Abstract
La combinazione di permutazione registrazioni clamp da due (o più) neuroni sinapticamente accoppiati (registrazioni appaiati) in fettine cerebrali acute con simultanea riempimento biocitina intracellulare consente un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Con questo metodo è possibile identificare e caratterizzare sia neuroni postsinaptici pre e dalla loro morfologia e modello di risposta elettrofisiologica. Registrazioni accoppiati consentono studiare gli schemi di connettività tra questi neuroni e le proprietà di entrambi trasmissione sinaptica chimica ed elettrica. Qui diamo una descrizione step-by-step le procedure necessarie per ottenere registrazioni affidabili abbinati insieme ad un recupero ottimale della morfologia neurone. Descriveremo come coppie di neuroni collegati tramite sinapsi chimici o giunzioni sono identificati nei preparati fetta cervello. Vi illustrerà come i neuroni vengono ricostruiti per ottenere la loro morfologia 3D del Dendritic e dominio assonale e come contatti sinaptici sono identificati e localizzati. Discuteremo anche le avvertenze e le limitazioni della tecnica di registrazione associato, in particolare quelli associati con troncamenti dendritiche e assonale durante la preparazione di fettine di cervello, perché questi influenzano fortemente le stime di connettività. Tuttavia, a causa della versatilità dell'approccio di registrazione accoppiato rimarrà uno strumento prezioso nel caratterizzare diversi aspetti della trasmissione sinaptica a microcircuiti neuronali identificati nel cervello.
Introduction
Microcircuiti neuronali tra due neuroni sinapticamente accoppiati sono gli elementi costitutivi di reti su larga scala nel cervello e sono le unità fondamentali di elaborazione delle informazioni sinaptica. Un prerequisito per la caratterizzazione di tali microcircuiti neuronali è conoscere la morfologia e le proprietà funzionali di entrambi i neuroni Partner di pre-e post-sinaptici, il tipo di connessione sinaptica (s) e la sua struttura e meccanismo funzionale. Tuttavia, in molti studi di connessioni sinaptiche almeno uno dei neuroni in un microcircuito non è ben caratterizzata. Ciò risulta dai protocolli di stimolazione relativamente non specifici, spesso utilizzate in studi di connettività sinaptica. Pertanto, le proprietà strutturali e funzionali del neurone presinaptico sono o non identificati affatto o solo in misura piuttosto piccola (cioè, l'espressione di proteine marker ecc). Registrazioni appaiati in combinazione con colorazione intracellulare mediante marcatori such come biocitina, neurobiotin o coloranti fluorescenti sono più adatti per lo studio di piccoli microcircuiti neurali. Questa tecnica permette di indagare molti parametri strutturali e funzionali di una connessione sinaptica morfologicamente identificato allo stesso tempo.
I cosiddetti «unitario» connessioni monosinaptici tra due neuroni sono stati studiati in entrambe le regioni cerebrali corticali e subcorticali 1-10 su preparazioni fetta acuta. Inizialmente, microelettrodi taglienti sono stati utilizzati in questi esperimenti; successivamente, la registrazione patch clamp è stato impiegato per ottenere registrazioni di segnali sinaptici con un livello di rumore inferiore ed una risoluzione temporale migliorata.
Un importante progresso tecnico è stato l'uso di contrasto interferenziale infrarossi (IR-DIC) ottiche 11-14, una tecnica microscopica che ha migliorato notevolmente la visibilità e l'identificazione dei neuroni nella fetta cervello in modo che è diventato possibile to ottenere registrazioni individuate visivamente connessioni sinaptiche 15-17. In generale, le registrazioni coppie sono fatte in fettine acute; solo pochissime pubblicazioni sono disponibili registrazioni segnalazione di neuroni sinapticamente collegati in vivo 18-20.
Il vantaggio più importante di registrazioni accoppiati è il fatto che una caratterizzazione funzionale può essere combinato con una analisi morfologica sia la luce e elettroni livello microscopico (vedi ad es., 7,16,21). Dopo l'elaborazione istochimico, la morfologia dendritica e assonale della coppia neurone sinapticamente collegato è tracciata. Successivamente, è possibile quantificare caratteristiche morfologiche quali lunghezza, densità spaziale, orientamento, ramificazione ecc Questi parametri possono quindi fornire una base per una classificazione obiettivo di una connessione sinaptica specifica. Inoltre, contrariamente alla maggior parte altre tecniche utilizzate per lo studio connecti neuronaliVity, abbinato registrazioni consentono anche l'individuazione dei contatti sinaptici per connessioni sinaptiche unitari. Questo può essere fatto direttamente utilizzando una combinazione di luce e di microscopia elettronica 16,21-27 o utilizzando Imaging di calcio 28,29 di spine dendritiche. Tuttavia, con quest'ultimo approccio unico eccitatoria ma non connessioni inibitorie possono essere studiate in quanto richiede flusso di calcio attraverso i canali recettori postsinaptici.
Oltre ad un'analisi dettagliata della trasmissione sinaptica ad un microcircuito accoppiato registrazioni neuronali definite anche permettere lo studio di regole di plasticità sinaptica 30,31 o - in combinazione con l'applicazione agonista / antagonista - la modulazione della trasmissione sinaptica da neurotrasmettitori come acetilcolina 32 e adenosina 33.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la Direttiva UE per la protezione degli animali, del benessere degli animali legge tedesca (Tierschutzgesetz) e le linee guida della Federazione of European Laboratory Animal Science Association.
1. Set-up per Elettrofisiologia
Prima di iniziare con la registrazione accoppiato, un elettrofisiologia set-up deve essere costruito. Una breve descrizione di come un tale set-up è montato è il seguente:
- Installare un tavolo antivibrante in cui verranno inseriti microscopio, i manipolatori e delle altre apparecchiature.
NOTA: vibrazione o qualsiasi altro tipo di movimento deve essere il più piccolo possibile per la registrazione da connessioni sinaptiche perché questo richiede un cambiamento di pipette (ricerca elettrodo sostituito da elettrodo di registrazione). - Inserire una gabbia di Faraday attorno al tavolo antivibrante per ridurre il rumore elettrico. Collegare tutte le apparecchiature all'interno del Faraday cage con la massa elettrica.
- Installare un microscopio con un asse motorizzato attenzione che si basa su un tavolo xy motorizzato sul tavolo anti-vibrazioni secondo le linee guida del produttore. Questo consente di spostare il microscopio affidabile ai neuroni che non sono nello stesso campo di vista, come è il caso per le connessioni translaminari nella neocorteccia.
- Installare una telecamera sulla porta fotocamera del microscopio e collegarlo analogici e / o digitali schermi di osservare la preparazione fetta e il movimento degli elettrodi. Utilizzare una fotocamera, che può essere commutato tra un basso e un ingrandimento ad alta potenza per ottenere una visione d'insieme e un close-up, rispettivamente, della coppia di cellule neuronali sinapticamente accoppiato. Questo aiuta anche a controllare il movimento degli elettrodi di patch.
- Installare una tabella campione contenente un inserto per la camera da bagno (forato internamente da un blocco Perspex) per la preparazione fetta cervello. Questa tabella campione non deve essere collegato almicroscopio, cioè, deve essere fissato alla tavola dell'aria e il microscopio dovrebbe risultare maneggevole sotto di essa.
- Mount due (o più se richiesto) micromanipolatori alta precisione che può essere spostato in tre dimensioni. Installare patch-clamp preamplificatore sui manipolatori e collegarli all'amplificatore principale.
NOTA: Se necessario manipolatori aggiuntivi possono essere installati per esempio, più di due pre-amplificatori, elettrodi di stimolazione extracellulari, i sistemi di consegna di droga, ecc - Posizionare la camera vasca nella tabella campione. Installare una soluzione di ingresso e di uscita e collegarli al sistema di perfusione.
- Utilizzare una pompa peristaltica per mantenere la perfusione della camera di registrazione con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF Tabella 1) ad una portata stabile di 4 - 6 ml / min per la vitalità ottimale slice.
NOTA: Non superare questa portata in modo significativo in quanto si tradurrà in turbolenza nel ASCF e quindi il movimento della fetta. Installare i titolari per la sonda di temperatura e Ag / AgCl elettrodo di terra sul tavolo del campione. Ciò è necessario per consentire la sonda e l'elettrodo per campionare il bagno nella camera. - Per una buona visibilità dei neuroni nella preparazione fetta utilizzare illuminazione a infrarossi al microscopio. Questo riduce la diffrazione della luce e, quindi, la sfocatura delle immagini. Assicurarsi che il microscopio è dotato di ottica di contrasto di interferenza differenziale per ottenere un 'visualizzazione 3D'-like. Questo aiuterà patch neuroni e consentire il targeting neuroni profondi nella fetta (60 micron o più profonda).
- Durante l'esperimento, mantenere fettine cerebrali in una camera sperimentale con un vetrino di vetro nella parte inferiore. Posizionare un 'arpa di platino' sulla parte superiore della fetta di impedire fette di fluttuare. Un'arpa platino è realizzato a forma di U, filo di platino appiattito con stringhe di filo interdentale incollata su di essa.
- Mantenere la ACSF perfusione fetta ad una temperatura di 32-35 ° C per assicurare optControllo IMAL di ossigenazione e di pH. Questo può essere fatto riscaldando la soluzione con un dispositivo Peltier installato vicino al flusso ACSF nella camera da bagno.
NOTA: Utilizzare la copertura ultrasottile scivola in modo che anche i condensatori microscopio con un alto apertura numerica ea breve distanza di lavoro possono essere focalizzati sul campione. Ciò è necessario per un'illuminazione ottimale della fetta.
Per un'immagine e una descrizione di un elettrofisiologia set-up ottimizzata per registrazioni appaiati nella preparazione fetta cervello veda la Figura 4 Ref. 34.
2. Cervello Slice Preparazione
- Lievemente anestetizzare l'animale da cui il tessuto cerebrale deve essere preso con isoflurano (concentrazione finale <0,1%).
NOTA: Altri anestetici possono anche essere utilizzati. L'uso dell'anestetico dovrebbe ottemperare alle raccomandazioni e norme del rispettivo comitato animale. Verificare sempre che l'animale non è irritata o sotto stress dopo l'aggiuntal'anestetico. - Decapitare l'animale, aprire il cranio e rimuovere il cervello più rapidamente possibile utilizzando la procedura descritta in Refs. 34,35.
- Trasferire il cervello in raffreddata (4 ° C) liquido cerebrospinale artificiale aerato con una miscela di gas carbogeno con 95% O 2 e 5% CO 2.
- Isolare la regione del cervello che deve essere studiato.
NOTA: I parametri per ottenere la conservazione ottimale e minima troncamento dei dendriti e degli assoni dei neuroni pre- e post-sinaptici dovrebbe essere determinata in anticipo per ogni connessione neuronale e stadio di sviluppo sotto inchiesta. In una fetta cerebrale ottimale sezionato, l'assone del neurone presinaptico non è richiesto di essere parallelo alla superficie della fetta. Piuttosto, dovrebbero puntare a fette con un angolo basso. L'vale per il dendrite apicale dei neuroni piramidali postsinaptici; questo dovrebbe essere controllato sotto il microscopio ottico. Ciò è particolarmente importante per non locale o tconnessioni sinaptiche ranslaminar, vale a dire., dove somata pre- e post-sinaptico sono più di 200 micron a parte e la probabilità di troncamenti dendritiche e assonali sarà probabilmente notevolmente superiore per le connessioni locali. - Trasferire il cervello alla camera microtomo. Sulla base di risultati empirici, diverse soluzioni per affettare extracellulare vengono utilizzati a seconda dell'età dell'animale (vedi tabelle 2 e 3; informazioni utili possono anche essere trovato sotto ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Tagliare il cervello fino a quando la regione di destinazione è visibile.
- Per ottenere fette con una buona visibilità delle cellule, tagliare 300-400 micron di spessore fette di cervello se l'animale è maturo (> 3 settimane). Se l'animale è immaturo (1 ° al 2 ° settimana post-natale per topi e ratti) fette possono essere tagliati fino ad uno spessore di circa 600-800 micron, senza pregiudicare sostanzialmente visib cellulareilità.
NOTA: Questo migliorerà la stabilità di fette "immaturi" e ridurre il numero di possibili troncamenti di lungo raggio dendritiche e collaterali assonale. - Trasferire fette dalla camera microtomo a una camera di incubazione riempito con la soluzione affettatura aerato con una miscela di 95% O 2 e 5% CO 2. Conservare le fette nella camera di incubazione per almeno 30 minuti per 1 ora a RT o sia a ~ 30 ° C, a seconda del tipo di esperimento.
3. Paired patch-clamp registrazione e biocitina riempimento
A seconda del tipo di connessione sinaptica tre differenti approcci vengono utilizzati per trovare neuroni sinapticamente accoppiati. Se la probabilità di connessione è bassa (come può essere previsto per i collegamenti più eccitatorie), procedere come segue:
- Connessioni neuronali con connettività bassa
- Riempire le pipette di patch con una soluzione interna della composizione di cuiin Tabella 4 Per tutte le registrazioni nella configurazione whole-cell aggiungere biocitina a concentrazioni comprese tra 3 -. 5 mg / ml alla soluzione interna (pipetta) per ottenere buoni risultati di colorazione per i neuroni pre- e postsinaptici. Lasciare biocitina diffusa nella cella per almeno il 15 - 30 min (a seconda delle dimensioni del neurone).
NOTA: Non aggiungere biocitina alla soluzione utilizzata nelle pipette "ricerca di seguito indicati. - Patch un neurone postsinaptico putativo in modalità tutto-cell. Utilizzare pipette di patch con un lungo e sottile gambo. Questo facilita la manovrabilità della pipetta all'obiettivo e riduce gli artefatti di movimento che possono verificarsi quando l'elettrodo viene introdotto nella fetta.
- Poi, patchare un potenziale neurone presinaptico in una configurazione della cella-attached con una 'ricerca' di patch pipette di 8-10 resistenza MW e un piccolo diametro della punta. Con queste pipette stabilire una patch cell-attached 'loose'. Fill pipetta 'ricerca' con una soluzione interna in cui K + è sostituito da Na + (Tabella 5) per non depolarizzazione neuroni durante la ricerca di una cellula presinaptica.
NOTA: Il 'loose' guarnizione, non è nella gamma GΩ ma in genere circa 30-300 MW. - Tenere il potenziale di membrana sotto il sigillo 'loose' a circa -30 a -60 mV in modalità morsetto corrente. Quindi, applicare grandi impulsi di corrente (0,2-2 Na) per sollecitare un potenziale d'azione nella cellula presinaptica potenziale. Osservare questo potenziale azione come un piccolo spighetta sulla risposta di tensione.
- Impostare la frequenza di stimolazione a 0,1 Hz per evitare run-down di una risposta postsinaptica. Utilizza frequenze di stimolazione più basse nel caso in cui il tessuto cerebrale è molto immaturo o la connessione sinaptica non molto affidabile.
- Nel caso il neurone 'postsinaptico' non risponde alla stimolazione della neu testato 'presinaptica'ron, la patch un nuovo neurone in modalità seal 'loose'. Non sostituire la 'ricerca' elettrodo di patch finché il sigillo con una resistenza di> è stabilito 30 MW. Verificare fino a 30 neuroni potenzialmente presinaptici in questo modo.
NOTA: per evitare di danneggiare il neurone durante la procedura di ricerca di patch clamp allentata, solo leggermente aspirazione deve essere applicato alla pipetta ricerca rispetto a quella applicata al whole-cell patch di pipetta. - Se la stimolazione negli sciolti 'Risultati modalità di tenuta in un EPSP / IPSP con una latenza <5 msec nel neurone postsinaptico rimuovere la' ricerca 'pipetta dalla neurone presinaptico.
- Sostituire la 'ricerca' pipetta di patch con un elettrodo zona piena di, soluzione interna regolare-biocitina contenenti. Garantire questa patch registrazione pipetta ha una resistenza di 4-8 MW; maggiore è la dimensione soma minore è la resistenza dell'elettrodo può essere.
- Patch il presinapticoneurone e registrare in whole-cell, modalità corrente-clamp. Suscitare potenziali d'azione da iniezione di corrente nei neuroni presinaptici e registrare la risposta postsinaptica. Memorizzare i dati su un computer per una successiva analisi off-line.
- Riempire le pipette di patch con una soluzione interna della composizione di cuiin Tabella 4 Per tutte le registrazioni nella configurazione whole-cell aggiungere biocitina a concentrazioni comprese tra 3 -. 5 mg / ml alla soluzione interna (pipetta) per ottenere buoni risultati di colorazione per i neuroni pre- e postsinaptici. Lasciare biocitina diffusa nella cella per almeno il 15 - 30 min (a seconda delle dimensioni del neurone).
- Connessioni neuronali con un alto connettività
NOTA: Per i microcircuiti neurali con un rapporto di connettività ad alta (> 30%), utilizzare una procedura diversa per trovare connessioni sinaptiche. Questa procedura è descritta di seguito ed è spesso utilizzato per la connessione sinaptica inibitoria che hanno in media un più alto rapporto di connettività rispetto alle connessioni eccitatorie 36. Non deve essere usato quando il rapporto di connettività scende al di sotto di questo valore.- Patch un neurone presinaptico direttamente in modalità tutto-cell. Poi, patchare un potenziale neurone postsinaptico, anche in modalità cellula intera. Entrambe le cellule devono essere sotto il controllo pinza. Elicit un potenziale di azione nella cellula presinaptica. Monitorare il neurone post-sinaptico potenziale per un postsypotenziale naptic.
- Nel caso in cui il neurone non mostra una risposta alla stimolazione presinaptica, un nuovo cerotto neurone in modalità whole-cell utilizzando un elettrodo cerotto riempito con soluzione interna regolari. Se viene trovata una connessione, non modificare la pipetta di patch, ma procedere con la registrazione. Quindi, procedere come al punto 3.1.9.
- Connessioni neuronali tramite gap giunzioni
NOTA: Per cercare (gap-junction) collegamenti elettrici utilizzare la procedura seguente, che è una versione modificata di quello utilizzato per le connessioni a bassa probabilità.- Patch un neurone postsinaptico nella configurazione patch clamp whole-cell.
- Successivamente, patchare un neurone presinaptico putativo nella configurazione loose-seal (bassa resistenza di tenuta di 30-300 MW) con una 'ricerca' di patch pipetta di 7 - 10 Resistenza MW. Questo pipetta deve essere riempito con la soluzione interna modificata alto Na + per la stimolazione loose-seal.
- INIEZt 100-300 msec lunghi impulsi di corrente iperpolarizzanti attraverso il sigillo 'loose'; il potenziale di comando pipetta deve essere impostata a circa -60 a -70 mV. Osservare una connessione gap junction se Questo stimolo provoca una piccola risposta iperpolarizzante nel neurone 'postsinaptico'.
- Disconnettere e ricollegare il neurone 'presinaptico' nel modo whole-cell e procedere come descritto sopra.
NOTA: Per assicurare una buona colorazione dei processi assonali e dendritiche, utilizzare il protocollo indicato di seguito. Questo protocollo è descritto brevemente qui, tuttavia, un protocollo dettagliato per l'elaborazione istochimiche utilizzato nel nostro laboratorio figura Ref. 37.
4. istochimica Processing
- Trasferire la fetta cervello con la coppia di neuroni sinapticamente accoppiati in una fiala contenente 4% paraformaldeide sciolta in tampone fosfato 0,1 M e fissare la fetta per 24 ore. Per la microscopia elettronica, fissare la fetta con 2,5% glutaraldeidi e 1% paraformaldeide.
- Il giorno successivo, il trasferimento le fette nel buffer normale fosfato non contenente fissativo. Lavare le fette con tampone fosfato per 6 - 8 volte per 10 - 15 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di fissativo.
- Incubare fette per 20 min in 3% H 2 O 2 in soluzione 0,1 M tampone fosfato di minimizzare la reazione perossidasi endogena. Osservare forte formazione di bolle. Continuare fino a quando la reazione si producono ulteriori bolle. Poi, lavare le fette in 0,1 M tampone fosfato per 6 - 8 volte (per 10 minuti ciascuna) per rimuovere qualsiasi residuo H 2 O 2.
- Reazioni immunocitochimiche e cromogenici
Visualizzazione neuroni biocitina-riempita si basa su una reazione perossidasi streptavidina-biotinilato catalizzata con diaminobenzidina; questo produce un precipitato scuro che produce una macchia croccante con una risoluzione spaziale elevata. Le seguenti procedure sono utilizzate per la reazione cromogenica: <ol> - Preparare la soluzione ABC come da protocollo del fabbricazione. Aggiungere a 14,55 ml di tampone fosfato supplementato con 150 microlitri 10% Triton X100 (Tabella 6; solo per microscopia ottica) e mantenere la soluzione per circa 30 minuti al buio. Incubare fette in questa soluzione O / N prima dell'uso.
- Incubare fette in soluzione ABC su un agitatore per 1 ora a RT e al buio. Successivamente, mantenere fette O / N a 4 ° C in un frigorifero. La mattina successiva, incubare fette a RT per un'altra ora.
- Dopo questo, risciacquare fette almeno quattro volte per 10 minuti ciascuno in tampone fosfato. Poi, incubare su un agitatore per circa 30 minuti al buio in 2 ml di una soluzione 3-3'-diaminobenzidina nickel-intensificata (Tabella 7). Fare molta attenzione quando si maneggiano diaminobenzidina e utilizzare solo sotto la cappa; è estremamente cancerogena anche a bassissime concentrazioni.
- Aggiungere 6,5 ml 3% H 2 O 2 al-diaminobenzidina contenentesoluzione. Monitorare la reazione cromogena al microscopio ottico fino neuroni macchiate marrone-nero sono chiaramente visibili. Quindi arrestare immediatamente la reazione lavando fette diverse volte in tampone fosfato.
- Mount fette con neuroni colorate su adesivo, Histobond silano rivestite o diapositive oggetto standard gelatinizzati.
- Conservare i vetrini in una camera umida con almeno l'80% di umidità O / N. Il giorno successivo, le fette lasciate asciugare per altri 10 min. Prima di incorporamento, trasferimento vetrini in soluzioni con concentrazioni crescenti di etanolo (20 - 100%) per disidratarsi loro.
NOTA: Il processo di disidratazione deve essere lento altrimenti distorsioni nei processi dendritiche e assonali probabile che si verifichino 37. Se si sceglie una procedura embedding alternativo, per esempio, quello con la base di glicerolo-Moviol, una disidratazione non è necessaria; tuttavia questo è suscettibile di provocare una compressione disomogenea della fetta e quindi un morpholo neuronale distortaGY. - Infine, incubare per 10 min in xilolo, incorporare le fette in un mezzo di inclusione idrofobica per la microscopia ottica e posizionare un ultra-sottili coprioggetto sopra. Lasciate asciugare i vetrini per 20 minuti a RT.
5. neuronale ricostruzione e Synaptic Contact Localizzazione
- Esaminare i vetrini con i neuroni biocitina marcato al microscopio ottico dotato di un obiettivo 60X / 100X immersione in olio e un condensatore con una apertura numerica elevata per risoluzione spaziale ottimale. Assicurarsi che assonale boutons e spine dendritiche sono chiaramente visibili.
- Trace neuroni o coppie neuroni sinapticamente accoppiato con un neurone commerciale sistema di rintracciabilità (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment) per ottenere ricostruzioni 3D neuronali. Effettuare tracciando manualmente sotto costante controllo visivo per rilevare anche piccoli assonale o collaterali dendritiche. Per le registrazioni accoppiati da neuroni sinapticamente accoppiati tracciamento manuale è ancora il metodo discelta per l'attribuzione di esempio, un profilo assonale sia al neurone pre o post-sinaptico richiede esperienza ricostruzione sostanziale.
- Se necessario, fare conti di boutons assonale e / o spine dendritiche. Perché spine o anche sottotipi della colonna vertebrale e boutons assonale possono presentare una specifica distribuzione e la densità rispetto a esempio, strato corticale o zona, questo potrebbe contribuire a caratterizzare tipi di cellule neuronali.
- Per le coppie di neuroni sinapticamente accoppiati, controllare l'assone presinaptica e dendriti postsinaptici per chiudere apposizioni al massimo ingrandimento disponibili. Osservare un bouton assonale e una spina dendritica postsinaptico o l'albero è nello stesso piano focale può essere considerato come contatto sinaptico putative. Segnare questo contatto nella ricostruzione.
- Correggere le ricostruzioni neuronali per ritiro in tutte e tre le dimensioni spaziali nella apposita sezione del programma tracciato.
NOTA: Durante la fissazione, elaborazione istochimichee disidratazione sostanziale deformazione meccanica e ritiro si verificano; questo influenzerà le misure di lunghezza assonale e dendritiche e gravemente distorcere la loro disposizione spaziale. Ritiro fattori di correzione per il mezzo di inclusione sono ~ 1.1 per direzioni X e Y e ~ 2.1 per direzione z 37. - Per una analisi morfologica quantitativa utilizzare un programma di analisi dei dati per la neurofisiologia (vedi Tabella di materiali specifici / Equipment).
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Representative Results
Registrazioni associati sono il metodo di scelta per una caratterizzazione approfondita delle connessioni sinaptiche uniformi o bidirezionali morfologicamente identificati così come giunzione gap collegamenti (elettrici) (Figura 1). Un esempio di una registrazione accoppiato in strato 4 della corteccia somatosensoriale barilotto è mostrato nella Figura 1A. Sia eccitatorio unidirezionale e connessioni sinaptiche inibitorie possono essere caratterizzati (Figura 1B, C). Inoltre registrazioni accoppiati consentono di registrare da connessioni sinaptiche bidirezionali, cioè, dalle connessioni in cui entrambi i neuroni in una coppia sono pre e postsinaptica l'uno all'altro. Questo è illustrato nella Figura 1D, che mostra registrazioni da interneurone inibitorio e un neurone eccitatorio. Suscitando un potenziale d'azione nel neurone eccitatorio (tracce rosse) risultati in un EPSP nel interneurone inibitorio postsinaptico (tracce nere). Tuttavia, quando un potenziale d'azione è evoked in interneuroni, un IPSP può essere registrato nel neurone eccitatorio. Figura 1E mostra che è anche fattibile registrare da neuroni accoppiati tramite gap junction o attraverso una giunzione gap e una sinapsi chimica. Connessioni di giunzione reciproche e gap possono essere identificati solo da registrazioni elettrofisiologiche accoppiati finora ma non da qualsiasi altra tecnica.
La combinazione di riempimento biocitina dei neuroni accoppiati tramite la pipetta di patch e le registrazioni elettrofisiologiche consente una correlazione di proprietà morfologiche dei neuroni alle proprietà sinaptiche. Dopo neuroni di elaborazione istochimiche sono visibili come strutture scure nel slice fissata (Figura 2A). Successivamente la coppia di cellule neuronali registrato può essere ricostruita morfologicamente ei tipi di cellule neuronali può essere identificato. Inoltre, è possibile identificare il numero e la posizione dei contatti sinaptici putativi (pannelli di destra Figura 2A e Figure 2B riquadro). La coppia neurone mostrato in Figura 2B è mutuamente collegato e contatti sinaptici quindi sono stabilite su entrambi i neuroni. Nelle nostre mani, putativi, luce microscopio identificati contatti sinaptici sono stati confermati come veri contatti sinaptici con il microscopio elettronico con un 80 - 90 gradi% di accuratezza 16,21,26.
La Figura 3 mostra un esempio di una registrazione accoppiato da un neurone piramidale presinaptico nello strato neocorticale 6 della corteccia canna e un neurone spinosa eccitatorio strato 4. Questo microcircuito neuronale translaminar ha una bassa probabilità di connessione ma può essere identificata utilizzando la procedura descritta in ricerca passi 3.1.1 - 3.1.9 per le connessioni neuronali con connettività bassa. Con la tecnica di registrazione associato è possibile identificare connessioni sinaptiche con una connettività molto basso come nel caso di alcune connessioni a lungo raggio (translaminari questo esempio) o connessioni tra neurons situati in diversi 'colonne' corticali (connessioni sinaptiche tra colonnari).
Figura 1. registrazioni associati da coppie di cellule sinapticamente accoppiati. (A) Sinistra, immagini IR-DIC di una fetta cervello. Destra, un interneurone (in alto) e un neurone eccitatorio (in basso). (B) Un potenziale d'azione presinaptica (in alto) in un neurone eccitatorio suscita un monosinaptico potenziale postsinaptico eccitatorio (EPSP) in un altro neurone eccitatorio (in basso). (C) An potenziale d'azione (in alto) in una interneuroni inibitori presinaptica evoca un monosinaptico potenziale postsinaptico inibitorio (IPSP) in un neurone eccitatorio (in basso). (D) un potenziale d'azione (in alto a sinistra) in un neurone eccitatorio presinaptico evoca un EPSP (in basso a sinistra) in un interneurone inibitorio. A sua volta, un potenziale d'azionenel interneurone inibente (in alto a destra) suscita un IPSP nel neurone eccitatorio (in basso a destra). (E) una serie di gradini di tensione iper e depolarizzanti indotte da iniezioni di corrente in un neurone (in alto a sinistra) si riflette in un gap giunzione accoppiato secondo neurone (in basso a sinistra). Inoltre, un potenziale d'azione presinaptico (in alto a destra) nel primo neurone evoca un piccolo depolarizzazione precoce (spikelet, riquadro) seguita da una profonda iperpolarizzazione tardi (IPSP) nel potenziale di membrana del secondo neurone (in basso a destra). Bar Scala a (B) si applicano anche a (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Identificazione dei contatti sinaptici e Ricostr morfologicauzione di coppie di cellule biocitina-riempita. (A) a sinistra, a bassa potenza microfotografia di una coppia di cellule reciprocamente accoppiato comprendente un stellate spinosa e interneuroni fast-spiking in livello 4 che sono stati pieni di biocitina durante la registrazione. Luce microscopicamente identificati presunti contatti sinaptici eccitatori tra il neurone presinaptico spinosa e il interneurone postsinaptica sono contrassegnati da punti verdi. Putativi reciproci contatti sinaptici inibitori sono indicati da puntini blu. Destra, immagini ad alta potenza di contatti sinaptici. Cerchi aperti verdi, contatti eccitatori; cerchi aperti blu, contatti inibitori. Confini layer sono stati determinati dalla struttura citoarchitettonica della fetta cervello macchiato al microscopio a bassa potenza. (B) Neurolucida ricostruzione della stessa coppia cellule mostrato in (A) e la Figura 1C. Blu, interneurone assone; rosso, interneuroni soma e dendriti; verde, spinoso neurone assone; bianco, spinosa neurone soma e dendriti. L'insertomostra i compartimenti Somatodendritic dei neuroni pre e post-sinaptici insieme ai contatti sinaptici putativi. Contorni Barrel state individuate negli bassa potenza microfotografie campo chiaro fatte dalla fetta cerebrale acuto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Una connessione rappresentante sinaptica con molto basso rapporto connettività. (A) Un potenziale azione presinaptico (in alto) in una cellula piramidale strato 6 evoca un potenziale postsinaptico eccitatorio monosinaptico (basso) in una stella piramidale neurone strato 4. Notare la lunga latenza (> 3.0 msec) di questo collegamento trans-laminare rispetto a quella dei collegamenti intra-laminare locali (≈1.0 msec). (B) respons postsinapticae di livello 4 stelle piramidale neurone a due potenziali d'azione a 10 Hz suscitato in uno strato di 6 cellule piramidali. Nota facilitazione a breve termine di questa connessione rispetto alla depressione breve termine di connessioni locali (dati non mostrati). (C) Profondità estesa fuoco imaging la stessa connessione come in (A, B). Inset, il somato / dominio dendritica di una stella piramidale neurone livello 4. Si noti la presenza di un dendrite apicale prominente segnata da una freccia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucosio | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 2 | 0,294 |
| MgCl 2 | 1 | 0,095 |
| Osmolarità ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gassed con 95% O 2 e 5% CO 2 | ||
Tabella 1. artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per perfusione durante la registrazione.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucosio | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl 2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositolo | 3 | 0.54 |
| Na-piruvato | 2 | 0.22 |
| L'acido ascorbico (vitamina C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolarità ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gassed con 95% O 2 e 5% CO 2 | ||
Tabella 2. soluzione extracellulare per acuti fettine di cervello di animali immaturi.
| mM | g / L | |
| Saccarosio | 206 | 70.51 |
| KCl | 2.5 | 0,186 |
| Glucosio | 25 | 4.5 |
| NaHCO 3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl 2 | 1 | 0,147 |
| MgCl 2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositolo | 3 | 0.54 |
| Na-piruvato | 2 | 0.22 |
| L'acido ascorbico (vitamina C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolarità ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gassed con 95% O 2 e 5% CO 2 | ||
Tabella 3. soluzione extracellulare per acuti fettine di cervello di animali maturi (ssalina ucrose).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-gluconato | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfocreatina | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Regolare il pH a 7,3 con KOH | |||
| Osmolarità ~ 300 mOsmol / L | |||
| Aggiungere 3-5 mg / ml biocitina | |||
Tabella 4. Soluzione Low cloruro di pipetta.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-gluconato | 105 | 22.92 | 1.146 |
| NaCl | 30 | 1.76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfocreatina | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Regolare il pH a 7,3 con NaOH | |||
| Osmolarità ~ 300 mOsmol / L | |||
Tabella 5. Alta Nasoluzione pipetta per la ricerca di neuroni sinapticamente accoppiati.
| rapporto | ml | |
| reagente A | 1 | 0.15 |
| Reattivo B | 1 | 0.15 |
| 10% Triton X100 | 1 | 0.15 |
| 0,1 M tampone fosfato | 97 | 14.55 |
| Mantenuto per 30 minuti al buio prima dell'uso | ||
Tabella 6. soluzione ABC per la reazione istochimica.
| peso | volume | |
| 3-3'-diaminobenzidine | 10 mg | - |
| 0,1 M tampone fosfato | - | 20 ml |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | Di 5 - 10 microlitri |
| 1% CoCl 2 | - | 5 ml |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 e 1% CoCl 2 vengono aggiunti goccia a goccia agitando la soluzione. | ||
Tabella 7. Soluzione per diaminobenzidina (DAB) reazione.
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Discussion
Registrazioni accoppiati da eccitatorio sinapticamente accoppiati e / o neuroni inibitori sono un approccio molto versatile per lo studio dei microcircuiti neuronali. Non solo questo approccio permette di stimare la connettività sinaptica tra tipi di neuroni, ma permette anche la determinazione delle caratteristiche funzionali della connessione e la morfologia dei neuroni pre- e postsinaptici. Inoltre, agonisti e / o antagonisti possono essere facilmente applicati ai neuroni in fettine. Questo permette di studiare gli effetti dei neuromodulatori sulle proprietà della trasmissione sinaptica 32 o una caratterizzazione approfondita di una connessione sinaptica unitario definito utilizzando, ad esempio, l'analisi di quantale 16,17,38,39 rilascio sinaptico. Ritrovamento di connessioni sinaptiche chimiche e / o elettrica (svincolo gap) è la fase più critica di questo protocollo. Pertanto sono contenuti diversi approcci per reperire connessioni sinaptiche, a seconda del rapporto connettività e la suaTipo (chimica / elettrica).
Uno dei principali svantaggi di preparati fetta è spesso sostanziale troncamento di lungo raggio proiezioni assonale in modo che solo piccole parti della lunghezza assonale totale del assone sono recuperati. Per alcuni tipi di cellule piramidali, il grado di troncamento potrebbe fino al 90% o anche più quando prendendo proiezioni ad altre aree o regioni corticali sottocorticali conto. Questo rende la preparazione fetta inadatta per lo studio delle connessioni sinaptiche tra i neuroni corpi cellulari dei quali sono oltre> 300 micron a parte. Tuttavia, in fettine acute, proiezioni assonale locali, in particolare quelle del interneuroni locali sono generalmente recuperati con un grado relativamente basso di dendritica e troncamento assonale (~ 10% o meno) a causa del limitato lasso di campo orizzontale e verticale dei mandrini assonale . Connessioni coinvolgono questi tipi di neuroni possono quindi essere caratterizzate da un elevato grado di precisione e verso i pility e resa stime di connettività in gran parte corrette. Con l'eccezione di questi connessioni sinaptiche locali, valori assoluti per rapporti di connettività tra due tipi di neuroni ottenuti in fettine sono molto problematica, in particolare per i neuroni con grandi distanze tra somatiche come in translaminar o non locale, lungo raggio intralaminare connessioni sinaptiche . Questo problema è aggravato quando le condizioni affettatrici non sono stati ottimizzati per una determinata connessione sinaptica in età definita. Per più realistici di connettività stimato nuove metodologie come elettroni fitta ricostruzioni microscopici 40 e strutturale Axo-dendritiche sovrapposizione 41 sono stati sviluppati. Tuttavia, anche queste tecniche devono tener conto della grande diversità di interneuroni inibitori e anche neuroni eccitatori.
Un ulteriore problema con le stime di connettività è che i contatti sinaptici distali, ad esempio, quelle sul ciuffo apicale dei neuroni piramidali, puòsfuggire ad un controllo. Quando misurato al soma l'ampiezza della risposta sinaptica è molto piccola ed è probabile che scompaiono nel rumore (Qi et al. 2014, secondo). Tuttavia, questo tipo di problema non è limitato al metodo di registrazione accoppiato, ma si verifica anche con altre tecniche usate per studiare connettività sinaptica.
In recente attivazione luce indotta anno di microcircuiti neuronali (cioè, di foto-rilascio di glutammato in gabbia o di attivazione di channelrhodopsin) è stato utilizzato per studiare la connettività neuronale, anche su scala più ampia 42-52. Tuttavia, con questi approcci ottiche non è possibile identificare le proprietà strutturali del tipo neurone presinaptico. Inoltre, il numero e la posizione dei contatti sinaptici stabiliti da una connessione neuronale non possono essere identificati, almeno non a tutt'oggi. Registrazioni accoppiati, invece, consentono la caratterizzazione sia neur pre e postsinapticasui tipi in un microcircuito sinaptica. Ciò è particolarmente importante in quanto molti studi hanno dimostrato che entrambi interneuroni GABAergici e neuroni eccitatori sono molto diverse rispetto alla loro morfologia e fisiologia sinaptica 53-56. Così, l'identificazione di entrambi neuroni pre e post-sinaptici è un prerequisito per la descrizione di una connessione 57 sinaptica. Infine, le registrazioni abbinati consentono la registrazione di diverse configurazioni di connessione sinaptica (connessioni reciproche, coesistenti giunzioni e sinapsi chimiche). Pertanto, la tecnica di registrazione accoppiato rimarrà un importante approccio per studiare microcircuiti neuronali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
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