Abstract
Kombinasjonen av patch clamp opptak fra to (eller flere) postsynaptisk kombinert nevroner (sammenkoblede innspillinger) i akutte hjerne slice preparater med samtidig intracellulær biocytin fylling gir en korrelert analyse av deres strukturelle og funksjonelle egenskaper. Med denne metoden er det mulig å identifisere og karakterisere både pre- og postsynaptiske nevroner av deres morfologi og elektrofysiologisk reaksjonsmønster. Sammenkoblede innspillinger tillate studere tilkoblingsmønsteret mellom disse nevronene samt egenskapene til både kjemisk og elektrisk synaptisk overføring. Her gir vi en steg-for-steg beskrivelse av prosedyrene som kreves for å få pålitelige sammenkoblede innspillinger sammen med en optimal utvinning av nervecellen morfologi. Vi vil beskrive hvordan par av nevroner som er tilkoblet via kjemiske synapser eller gap veikryss er identifisert i hjernen slice forberedelser. Vi vil skissere hvordan nerveceller blir rekonstruert for å få deres 3D morfologi dendritic og aksonal domene og hvordan synaptiske kontakter er identifisert og lokalisert. Vi vil også diskutere de begrensningene og begrensninger av den sammenkoblede opptaksteknikk, spesielt de som er forbundet med dendrittiske og aksonale trunkeringer under utarbeidelsen av hjerneskiver fordi disse sterkt påvirke tilkoblings estimater. Men på grunn av allsidigheten til den sammenkoblede opptak tilnærming vil det fortsatt være et verdifullt verktøy for å karakterisere ulike sider ved synaptisk overføring på identifiserte nevrale kretser i hjernen.
Introduction
Nevrale kretser mellom to postsynaptisk kombinert nevroner er byggesteinene i store nettverk i hjernen og er de grunnleggende enheter av synaptisk informasjonsbehandling. En forutsetning for karakterisering av slike neuronal mikrokretser er kjent at morfologien og funksjonelle egenskaper av både pre- og postsynaptiske nevroner partner, typen av synaptisk forbindelse (r), og dens struktur og funksjonelle mekanisme. Men i mange studier av synaptiske forbindelser i det minste en av nevroner i en mikrokrets er ikke godt karakterisert. Dette skyldes den relativt uspesifikke stimuleringsregimer som ofte brukes i studier av synaptisk tilkobling. Derfor er de strukturelle og funksjonelle egenskaper av den presynaptiske neuron heller ikke identifisert i det hele tatt eller bare i ganske liten grad (dvs. ekspresjon av markørproteiner etc.). Sammenkoblede opptak i kombinasjon med intracellulær farging av markører such som biocytin, neurobiotin eller fluorescerende fargestoffer er bedre egnet for å studere små nevrale kretser. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke mange strukturelle og funksjonelle parametre for en morfologisk identifisert synaptisk forbindelse på samme tid.
Såkalte 'enhetlige' monosynaptisk forbindelser mellom to nerveceller har blitt undersøkt i begge kortikale og subkortikale hjerneregioner 1-10 bruker akutte slice forberedelser. Initialt ble laminert mikroelektroder som brukes i disse forsøkene; senere ble patch clamp monitorerings anvendes for å oppnå opptak av synaptiske signaler med et lavere støynivå og et forbedret tidsmessig oppløsning.
Et betydelig teknisk fremskritt var bruken av infrarød differensialinterferenskontrast (IR-DIC) optikk 11 til 14, en mikroskopisk metode som i betydelig grad forbedret synlighet og identifisering av nevronene i hjernen skive slik at det ble mulig to innhente opptak fra visuelt identifisert synaptiske forbindelser 15-17. Generelt er sammenkoblede innspillinger gjort i akutte slice forberedelser; bare svært få publikasjoner er tilgjengelige rapporterings opptak fra postsynaptisk koblet nevroner in vivo 18-20.
Den viktigste fordelen med sammenkoblede opptak er det faktum at en funksjonell karakterisering kan kombineres med en morfologisk analyse ved både lys og elektronmikroskopnivå (se f.eks., 7,16,21). Etter histokjemisk behandling, er dendrittiske og aksonal morfologi av postsynaptisk koblet neuron par spores. Deretter er det mulig å kvantifisere morfologiske egenskaper som lengde, romlig tetthet, orientering, forgrening mønster etc. Disse parametrene kan deretter gi grunnlag for en objektiv klassifisering av en spesifikk synaptisk tilkobling. Videre, i motsetning til de fleste andre teknikker som brukes for å studere neuronal connectiteten, sammen innspillinger også tillate identifisering av synaptiske kontakter for enhetlige synaptiske forbindelser. Dette kan gjøres direkte med en kombinasjon av lys og elektronmikroskopi 16,21-27 eller bruke kalsium bildebehandling 28,29 av dendrittutløperne. Men med den sistnevnte tilnærmingen bare eksitatoriske men ikke hemmende tilkoblinger kan studeres som det krever kalsium tilstrømningen via de postsynaptiske reseptor kanaler.
I tillegg til en detaljert analyse av synaptisk transmisjon i en definert neuronal mikrokretssammenkoblet opptak også tillater studiet av synaptisk plastisitet regler 30,31 eller - i kombinasjon med agonist / antagonist søknad - modulering av synaptisk transmisjon av neurotransmittere slik som acetylkolin 32 og adenosin 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer har blitt utført i samsvar med EU-direktivet for beskyttelse av dyr, den tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz) og Retningslinjene av Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Set-up for Elektro
Før du begynner med paret opptak, har en elektrofysiologi satt opp til å bli bygget. En kort oversikt hvordan et slikt oppsett er satt sammen er gitt nedenfor:
- Installere et anti-vibrasjon bordet der mikroskop, manipulatorer og alt annet utstyr skal plasseres.
MERK: Vibrasjon eller noen annen form for bevegelse må være så liten som mulig når du tar opp fra synaptiske forbindelser fordi dette krever en endring av pipetter (søk elektrode erstattet av opptak elektrode). - Plassere et Faradays bur omkring det anti-vibrasjonsbord for å redusere elektrisk støy. Koble alt utstyr inne i Faraday cage med elektrisk jord.
- Installere et mikroskop med en motorisert fokus akse som er basert på en motorisert xy bord på anti-vibrasjon bord i henhold til produsentens retningslinjer. Dette gjør det mulig å pålitelig flytte mikroskopet til nevroner som ikke er i samme synsfelt som det er tilfellet for translaminar forbindelser i neocortex.
- Installere et videokamera på kameraporten av mikroskopet og koble den til analog og / eller digitale skjermer for å observere skive forberedelse og bevegelsen av elektroder. Bruke et kamera, som kan veksles mellom en lav- og en høyeffekts forstørrelse for å få oversikt og et bilde close-up, henholdsvis av postsynaptisk kombinert nevronale celle pair. Dette bidrar også til å kontrollere bevegelsen av patch elektroder.
- Installere et eksemplar tabell inneholder en innsats for bad kammeret (boret in-house fra en pleksiglass blokk) for hjernen skive forberedelse. Dette eksemplaret tabellen må ikke være koblet tilmikroskop, dvs. må festes til luftbordet og mikroskopet er manøvrerbart under den.
- Mount to (eller mer om nødvendig) høypresisjons micromanipulators som kan flyttes i alle tre dimensjoner. Installere patch-clamp pre-forsterker på manipulatorer og koble dem til hovedforsterkeren.
MERK: Hvis krevde ytterligere manipulatorer kan installeres for eksempel mer enn to pre-forsterkere, ekstracellulære stimuleringselektroder, narkotika-levering systemer, etc. - Plassere badekaret kammer i prøvebord. Installere en løsning innløp og utløp og koble dem til perfusjon system.
- Bruk av en peristaltisk pumpe for å opprettholde perfusjon av opptakskammeret med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF; tabell 1) ved en stabil strømningshastighet på 4 - 6 ml / min for optimal skive levedyktighet.
MERK: Ikke overskrid denne strømningsrate betydelig som det vil føre til turbulens i ASCF og dermed bevegelse av stykket. Installere holdere for temperaturføler og Ag / AgCl bakken elektrode på prøve tabellen. Dette er nødvendig for å tillate sonden og elektroden for å smake på badet i kammeret. - For en god synlighet av nevroner i stykket forberedelse bruke infrarød belysning i mikroskopet. Dette reduserer lys diffraksjon og dermed uskarpe bilder. Pass på at mikroskopet er utstyrt med differensial optikk kontrast forstyrrelser for å oppnå en "3D'-lignende visualisering. Dette vil bidra til patching nevroner og tillate målretting nevroner dypt i stykket (60 mikrometer eller dypere).
- Under eksperimentet holde hjerneskiver i en eksperimentell kammer med et dekkglass på bunnen. Plasser en 'platina harpe' på toppen av skive for å hindre skiver fra flytende. En platina harpe er laget av U-formet, flatet platinatråd med strenger av tanntråd limt inn på den.
- Hold ACSF perfusert stykket ved en temperatur på 32 - 35 ° C for å sikre at optimal kontroll av oksygenering og pH. Dette kan gjøres ved oppvarming av oppløsningen med et Peltier-enhet installert i nærheten av ACSF innstrømning inn i badet kammeret.
MERK: Bruk ultratynne dekselet glipper slik at selv mikroskop kondensatorer med høy numerisk apertur og kort arbeidsavstand kan være fokusert på prøven. Dette er nødvendig for en optimal belysning av skiven.
For et bilde og en beskrivelse av en elektrofysiologi oppsett optimalisert for sammenkoblede opptak i hjernen skive forberedelse se figur 4 i Ref. 34.
2. Brain Slice Forberedelse
- Mildt bedøve dyret hvorfra hjernevev bør tas med isofluran (sluttkonsentrasjon <0,1%).
MERK: Andre anestetika kan også brukes. Bruk av bedøvelse bør være i samsvar med det respektive dyret utvalgets anbefalinger og regler. Pass alltid på at dyret er ikke irritert eller under stress etter å ha lagtnarkosen. - Halshogge dyret, åpne skallen og fjerne hjernen så raskt som mulig ved hjelp av prosedyren beskrevet i Refs. 34,35.
- Overfør hjernen til avkjølt (4 ° C) kunstig cerebrospinalvæske luftet med en blanding av karbogen gass med 95% O2 og 5% CO2.
- Isolere hjernen regionen som bør studeres.
MERK: Parameterne for å oppnå optimal bevaring og minimal avkutting av dendritter og aksoner av pre- og postsynaptiske nevroner bør bestemmes på forhånd for hver nevronale tilkobling og utviklingsstadiet under etterforskning. I et optimalt dissekert hjerneskive, er axon av det presynaptiske neuron behøver ikke være parallell til skiveoverflate. I stedet bør de peker inn i skiver med en grunne vinkel. Den gjelder for den apikale dendrite av postsynaptiske pyramidale nevroner; dette bør kontrolleres under lysmikroskop. Dette er spesielt viktig for ikke-lokal eller translaminar synaptiske forbindelser, f.eks., hvor pre- og postsynaptisk somata er mer enn 200 um fra hverandre og sannsynligheten for dendrittiske og aksonal trunkeringer er sannsynlig å være betydelig høyere enn for lokale forbindelser. - Overføre hjernen til mikrotomen kammeret. Basert på empiriske funn, er forskjellige ekstracellulære slicing løsninger brukes avhengig av alder på dyret (se tabell 2 og 3, nyttig informasjon kan også bli funnet under ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Trimme hjernen til målområdet er synlig.
- For å få skiver med en god celle synlighet, kutte 300-400 mikrometer tykke hjernen skiver hvis dyret er moden (> 3 uker). Hvis dyret er umoden (1 m 2. postnatal uke for mus og rotter) skiver kan skjæres opp til en tykkelse på ~ 600 til 800 um, uten vesentlig å svekke celle visibility.
MERK: Dette vil forbedre stabiliteten av 'umodne' skiver og redusere antall mulige trunkeringer av lang dendrittiske og aksonale collaterals. - Overfør skiver fra mikrotomen kammer til en inkubasjon kammer fylt med kutting løsning gjennomluftet med en blanding av 95% O2 og 5% CO2. Holde skivene i kammeret inkubering i minst 30 min til 1 time enten ved romtemperatur eller ved ~ 30 ° C, avhengig av typen av eksperimentet.
3. parvise Patch-Clamp Recording og Biocytin Fylling
Avhengig av typen av synaptisk forbindelse tre ulike tilnærminger benyttes for å finne et postsynaptisk koplede neuroner. Hvis tilkoblingen sannsynligheten er lav (som kan forventes for de fleste eksitatoriske tilkoblinger), fortsett som følger:
- Nevrale forbindelser med en lav tilkobling
- Fyll ut oppdaterings pipetter med en intern løsning av sammensetningen oppførtTabell 4 For alle opptak i det hel-celle konfigurasjonen legge biocytin ved konsentrasjoner mellom 3 -. 5 mg / ml til det indre (pipette) løsning for å oppnå gode fargeresultater for de pre- og postsynaptiske nevroner. La biocytin diffunderer inn i cellen i minst 15-30 minutter (avhengig av størrelsen på neuron).
MERK: Ikke legg biocytin til løsningen som brukes i 'søker' pipetter nevnt nedenfor. - Patch en antatt postsynaptiske nevron i den hel-celle-modus. Bruk patch pipetter med en lang og slank skaft. Dette forenkler manøvrering av pipetten under målet og reduserer bevegelse gjenstander som kan oppstå når elektroden er innført i stykket.
- Deretter lappe en potensiell presynaptisk nervecellen i en celle-festet konfigurasjon ved hjelp av en "søker" patch pipette på 8 - 10 Megohm motstand og et lite tips diameter. Med disse pipetter etablere en "løs" celle-festet patch. Fill den "søke" pipette med en innvendig oppløsning hvori K + er erstattet av Na + (tabell 5) for ikke å depolarisere neuroner under søking etter en presynaptisk celle.
MERK: "løs" segl motstand er ikke i GΩ rekkevidde, men vanligvis rundt 30-300 Megohm. - Hold membranpotensialet under "løs" tetning til ca. -30 til -60 mV i strømklemmen modus. Deretter gjelder store strømpulser (0,2 til 2 NA) for å lokke fram et aksjonspotensial i potensialet presynaptiske cellen. Observere denne handlingen potensial som en liten spikelet på spenningen respons.
- Still stimulering frekvens til 0,1 Hz for å hindre nedslitt av en postsynaptiske respons. Bruke lavere stimulerings frekvenser i tilfelle hjernevevet er veldig umoden eller den synaptiske tilkobling ikke veldig pålitelig.
- I tilfelle den "postsynaptiske 'nevron ikke reagerer på stimulering av testet' presynaptiske 'neuron, lappe en ny nevron i "løs" segl modus. Ikke bytt ut 'søke' patch elektrode så lenge forseglingen med en motstand på> 30 Megohm er etablert. Teste opptil 30 potensielt presynaptiske nevroner i denne måten.
MERK: For å unngå skade på nervecellen under søkingen prosedyre med løs patch clamp, bare forsiktig suging bør brukes på søkingen pipette forhold som gjaldt for den hel-celle patch pipette. - Hvis stimulering i "løse" segl modus, blir en EPSP / IPSP med en ventetid <5 msek i den postsynaptiske nevron fjerne 'søke' pipette fra den presynaptiske nervecellen.
- Erstatte 'søke' patch pipette med en lapp elektrode fylt med biocytin holdig, regelmessig intern løsning. Sikre denne innspillingen patch pipette har en motstand på 4-8 Megohm; jo større soma størrelsen nedre elektrodemotstanden kan.
- Lappe den presynaptiskenevron og rekord i hel-celle, strøm-klemme-modus. Lokke fram aksjonspotensialer ved dagens injeksjon i de presynaptiske nevroner og registrere den postsynaptiske respons. Lagre dataene på en datamaskin for senere off-line analyse.
- Fyll ut oppdaterings pipetter med en intern løsning av sammensetningen oppførtTabell 4 For alle opptak i det hel-celle konfigurasjonen legge biocytin ved konsentrasjoner mellom 3 -. 5 mg / ml til det indre (pipette) løsning for å oppnå gode fargeresultater for de pre- og postsynaptiske nevroner. La biocytin diffunderer inn i cellen i minst 15-30 minutter (avhengig av størrelsen på neuron).
- Nevrale forbindelser med en høy tilkobling
MERK: For nevrale kretser med høy tilkoblingsforhold (> 30%) bruker en annen fremgangsmåte for å finne synaptiske forbindelser. Denne prosedyren er beskrevet nedenfor og er ofte brukt for hemmende synaptisk tilkobling som har i gjennomsnitt en høyere tilkoblingsforhold enn eksitatoriske tilkoblinger 36. Det bør ikke brukes når tilkobling forholdet faller under denne verdien.- Lappe en presynaptisk nervecellen direkte i hel-celle-modus. Deretter lappe en potensiell postsynaptiske nevron, også i hele celle-modus. Begge cellene skal være under strømtang kontroll. Lokke fram et aksjonspotensial i den presynaptiske cellen. Overvåke potensielle postsynaptiske nervecellen for en postsynaptic potensial.
- I tilfelle nervecellen ikke viser en respons på presynaptisk stimulering, lappe en ny nevron i hel-celle-modus ved hjelp av en patch elektrode fylt med vanlig intern løsning. Hvis en tilkobling er funnet, ikke endre lappen pipette men fortsette med innspillingen. Deretter fortsetter som i trinn 3.1.9.
- Nevrale forbindelser via gap-kryss
MERK: Hvis du vil søke etter elektriske (gap-krysset) tilkoblinger bruke følgende fremgangsmåte som er en modifisert versjon av det som brukes for lav sannsynlighet tilkoblinger.- Patch et postsynaptiske nevron i den hel-celle patch clamp konfigurasjon.
- Deretter lappe en antatt presynaptisk nervecellen i løs-segl konfigurasjon (lav segl motstand på 30-300 Megohm) ved hjelp av en "søker" patch pipette av 7-10 Megohm motstand. Dette pipette skal fylles med den modifiserte høy Na + intern løsning for løs-segl stimulering.
- Inject 100-300 msek lange hyperpolariserer strømpulser via "løs" segl; pipetten kommando potensialet bør settes til ca -60 til -70 mV. Observere et gap junction-tilkobling hvis dette stimulering resulterer i en liten Hyperpolarizing respons i "postsynaptiske 'nervecellen.
- Repatch den "presynaptisk 'nevron i den hel-celle-modus og gå frem som beskrevet ovenfor.
MERK: For å sikre en god farging av aksonale og dendrittiske prosesser, bruke protokollen gitt nedenfor. Denne protokollen er beskrevet i korthet her, er imidlertid en detaljert protokoll for histokjemisk prosessering anvendt i vårt laboratorium angitt i Ref. 37.
4. histokjemiske Processing
- Overfør hjernen skive med paret av postsynaptisk koplede neuroner i et hetteglass inneholdende 4% paraformaldehyd oppløst i 0,1 M fosfatbuffer, og fikserer den skive i 24 timer. For elektronmikroskopi, fiksere skive med 2,5% glutaraldehyd og 1% paraformaldehyde.
- På neste dag, overføre skivene i normal fosfatbuffer inneholdende ikke noe bindemiddel. Vask skiver med fosfatbuffer i 6 - 8 ganger for 10 - 15 minutter hver for å fjerne overflødig fikseringsmiddel.
- Inkuber stykker i 20 min i en 3% H 2 O 2-løsning i 0,1 M fosfatbuffer for å redusere endogen peroksidase-reaksjonen. Observere sterk bobledannelse. Fortsette reaksjonen inntil ingen ytterligere bobler produseres. Deretter skyll skivene i 0,1 M fosfatbuffer for 6 - 8 ganger (10 min hver) for å fjerne eventuelle gjenværende H 2 O 2.
- Immunocytokjemiske og kromogeniske reaksjoner
Visualisering av biocytin fylte neuroner er basert på en streptavidin-biotinylert pepperrotperoksydase reaksjon katalysert med diaminobenzidin; dette gir en mørk bunnfall som frembringer en skarp flekk med høy romlig oppløsning. Følgende prosedyrer brukes for kromogen reaksjon: <ol> - Klargjør ABC løsning som per produksjon protokoll. Legg til 14,55 ml fosfatbuffer supplert med 150 ul 10% Triton X100 (tabell 6; bare for lysmikroskopi) og holde løsningen i ca. 30 minutter i mørket. Inkuber skiver i denne løsningen O / N før bruk.
- Inkuber skiver i ABC-løsning på et rysteapparat i 1 time ved romtemperatur og i mørke. Deretter holde skiver O / N ved 4 ° C i et kjøleskap. På den neste morgen, inkuber skiver ved RT i ytterligere en time.
- Etter dette, skylles skiver minst fire ganger i 10 minutter hver i fosfatbuffer. Deretter inkuberes på en ristemaskin i ca. 30 minutter i mørke i 2 ml av en nikkel-forsterket 3-3'-diaminobenzidin-løsning (tabell 7). Vær veldig forsiktig når du håndterer diaminobenzidin og bruke bare under avtrekkshette; det er ekstremt kreftfremkallende, selv ved meget lave konsentrasjoner.
- Legg 6.5 ul 3% H 2 O 2 til diaminobenzidin holdigeoppløsning. Overvåke kromogen reaksjon under et lysmikroskop til brune-svart beiset nevroner er klart synlig. Deretter stoppe reaksjonen umiddelbart ved vasking skiver flere ganger i fosfatbuffer.
- Mount skiver med farget nevroner på lim, silan-belagt Histobond eller gelatin standard objekt lysbilder.
- Holde skinnene i et fuktig kammer med minst 80% fuktighet O / N. På neste dag, la skivene lufttørke i ytterligere 10 min. Før innebygging, overføring lysbilder i løsninger med økende konsentrasjoner av etanol (20 - 100%) for å tørke dem.
MERK: dehydrering prosessen bør være langsom ellers skjevheter i de dendrittiske og aksonale prosesser er sannsynlig 37. Ved en alternativ forankring prosedyren er valgt, f.eks, en med glycerol-basert Moviol, en dehydrering er ikke nødvendig; men dette er sannsynligvis resultere i en inhomogen komprimering av stykket, og dermed et forvrengt nevronale morphology. - Til slutt, inkuberes i 10 min i xylol, legge skivene i en hydrofob embedding medium for lysmikroskopi og plassere en ultra-tynne dekkglass på toppen. La glir tørke i 20 minutter ved RT.
5. Neuronal Rekonstruksjon og Synaptic Kontakt Lokalisering
- Undersøke lysbilder med biocytin-merket nevroner under et lysmikroskop utstyrt med en 60X / 100X oljeneddyppingsobjektivet og en kondensator med en høy numerisk apertur for optimal romlig oppløsning. Sørg for at aksonal boutons og dendrittutløperne er klart synlig.
- Spore nevroner eller postsynaptisk kombinert nevroner parene ved hjelp av en kommersiell nevron tracing system (se tabell av konkrete materialer / utstyr) for å oppnå 3D-nevronale rekonstruksjoner. Gjennomføre sporing manuelt under konstant visuell inspeksjon for å oppdage selv små aksonal eller dendrittiske collaterals. For sammenkoblede opptak fra postsynaptisk kombinert nevroner manuell sporing er fortsatt den metoden forvalg fordi navngivelse av f.eks en aksonal profilen til enten før eller postsynaptiske nevron krever betydelig gjenoppbygging erfaring.
- Hvis det er nødvendig, gjør tellinger av aksonale boutons og / eller dendrittutløperne. Fordi pigger eller ryggrad subtyper og aksonale boutons kan utvise en bestemt fordeling og tetthet i forhold til f.eks kortikalsjiktet eller område, kan dette bidra til å karakterisere nervecelletyper.
- For postsynaptisk kombinert nevroner parene, sjekk den presynaptiske axon og postsynaptiske dendritter for nære appositions på høyeste forstørrelse tilgjengelig. Observere en aksonal bouton og en postsynaptiske dendrittiske ryggrad eller aksel er i samme fokusplanet kan betraktes som en antatt synaptisk kontakt. Markere denne kontakten i gjenoppbyggingen.
- Korriger nevronale rekonstruksjoner for svinn i alle tre romlige dimensjoner i den aktuelle delen av sporing program.
MERK: Under fiksering, histokjemisk behandlingog dehydrering betydelig mekanisk deformasjon, og krympingen forekommer; dette vil påvirke aksonale og dendrittiske lengdemålinger og sterkt forvrenge deres romlige ordning. Svinnkorreksjonsfaktorer for innstøpningsmediet er ~ 1.1 for x og y-retningen og ~ 2.1 for z-retning 37. - For en kvantitativ morfologisk analyse bruke en dataanalyseprogram for nevrofysiologi (se tabell av konkrete materialer / utstyr).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenkoblede innspillinger er metoden for valg for en grundig karakterisering av morfologisk identifiserte uni- eller toveis synaptiske forbindelser samt gap junction (elektrisk) tilkoblinger (figur 1). Et eksempel på en sammenkoblet opptak i laget 4 av somatosensory fat cortex er vist i Figur 1A. Både enveis eksitatorisk og hemmende synaptiske forbindelser kan karakteriseres (figur 1B, C). Videre sammenkoblede innspillinger tillate å ta opp fra toveis synaptiske forbindelser, dvs. fra tilkoblinger der både nevroner i et par er pre- og postsynaptiske til hverandre. Dette illustreres i figur 1D, som viser opptak fra en hemmende interneuron og en eksitatorisk neuron. Utløsning av en aksjonspotensial i eksitatoriske neuron (røde spor) resulterer i et EPSP i postsynaptiske hemmende interneuron (sorte sporer). Men når et aksjonspotensial er evoked i interneuron, kan en IPSP registreres i eksitatoriske nevroner. Figur 1E viser at det er også mulig å ta opp fra nevroner koblet via gap junction eller via et gap junction og en kjemisk synapse. Gjensidige og gap junction tilkoblinger kan bare identifiseres av parede elektrofysiologiske opptak så langt, men ikke av noen annen teknikk.
Kombinasjonen av biocytin fylling av koplede neuroner via plasteret pipette og de elektrofysiologiske opptak tillater en korrelasjon av morfologiske egenskaper til de neuroner overfor synaptiske egenskaper. Etter histokjemiske behandlingen nevroner er synlige som mørke strukturer i fiksert skive (Figur 2A). Deretter ble det tatt opp neuronal celleparet kan bli rekonstruert morfologisk og neuronale celletyper kan bli identifisert. Dessuten er det mulig å identifisere antallet og plasseringen av antatte synaptiske kontakter (Figur 2A høyre panel og Figure 2B innfelt). Nervecellen pair vist i figur 2B er gjensidig forbundet og dermed synaptiske kontakter er etablert på begge nevroner. I våre hender, ble antatte, lette mikroskopisk identifisert synaptiske kontakter bekreftet som ekte synaptiske kontakter med elektronmikroskop med en 80-90% grad av nøyaktighet 16,21,26.
Figur 3 viser et eksempel på en sammenkoblet opptak fra en presynaptisk pyramide neuron i neokortikale lag 6 av sylinderen cortex og en eksitatorisk spiny neuron i sjiktet 4. Denne translaminar neuronal mikrokrets har en lav sannsynlighet forbindelse, men kan bli identifisert ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i søking trinn 3.1.1 - 3.1.9 for nevrale forbindelser med en lav tilkobling. Med den sammenkoblede opptaksteknikk er det mulig å identifisere synaptiske forbindelser med en svært lav tilkobling som er tilfellet for noen langtrekkende translaminar tilkoblinger (dette eksempelet) eller forbindelser mellom neurons lokalisert i ulike kortikale 'søyler' (inter-søyle synaptiske forbindelser).
Figur 1. Sammenkoblede opptak fra postsynaptisk kombinert celle parene. (A) Venstre, IR-DIC bilde av en hjerne skive. Høyre, en interneuron (øverst) og en eksitatoriske nevroner (nederst). (B) En presynaptiske aksjonspotensial (øverst) i en eksitatoriske nevroner utløser en monosynaptisk eksitatorisk postsynaptisk potensial (EPSP) i en annen eksitatoriske nevron (nederst). (C) En aksjonspotensial (øverst) i en presynaptisk hemmende interneuron fremkaller en monosynaptisk hemmende postsynaptiske potensial (IPSP) i en eksitatoriske nevroner (nederst). (D) Et aksjonspotensial (øverst til venstre) i en presynaptisk eksitatoriske nevroner fremkaller en EPSP (nederst til venstre) i en hemmende interneuron. I sin tur, et aksjonspotensiali den hemmende interneuron (øverst til høyre) utløser en IPSP i eksitatoriske nevroner (nederst til høyre). (E) En serie av hyper- og depolariserende spenningstrinn fremkalt av dagens injeksjoner i et nevron (øverst til venstre) er reflektert i en gap-krysset kombinert andre nevron (nederst til venstre). I tillegg er en presynaptisk aksjonspotensial (øverst til høyre) i det første neuron fremkaller en tidlig liten depolarisering (spikelet, innfelt), etterfulgt av en sen dypt hyperpolarisering (IPSP) i membranpotensialet av den andre neuron (nederst til høyre). Skala barer i (B) gjelder også for (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Identifisering av synaptiske kontakter og morfologisk Reconstruction av biocytin fylt celle parene. (A) Venstre, lavt strømforbruk mikrofotografi av et gjensidig koblet celle par bestående av en spiny stel og en rask-spiking interneuron i lag fire som ble fylt med biocytin under opptak. Lys mikroskopisk identifisert mulige eksitatoriske synaptiske kontakter mellom den presynaptiske spiny nervecellen og den postsynaptiske interneuron er merket med grønne prikker. Antatte gjensidige hemmende synaptiske kontakter er angitt med blå prikker. Høyre, høy effekt bilder av synaptiske kontakter. Grønne åpne sirkler, eksitatoriske kontakter; blå åpne sirkler, hemmende kontakter. Sjikt grenser ble bestemt ved cytoarchitectonic strukturen i hjernen farget stykke under det lave strøm mikroskop. (B) Neurolucida rekonstruksjon av den samme celleparet vist i (A) og figur 1C. Blå, interneuron axon; rød, interneuron soma og Dendritt; grønn, spiny nevron axon; hvit, spiny neuron soma og dendrite. Den innfelteviser somatodendritic avdelinger av de pre- og postsynaptiske nevroner sammen med de antatte synaptiske kontakter. Fat konturer ble identifisert i de lave kraft lyse-felt photomicrographs laget av den akutte hjerne skive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Et representativt synaptisk forbindelse med svært lav tilkoblingsforhold. (A) En presynaptiske aksjonspotensial (øverst) i et lag 6 pyramidal celle fremkaller en monosynaptisk eksitatorisk postsynaptisk potensial (nederst) i et lag 4-pyramidal neuron. Legg merke til den lange ventetiden (> 3,0 ms) i denne trans-laminær forbindelse sammenlignet med lokale intra laminær tilkoblinger (≈1.0 msek). (B) postsynaptiske response av lag 4-stjerners pyramide nevron til to aksjonspotensialer ved 10 Hz utløst i et lag seks pyramidale celler. Legg merke til den kortsiktige tilrettelegging av denne forbindelsen i forhold til den kortsiktige depresjon av lokale tilkoblinger (data ikke vist). (C) Utvidet dybdeskarphet avbildning av den samme forbindelsen som i (A, B). Innfelt, den somato / dendrittiske domenet til et lag 4-stjerners pyramide nevron. Legg merke til tilstedeværelsen av en prominent apikal dendrite merket med en pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 2 | 0,294 |
| MgCl2 | 1 | 0,095 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabell 1. Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) for perfusjon under opptak.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Askorbinsyre (vitamin C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabell 2. Ekstracellulær løsning for akutte hjerneskiver av umodne dyr.
| mM | g / L | |
| Sukrose | 206 | 70,51 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukose | 25 | 4.5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1.25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0.54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Askorbinsyre (vitamin C) | 0.4 | 0.07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasset med 95% O2 og 5% CO2 | ||
Tabell 3. Ekstracellulær løsning for akutte hjerneskiver av modne dyr (sucrose saltvann).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-gluconate | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Fosfokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Juster pH til 7,3 med KOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
| Legg 3-5 mg / ml biocytin | |||
Tabell 4. Lav klorid pipette løsning.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-gluconate | 105 | 22.92 | 1,146 |
| NaCl | 30 | 1.76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2,384 | 0,1192 |
| Fosfokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0.3 | 0,156 | 0,0078 |
| Juster pH til 7,3 med NaOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
Tabell 5. Høy Napipette løsning for søking postsynaptisk kombinert nevroner.
| ratio | ml | |
| reagens A | 1 | 0.15 |
| reagens B | 1 | 0.15 |
| 10% Triton X100 | 1 | 0.15 |
| 0,1 M fosfatbuffer | 97 | 14.55 |
| Holdt i 30 min i mørket før bruken | ||
Tabell 6. ABC løsning for histokjemisk reaksjon.
| vekt | volum | |
| 3-3'-diaminobenzidin | 10 mg | - |
| 0,1 M fosfatbuffer | - | 20 ml |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5 - 10 ul |
| 1% CoCl 2 | - | 5 mL |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 og 1% CoCl 2 blir tilsatt dråpevis under omrøring av oppløsningen. | ||
Tabell 7. Løsning for diaminobenzidin (DAB) reaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenkoblede opptak fra postsynaptisk kombinert eksitatoriske og / eller hemmende nerveceller er en svært allsidig tilnærming til studiet av nevrale kretser. Ikke bare gjør denne tilnærmingen tillater en å anslå synaptic tilkobling mellom nevroner typer, men også tillater å bestemme de funksjonelle egenskapene til tilkoblingen og morfologi av pre- og postsynaptiske nevroner. Videre kan agonist og / eller antagonist lett påføres neuroner i skivepreparater. Dette gjør det mulig å studere effekter av nevromodulatorer på egenskapene til synaptisk overføring 32 eller en grundig karakterisering av en definert enhetlig synaptisk tilkobling ved hjelp av for eksempel quantal analyse av synaptisk frigjøring 16,17,38,39. Funn av kjemiske og / eller elektrisk (gap junction) synaptiske forbindelser er den mest kritiske trinn i denne protokollen. Vi har derfor listet opp ulike tilnærminger for å finne synaptiske forbindelser, avhengig av tilkoblingsforhold og denstype (kjemisk / elektrisk).
En stor ulempe ved stykke preparater er ofte betydelig avkorting av lang aksonale projeksjoner, slik at bare små deler av den totale lengden av aksonal axon gjenvinnes. For noen pyramidale celletyper, graden av trunkering kunne opp til 90% eller enda mer når man tar fremspring til andre kortikale områder eller subkortikal regioner i betraktning. Dette gjør stykket preparat egnet for studier av synaptiske forbindelser mellom nevroner cellelegemer som er mer enn> 300 um fra hverandre. Men i akutte stykke preparater, lokale aksonale projeksjoner, i særdeleshet de av lokale interneuroner er generelt gjenopprettes med en relativt lav grad av dendrittiske og aksonal trunkering (~ 10% eller mindre) på grunn av den begrensede horisontale og vertikalt felt spenn av deres aksonale dor . Tilkoblinger som involverer disse typer nevroner kan derfor karakteriseres med en høy grad av nøyaktighet og reliability og gir stort sett riktige tilkoblings estimater. Med unntak av disse lokale synaptiske forbindelser, absolutte verdier for tilkoblings forholdstall mellom to nervecellen typer oppnådd i slice forberedelser er svært problematisk, spesielt for nevroner med store inter-somatiske avstander som i translaminar eller ikke-lokale, langtrekkende intralaminar synaptiske forbindelser . Dette problemet forsterkes når slicing forholdene ikke har blitt optimalisert for en gitt synaptisk tilkobling på et definert alder. For mer realistiske tilkoblings anslått nye metoder som tett elektron mikroskopiske rekonstruksjoner 40 og strukturelle axo-dendrittiske overlapping 41 har blitt utviklet. Men selv om disse teknikker må ta i betraktning den høye mangfoldet av inhibitoriske interneuroner og også eksitatoriske neuroner.
Et ekstra problem med tilkoblings anslag er at distale synaptiske kontakter, for eksempel, de på apikale dusk av pyramidale nevroner, kanunngå å bli oppdaget. Når målt på soma amplitude deres synaptiske responsen er svært liten, og vil trolig forsvinne i støyen (Qi et al., 2014, i underkastelse). Imidlertid er denne typen problem ikke begrenset til den sammenkoblede opptak tilnærming, men vil også forekomme med andre teknikker som brukes for å studere synaptiske tilkobling.
I de senere år lys-indusert aktivering av neuronal mikrokretser (dvs. etter bilde-frigjøring av glutamat bur eller etter aktivering av channelrhodopsin) har blitt brukt til å undersøke neuronal tilkobling, selv i større målestokk 42-52. Men med disse optiske metoder er det ikke mulig å identifisere de strukturelle egenskapene til det presynaptiske neuron type. Videre kan antall og plassering av synaptiske kontakter etablert av en neuronal forbindelse ikke kan identifiseres, i det minste ikke til dato. Sammenkoblede opptak, på den annen side, tillater karakterisering av både pre- og postsynaptisk Neurpå typer i en synaptisk mikrokrets. Dette er spesielt viktig siden mange studier har vist at både GABAergiske interneuroner og eksitatoriske neuroner er meget variert med hensyn til sin morfologi og synaptisk fysiologi 53-56. Følgelig er identifiseringen av både pre- og postsynaptiske nevroner en forutsetning for en beskrivelse av en synaptisk forbindelse 57. Endelig sammenkoblede innspillinger tillate opptak av forskjellige konfigurasjoner av synaptiske tilkobling (gjensidige forbindelser, coexisting gap veikryss og kjemiske synapser). Derfor vil paret opptaksteknikk forbli en viktig tilnærming for å studere nevrale kretser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
