एक पैच इलेक्ट्रोड के साथ 'खोज' पैच पिपेट बदलें। इस रिकॉर्डिंग पैच पिपेट सुनिश्चित करें 4 के एक प्रतिरोध किया है - 8 MΩ; इलेक्ट्रोड प्रतिरोध हो सकता है कम सोमा आकार बड़ा है।
    9. प्रीसानेप्टिक पैचपूरे सेल, वर्तमान दबाना मोड में न्यूरॉन और रिकॉर्ड। प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन्स में वर्तमान इंजेक्शन द्वारा कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना और postsynaptic प्रतिक्रिया रिकॉर्ड है। बाद में बंद लाइन विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर डाटा स्टोर।
  2. एक उच्च कनेक्टिविटी के साथ neuronal कनेक्शन
    नोट: एक उच्च कनेक्टिविटी अनुपात (> 30%) के साथ न्यूरोनल microcircuits लिए synaptic कनेक्शन खोजने के लिए एक अलग प्रक्रिया का उपयोग करें। इस प्रक्रिया के नीचे उल्लिखित है और अक्सर उत्तेजक कनेक्शन 36 से अधिक औसत एक उच्च कनेक्टिविटी अनुपात पर है कि निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है। कनेक्टिविटी के अनुपात में इस मूल्य से नीचे गिर जाता है यह नहीं किया जाना चाहिए।
    1. पूरे सेल मोड में सीधे एक प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन पैच। फिर, एक संभावित पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन पैच भी पूरे सेल मोड में। दोनों कोशिकाओं वर्तमान दबाना नियंत्रण में होना चाहिए। प्रीसानेप्टिक सेल में एक संभावित कार्रवाई को प्रकाश में लाना। एक postsy के लिए संभावित पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन मॉनिटरnaptic संभावित।
    2. मामले में न्यूरॉन, प्रीसानेप्टिक उत्तेजना के लिए एक प्रतिक्रिया को दिखाने के लिए नियमित रूप से आंतरिक समाधान के साथ भरा एक पैच इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हुए पूरे सेल मोड में एक नया न्यूरॉन पैच नहीं करता है। एक कनेक्शन पाया जाता है, तो पैच पिपेट बदल लेकिन रिकॉर्डिंग के साथ आगे बढ़ना नहीं है। फिर, कदम 3.1.9 के रूप में आगे बढ़ें।
  3. अंतर-जंक्शनों के माध्यम से neuronal कनेक्शन
    नोट: बिजली (जीएपी-जंक्शन) कनेक्शन के लिए खोज करने के लिए कम संभावना कनेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है कि का एक संशोधित संस्करण है जो निम्न कार्यविधि का उपयोग करें।
    1. पूरे सेल पैच दबाना विन्यास में एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन पैच।
    2. 10 MΩ प्रतिरोध - 7 की 'खोज' पैच पिपेट का उपयोग - इसके बाद, ढीले-सील विन्यास में एक ख्यात प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन (300 MΩ 30 से कम मुहर प्रतिरोध) पैच। इस पिपेट ढीला-सील उत्तेजना के लिए संशोधित उच्च ना + आंतरिक समाधान के साथ भरा जाना चाहिए।
    3. Injecटी 100-300 मिसे 'ढीला' सील के माध्यम से लंबे समय hyperpolarizing वर्तमान दालों; पिपेट आदेश क्षमता के बारे में -60 एम वी -70 के लिए सेट किया जाना चाहिए। 'पोस्टअन्तर्ग्रथनी' न्यूरॉन में एक छोटे से hyperpolarizing जवाब में इस उत्तेजना परिणाम अगर एक अंतराल जंक्शन कनेक्शन का निरीक्षण करें।
    4. पूरे सेल मोड में 'प्रीसानेप्टिक' न्यूरॉन Repatch और ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
      नोट: axonal और वृक्ष के समान प्रक्रियाओं का एक अच्छा धुंधला सुनिश्चित नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल यहाँ संक्षिप्त में वर्णन किया गया है, तथापि, हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता histochemical प्रसंस्करण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल रेफरी में दी गई है। 37।

4. histochemical प्रसंस्करण

  1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर में भंग 4% paraformaldehyde युक्त एक शीशी में synaptically युग्मित न्यूरॉन्स की जोड़ी के साथ मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण और 24 घंटे के लिए टुकड़ा fixate। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए, 2.5% glutar का उपयोग कर टुकड़ा fixateएल्डिहाइड और 1% paraformaldehyde के।
  2. अगले दिन पर, कोई लगानेवाला युक्त सामान्य फॉस्फेट बफर में स्लाइस हस्तांतरण। 10 के लिए 8 बार - - 6 के लिए फॉस्फेट बफर के साथ स्लाइस धो 15 मिनट प्रत्येक अतिरिक्त लगानेवाला दूर करने के लिए।
  3. अंतर्जात peroxidase प्रतिक्रिया को कम से कम करने के लिए एक 3% एच में 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 2 2 हे समाधान 20 मिनट के लिए स्लाइस सेते हैं। मजबूत बुलबुला गठन का निरीक्षण करें। आगे कोई बुलबुले का उत्पादन कर रहे हैं जब तक प्रतिक्रिया जारी रखें। किसी भी शेष एच 2 ओ 2 दूर करने के लिए (10 मिनट प्रत्येक के लिए) 8 बार - तो फिर, 6 के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में स्लाइस कुल्ला।
  4. Immunocytochemical और वर्णजनीय प्रतिक्रियाओं
    Biocytin से भरे न्यूरॉन्स के दृश्य diaminobenzidine साथ उत्प्रेरित एक streptavidin-biotinylated हॉर्सरैडिश peroxidase प्रतिक्रिया के आधार पर किया जाता है; यह एक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ एक कुरकुरा दाग पैदा करता है कि एक अंधेरे वेग पैदा करता है। निम्न कार्यविधियों वर्णजनीय प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: <राजभाषा>
  5. निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार एबीसी समाधान तैयार है। (; केवल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए टेबल 6) और अंधेरे में लगभग 30 मिनट के लिए समाधान रखने 150 μl 10% ट्राइटन X100 के साथ पूरक 14.55 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर जोड़ें। इस समाधान हे / एन उपयोग करने से पहले स्लाइस सेते हैं।
  6. आरटी पर 1 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर और अंधेरे में एबीसी समाधान में स्लाइस सेते हैं। इसके बाद, एक फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस हे / एन रहते हैं। अगली सुबह, एक अतिरिक्त घंटे के लिए आरटी पर स्लाइस सेते हैं।
  7. इस के बाद, फॉस्फेट बफर में 10 मिनट प्रत्येक के लिए स्लाइस में कम से कम चार बार कुल्ला। फिर, एक निकल तेज 3-3'-diaminobenzidine समाधान (तालिका 7) के 2 मिलीलीटर में अंधेरे में लगभग 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर सेते हैं। Diaminobenzidine से निपटने और केवल धूआं हुड के नीचे का उपयोग करते समय बहुत सावधान रहे; यह भी बहुत कम मात्रा में अत्यंत कैंसर है।
  8. 6.5 μl 3% एच 2 ओ 2 जोड़ें diaminobenzidine युक्तसमाधान। भूरे रंग-काला दाग न्यूरॉन्स स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं जब तक एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत वर्णजनीय प्रतिक्रिया मॉनिटर। फिर, फॉस्फेट बफर में स्लाइस कई बार धोने से तुरंत प्रतिक्रिया बंद करो।
  9. चिपकने वाला, लेपित silane- Histobond या gelatinized मानक वस्तु स्लाइड्स पर दाग न्यूरॉन्स के साथ माउंट स्लाइस।
  10. कम से कम 80% आर्द्रता हे / एन के साथ एक नम कक्ष में स्लाइड रखें। अगले दिन, स्लाइस हवा शुष्क एक और 10 मिनट के लिए करते हैं। उन्हें निर्जलीकरण के क्रम में - (100% 20) इथेनॉल की सांद्रता में वृद्धि के साथ समाधान में, स्थानांतरण स्लाइड embedding करने से पहले।
    नोट: निर्जलीकरण प्रक्रिया अन्यथा वृक्ष के समान और axonal प्रक्रियाओं में विकृतियों 37 होने की संभावना हैं धीमी गति से होना चाहिए। एक वैकल्पिक एम्बेडिंग प्रक्रिया चुना जाता है, जैसे, ग्लिसरॉल आधारित Moviol के साथ एक, एक निर्जलीकरण की आवश्यकता नहीं है; हालांकि इस इसलिए एक inhomogeneous टुकड़ा के संपीड़न और एक विकृत न्यूरोनल morpholo में परिणाम की संभावना हैGY।
  11. अंत में, xylol में 10 मिनट के लिए सेते प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एक हाइड्रोफोबिक एम्बेड माध्यम में स्लाइस एम्बेड और शीर्ष पर एक अति पतली coverslips जगह है। स्लाइड आरटी पर 20 मिनट के लिए दो सूखी।

5. Neuronal पुनर्निर्माण और synaptic संपर्क स्थानीयकरण

  1. एक 60X / 100X तेल विसर्जन उद्देश्य और इष्टतम स्थानिक संकल्प के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक कंडेनसर से लैस एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत biocytin लेबल न्यूरॉन्स के साथ स्लाइड जांच करते हैं। कि axonal BOUTONS सुनिश्चित करने और वृक्ष के समान कांटा स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं।
  2. प्रणाली अनुरेखण एक वाणिज्यिक न्यूरॉन का उपयोग कर न्यूरॉन्स या synaptically युग्मित न्यूरॉन जोड़े ट्रेस 3 डी न्यूरोनल पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें)। यहां तक ​​कि छोटे axonal या वृक्ष के समान कोलेटरल पता लगाने के लिए निरंतर दृश्य निरीक्षण के तहत मैन्युअल रूप अनुरेखण बाहर ले। Synaptically युग्मित न्यूरॉन्स से बनती रिकॉर्डिंग के लिए मार्गदर्शन ट्रेसिंग अभी की विधि हैचुनाव जैसे, पूर्व या पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन के लिए या तो एक axonal प्रोफ़ाइल के रोपण पर्याप्त पुनर्निर्माण अनुभव की आवश्यकता है।
  3. यदि आवश्यक हो, axonal BOUTONS और / या वृक्ष के समान कांटा की गिनती कर सकते हैं। कांटा या यहां तक कि रीढ़ की हड्डी के उपप्रकार और axonal BOUTONS जैसे, cortical परत या क्षेत्र के लिए सम्मान के साथ एक विशेष वितरण और घनत्व प्रदर्शन कर सकते हैं, क्योंकि यह neuronal सेल प्रकार चिह्नित करने के लिए मदद कर सकता है।
  4. Synaptically युग्मित न्यूरॉन जोड़े के लिए उपलब्ध है, उच्चतम बढ़ाई करीब appositions के लिए प्रीसानेप्टिक अक्षतंतु और पोस्टअन्तर्ग्रथनी डेन्ड्राइट की जाँच करें। एक axonal bouton के निरीक्षण और एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी या शाफ्ट एक ख्यात अन्तर्ग्रथनी संपर्क के रूप में माना जा सकता है एक ही फोकल हवाई जहाज़ में है। पुनर्निर्माण में इस संपर्क निशान।
  5. ट्रेसिंग कार्यक्रम के उपयुक्त खंड में सभी तीन स्थानिक आयामों में सिकुड़न के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण ठीक कर लें।
    नोट: निर्धारण के दौरान, histochemical प्रसंस्करणऔर निर्जलीकरण पर्याप्त यांत्रिक विरूपण और संकोचन होते हैं; इस axonal और वृक्ष के समान लंबाई माप प्रभावित करते हैं और गंभीर रूप से उनके स्थानिक व्यवस्था बिगाड़ना जाएगा। Embedding माध्यम के लिए संकोचन सुधार कारकों Z-दिशा 37 के लिए ~ एक्स और वाई दिशाओं के लिए 1.1 और ~ 2.1 रहे हैं।
  6. एक मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण के लिए (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) Neurophysiology के लिए एक डाटा विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करें।

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Representative Results

बनती रिकॉर्डिंग आकृति विज्ञान पहचान विश्वविद्यालय या द्विदिश synaptic कनेक्शन की एक में गहराई लक्षण वर्णन के लिए पसंद की विधि के रूप में अच्छी तरह से खाई जंक्शन (इलेक्ट्रिकल) कनेक्शन (चित्रा 1) कर रहे हैं। Somatosensory बैरल कॉर्टेक्स की परत 4 में एक बनती रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। यूनिडायरेक्शनल उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic कनेक्शन दोनों (चित्रा 1 बी, सी) लक्षण वर्णन किया जा सकता है। इसके अलावा बनती रिकॉर्डिंग एक जोड़ी में दोनों न्यूरॉन्स पूर्व और एक दूसरे से पोस्टअन्तर्ग्रथनी हैं जिसमें कनेक्शन से, यानी द्विदिश synaptic कनेक्शन, से रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देते हैं। यह एक निरोधात्मक interneuron और एक उत्तेजक न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग से पता चलता है जो चित्रा -1, में सचित्र है। पोस्टअन्तर्ग्रथनी निरोधात्मक interneuron (काला निशान) में एक EPSP में एक कार्रवाई उत्तेजक न्यूरॉन में संभावित (लाल निशान) का परिणाम जानने। हालांकि, एक संभावित कार्रवाई EVO है जबinterneuron में ked, एक IPSP। उत्तेजक न्यूरॉन में दर्ज चित्रा 1E यह अंतराल जंक्शन के माध्यम से या एक अंतराल जंक्शन और एक रासायनिक अन्तर्ग्रथन के माध्यम से युग्मित न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करने के लिए भी संभव है कि पता चलता जा सकता है। पारस्परिक और खाई जंक्शन कनेक्शन केवल इतनी दूर नहीं बल्कि किसी भी अन्य तकनीक से बनती electrophysiological रिकॉर्डिंग से पहचाना जा सकता है।

पैच पिपेट और electrophysiological रिकॉर्डिंग के माध्यम से युग्मित न्यूरॉन्स की biocytin भरने के संयोजन अन्तर्ग्रथनी गुणों के न्यूरॉन्स की रूपात्मक संपत्तियों की एक संबंध की अनुमति देता है। Histochemical प्रसंस्करण न्यूरॉन्स उतारना चाहते टुकड़ा (2A चित्रा) में अंधेरा संरचनाओं के रूप में दिखाई दे रहे हैं के बाद। इसके बाद दर्ज की neuronal सेल जोड़ी आकृति विज्ञान खंगाला जा सकता है और neuronal सेल प्रकार की पहचान की जा सकती है। इसके अलावा, यह ख्यात synaptic संपर्कों (2A चित्रा सही पैनलों और Figur की संख्या और स्थान की पहचान करने के लिए संभव हैई 2 बी इनसेट)। चित्रा 2B में दिखाया गया न्यूरॉन जोड़ी आपस में जुड़ा हुआ है और इसलिए synaptic संपर्कों दोनों न्यूरॉन्स पर स्थापित कर रहे हैं। सटीकता 16,21,26 के 90% डिग्री - हमारे हाथ में, ख्यात, प्रकाश माइक्रोस्कोप पहचान synaptic संपर्कों एक 80 के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ सच synaptic संपर्कों के रूप में पुष्टि की गई।

चित्रा 3 में वर्णित खोज प्रक्रिया का उपयोग कर पहचाना जा सकता है इस translaminar न्यूरोनल Microcircuit एक कम कनेक्शन संभावना है, लेकिन प्रति बैरल कॉर्टेक्स के neocortical परत 6 में एक प्रीसानेप्टिक पिरामिड न्यूरॉन और परत 4 में एक उत्तेजक काँटेदार न्यूरॉन से एक बनती रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण से पता चलता है एक कम कनेक्टिविटी के साथ neuronal कनेक्शन के लिए 3.1.9 - 3.1.1 कदम। बनती रिकॉर्डिंग तकनीक के साथ यह न्यूरो के बीच कुछ लंबी दूरी translaminar कनेक्शन (इस उदाहरण) या कनेक्शन के मामले के रूप में एक बहुत ही कम कनेक्टिविटी के साथ synaptic कनेक्शन की पहचान करने के लिए संभव हैअलग कॉर्टिकल 'कॉलम' (इंटर-स्तंभ synaptic कनेक्शन) में स्थित एनएस।

चित्रा 1
Synaptically युग्मित सेल जोड़े से 1. बनती रिकॉर्डिंग चित्रा। (ए) वाम, एक मस्तिष्क टुकड़ा आईआर-डीआईसी छवि। ठीक है, एक interneuron (ऊपर) और एक उत्तेजक न्यूरॉन में एक उत्तेजक न्यूरॉन (नीचे)। (बी) के एक प्रीसानेप्टिक संभावित कार्रवाई (ऊपर) एक और उत्तेजक न्यूरॉन (नीचे) में एक monosynaptic उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संभावित (EPSP) elicits। (सी) एक एक प्रीसानेप्टिक निरोधात्मक interneuron में संभावित कार्रवाई (ऊपर) एक उत्तेजक न्यूरॉन (नीचे) में एक monosynaptic निरोधात्मक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संभावित (IPSP) उदाहरण भी देते हैं। (डी) एक प्रीसानेप्टिक उत्तेजक न्यूरॉन में एक संभावित कार्रवाई (ऊपर बाएं) एक EPSP (नीचे बाएं) में उदाहरण भी देते हैं एक निरोधात्मक interneuron। बदले में, एक संभावित कार्रवाईनिरोधात्मक interneuron (शीर्ष सही) में (नीचे सही)। (ई) एक न्यूरॉन में मौजूदा इंजेक्शन द्वारा हासिल अति और depolarizing वोल्टेज कदम की एक श्रृंखला (ऊपर बाएं) एक अंतर-जंक्शन में परिलक्षित होता है उत्तेजक न्यूरॉन में एक IPSP elicits युग्मित दूसरे न्यूरॉन (बाएं नीचे)। इसके अलावा, पहली न्यूरॉन में एक प्रीसानेप्टिक संभावित कार्रवाई (शीर्ष सही) दूसरे न्यूरॉन (नीचे सही) की झिल्ली क्षमता में एक देर गहरी hyperpolarization (IPSP) द्वारा पीछा एक प्रारंभिक छोटे विध्रुवण (छोटी बाल, इनसेट) उदाहरण भी देते हैं। (बी) में स्केल सलाखों (सी) के लिए भी लागू होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
Synaptic संपर्कों और रूपात्मक reconstr चित्रा 2. पहचानbiocytin से भरे सेल जोड़े की uction। (ए) वाम, एक काँटेदार तारामय और रिकॉर्डिंग के दौरान biocytin से भर गया कि परत 4 में एक तेजी से spiking interneuron जिसमें दोनों तरफ के युग्मित सेल जोड़ी के कम बिजली सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। प्रीसानेप्टिक काँटेदार न्यूरॉन और पोस्टअन्तर्ग्रथनी interneuron के बीच प्रकाश माइक्रोस्कोप की पहचान की ख्यात उत्तेजक synaptic संपर्कों हरी डॉट्स द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। ख्यात पारस्परिक निरोधात्मक synaptic संपर्कों नीले डॉट्स द्वारा संकेत कर रहे हैं। Synaptic संपर्कों का अधिकार, उच्च शक्ति छवियों। ग्रीन खुला हलकों, उत्तेजक संपर्कों; नीले खुला हलकों, निरोधात्मक संपर्क। परत बॉर्डर कम बिजली की खुर्दबीन के नीचे दाग मस्तिष्क टुकड़ा की cytoarchitectonic संरचना द्वारा निर्धारित किया गया है। (ए) और चित्रा 1C में दिखाया गया एक ही सेल जोड़ी (बी) Neurolucida पुनर्निर्माण। ब्लू, interneuron अक्षतंतु; लाल, interneuron सोमा और dendrite; हरे, काँटेदार न्यूरॉन अक्षतंतु; सफेद, काँटेदार न्यूरॉन सोमा और dendrite। इनसेटएक साथ ख्यात synaptic संपर्कों के साथ पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की somatodendritic डिब्बों से पता चलता है। बैरल आकृति तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा से बना कम बिजली उज्ज्वल क्षेत्र photomicrographs में पहचान की गई। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. बहुत कम कनेक्टिविटी अनुपात के साथ एक प्रतिनिधि अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन। (ए) एक परत 6 पिरामिड सेल में एक प्रीसानेप्टिक संभावित कार्रवाई (ऊपर) एक परत 4 स्टार पिरामिड न्यूरॉन में एक monosynaptic उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी संभावित (नीचे) उदाहरण भी देते हैं। स्थानीय इंट्रा-लामिना का कनेक्शन (≈1.0 मिसे) की तुलना में इस पार लामिना का कनेक्शन की लंबी विलंबता (> 3.0 मिसे) पर ध्यान दें। (बी) में postsynaptic responsएक परत 6 पिरामिड कोशिकाओं में हासिल 10 हर्ट्ज से कम दो कार्रवाई क्षमता को परत 4 स्टार पिरामिड न्यूरॉन के ई। स्थानीय कनेक्शन की अल्पकालिक अवसाद की तुलना में इस संबंध का अल्पकालिक सरलीकरण नोट (डेटा) नहीं दिखाया। एक ही कनेक्शन का ध्यान केंद्रित इमेजिंग (सी) विस्तारित गहराई में के रूप में (ए, बी)। इनसेट, एक परत 4 स्टार पिरामिड न्यूरॉन की somato / वृक्ष के समान डोमेन। एक तीर से चिह्नित एक प्रमुख शिखर डेन्ड्राइट की उपस्थिति पर ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मिमी जी / एल
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 0.186
ग्लूकोज़ 25 4.5
3 NaHCO 2.1
नाह 2 पीओ 4 1.25 0.173
2 CaCl 2 0.294
2 MgCl 1 0.095
Osmolarity ~ 310 mOsmol / एल
95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ मार डाला

रिकॉर्डिंग के दौरान छिड़काव के लिए तालिका 1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF)।

मिमी जी / एल
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 0.186
ग्लूकोज़ 25 4.5
3 NaHCO 25 2.1
नाह 2 पीओ 4 1.25 0.173
2 CaCl 1 0.147
2 MgCl 5 0.476
Myo-inositol 3 0.54
ना-पाइरूवेट 2 0.22
एस्कॉर्बिक अम्ल (विटामिन सी) 0.4 0.07
Osmolarity ~ 310 mOsmol / एल
95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ मार डाला

अपरिपक्व जानवरों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के लिए तालिका 2 कोशिकी समाधान।

मिमी जी / एल
सुक्रोज 206 70.51
KCl 2.5 0.186
ग्लूकोज़ 25 4.5
3 NaHCO 25 2.1
नाह 2 पीओ 4 1.25 0.173
2 CaCl 1 0.147
2 MgCl 3 0.286
Myo-inositol 3 0.54
ना-पाइरूवेट 2 0.22
एस्कॉर्बिक अम्ल (विटामिन सी) 0.4 0.07
Osmolarity ~ 310 mOsmol / एल
95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ मार डाला

परिपक्व जानवरों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के लिए तालिका 3. कोशिकी समाधान (ओंucrose खारा)।

मिमी जी / एल जी / 50 मिलीलीटर
कश्मीर gluconate 135 31.622 1.5811
KCl 4 0.298 0.0149
HEPES 10 2.384 0.1192
Phosphocreatine 10 2.552 0.1276
एटीपी-2 मिलीग्राम + 4 2.028 0.1014
जीटीपी-ना 0.3 0.156 0.0078
KOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें
Osmolarity ~ 300 mOsmol / एल
जोड़ें 3-5 मिलीग्राम / एमएल biocytin

टेबल 4. कम क्लोराइड पिपेट समाधान।

मिमी जी / एल जी / 50 मिलीलीटर
ना-gluconate 105 22.92 1.146
NaCl 30 1.76 0.088
HEPES 10 2.384 0.1192
Phosphocreatine 10 2.552 0.1276
एटीपी-2 मिलीग्राम + 4 2.028 0.1014
जीटीपी-ना 0.3 0.156 0.0078
NaOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें
Osmolarity ~ 300 mOsmol / एल

सारणी 5. उच्च एनएsynaptically युग्मित न्यूरॉन्स खोज के लिए पिपेट समाधान।

अनुपात एमएल
अभिकर्मक एक 1 0.15
अभिकर्मक बी 1 0.15
10% ट्राइटन X100 1 0.15
0.1 एम फॉस्फेट बफर 97 14.55
उपयोग करने से पहले अंधेरे में 30 मिनट के लिए रखा

Histochemical प्रतिक्रिया के लिए टेबल 6. एबीसी समाधान।

वजन आयतन
3-3'-diaminobenzidine 10 मिलीग्राम -
0.1 एम फॉस्फेट बफर - 20 मिलीलीटर
1% (एनएच 4) 2 नी (अतः 4) 2 - 5 - 10 μl
1% CoCl 2 - 5 μl
समाधान सरगर्मी जबकि 1% (एनएच 4) 2 नी (अतः 4) 2 और 1% CoCl 2 ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ रहे हैं।

टेबल diaminobenzidine (थपका) प्रतिक्रिया के लिए 7. समाधान।

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Discussion

Synaptically युग्मित उत्तेजक और / या निरोधात्मक न्यूरॉन्स से बनती रिकॉर्डिंग न्यूरोनल microcircuits के अध्ययन के लिए एक बहुत बहुमुखी दृष्टिकोण हैं। इतना ही नहीं इस दृष्टिकोण एक न्यूरॉन प्रकार के बीच synaptic कनेक्टिविटी अनुमान लगाने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन यह भी कनेक्शन और पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान के कार्यात्मक विशेषताओं का निर्धारण करने की अनुमति देता है करता है। इसके अलावा, एगोनिस्ट और / या प्रतिपक्षी आसानी टुकड़ा तैयारी में न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है। यह एक उदाहरण के लिए, synaptic प्रसारण 32 के गुणों का उपयोग कर या एक परिभाषित एकात्मक अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन की एक में गहराई लक्षण वर्णन पर neuromodulators के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, अन्तर्ग्रथनी रिहाई 16,17,38,39 की quantal विश्लेषण। रासायनिक और / या बिजली (जीएपी जंक्शन) synaptic कनेक्शन के ढूँढना इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए हम कनेक्टिविटी अनुपात और अपने पर निर्भर करता है, synaptic कनेक्शन खोजने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण सूचीबद्ध किया हैप्रकार (रासायनिक / इलेक्ट्रिकल)।

अक्षतंतु की कुल axonal लंबाई का केवल छोटे भागों बरामद कर रहे हैं इतना है कि टुकड़ा तैयारी का एक बड़ा नुकसान लंबी दूरी axonal अनुमानों के अक्सर पर्याप्त ट्रंकेशन है। कुछ पिरामिड प्रकार की कोशिकाओं के लिए, कर सकता है 90% करने के लिए या और भी अधिक खाते में अन्य cortical क्षेत्रों या subcortical क्षेत्रों के अनुमानों ले रही है जब ट्रंकेशन की डिग्री। यह सेल निकायों जिसमें से अधिक माइक्रोन 300> से अलग कर रहे हैं न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्शन के अध्ययन के लिए टुकड़ा तैयारी अनुपयुक्त प्रदान करता है। हालांकि, तीव्र टुकड़ा तैयारी में, स्थानीय axonal अनुमानों, विशेष रूप से स्थानीय interneurons के उन आम तौर पर क्योंकि उनके axonal arbors के सीमित क्षैतिज और खड़ी क्षेत्र अवधि के वृक्ष के समान और axonal ट्रंकेशन (~ 10% कम या ज्यादा) का एक अपेक्षाकृत कम डिग्री के साथ बरामद कर रहे हैं । न्यूरॉन्स के इन प्रकार शामिल कनेक्शन इसलिए सटीकता और reliab के एक उच्च डिग्री के साथ होती जा सकता हैility और काफी हद तक सही कनेक्टिविटी अनुमानों निकलेगा। इन स्थानीय synaptic कनेक्शन के अपवाद के साथ, टुकड़ा तैयारी में प्राप्त दो न्यूरॉन प्रकार के बीच कनेक्टिविटी अनुपात के लिए निरपेक्ष मूल्यों synaptic कनेक्शन intralaminar translaminar या गैर स्थानीय, लंबी दूरी के रूप में बड़े अंतर-दैहिक दूरी के साथ न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से, अत्यधिक समस्याग्रस्त हैं । टुकड़ा करने की क्रिया की स्थिति एक परिभाषित उम्र में एक दिया अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है जब यह समस्या विकट हो जाती है। ऐसे घने इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म पुनर्निर्माण 40 और संरचनात्मक axo-वृक्ष के समान ओवरलैप 41 के रूप में और अधिक यथार्थवादी कनेक्टिविटी का अनुमान उपन्यास के तरीके के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, यहां तक ​​कि इन तकनीकों के खाते में निरोधात्मक interneurons और भी उत्तेजक न्यूरॉन्स की उच्च विविधता ले जाना है।

कनेक्टिविटी के अनुमान के साथ एक अतिरिक्त समस्या यह है कि बाहर का synaptic संपर्कों, जैसे, पिरामिड न्यूरॉन्स के शिखर गुच्छा पर उन लोगों के, हो सकता हैपता लगाने से बचने। सोमा पर मापा जाता है जब उनके अन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रिया के आयाम बहुत छोटा है और शोर में गायब हो जाने की संभावना है (क्यूई एट अल।, 2014, प्रस्तुत करने में)। हालांकि, इस तरह की समस्या बनती रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी synaptic कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल अन्य तकनीकों के साथ घटित होगा।

(यानी, बंदी ग्लूटामेट की तस्वीर रिलीज के द्वारा या channelrhodopsin की सक्रियता से) न्यूरोनल microcircuits की हाल ही में वर्ष के प्रकाश प्रेरित सक्रियण में भी एक बड़े पैमाने 42-52 पर, न्यूरोनल कनेक्टिविटी की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन ऑप्टिकल दृष्टिकोण के साथ यह प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन प्रकार की संरचनात्मक गुणों की पहचान करना संभव नहीं है। इसके अलावा, एक neuronal कनेक्शन द्वारा स्थापित synaptic संपर्कों की संख्या और स्थान कम से कम नहीं तिथि करने के लिए, नहीं पहचाना जा सकता। बनती रिकॉर्डिंग, दूसरे हाथ पर, दोनों पूर्व और postsynaptic Neur के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैंएक synaptic Microcircuit में प्रकारों पर। यह कई अध्ययनों GABAergic interneurons और उत्तेजक न्यूरॉन्स दोनों अपनी आकृति विज्ञान के लिए सम्मान और synaptic फिजियोलॉजी 53-56 के साथ बेहद विविध रहे हैं कि पता चला है के बाद से विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, दोनों पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स की पहचान एक synaptic कनेक्शन 57 के वर्णन के लिए एक शर्त है। अंत में, बनती रिकॉर्डिंग के synaptic कनेक्शन के विभिन्न विन्यास (पारस्परिक कनेक्शन, coexisting अंतराल जंक्शनों और रासायनिक अन्तर्ग्रथन) की रिकॉर्डिंग की अनुमति है। इसलिए, बनती रिकॉर्डिंग तकनीक न्यूरोनल microcircuits के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण रहेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2 - 3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 95 पैच दबाना बनती रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स synaptic कनेक्शन अंतराल जंक्शनों लेबलिंग biocytin संरचना समारोह सहसंबंध
तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग
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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D.… More

Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).

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