Abstract
A combinação de gravações de patch clamp de dois (ou mais) neurónios sinapticamente acoplados (gravações emparelhados), em preparações de fatias cerebrais agudos com simultânea enchimento biocitina intracelular permite uma análise correlacionada das suas propriedades estruturais e funcionais. Com este método, é possível identificar e caracterizar os neurônios pré e pós-sinápticos pela sua morfologia e padrão de resposta eletrofisiológica. Gravações emparelhadas permitem estudar os padrões de conectividade entre estes neurónios, bem como as propriedades de ambos transmissão sináptica química e eléctrica. Aqui, vamos dar uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para obter gravações emparelhados confiáveis, juntamente com uma ótima recuperação da morfologia neurônio. Vamos descrever como pares de neurônios conectados via sinapses químicas ou junções comunicantes são identificados em preparações fatia cérebro. Vamos delinear como os neurônios são reconstruídos para obter sua morfologia 3D da Dendritic e domínio axonal e como contatos sinápticos são identificadas e localizadas. Também vamos discutir as ressalvas e limitações da técnica de gravação emparelhado, em especial os associados truncations dendríticas e axonais durante a preparação de fatias do cérebro, porque estes afetam fortemente as estimativas de conectividade. No entanto, devido à versatilidade da abordagem gravação emparelhado irá permanecer um instrumento valioso na caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.
Introduction
Microcircuitos neuronais entre dois neurônios synaptically acoplados são os blocos de construção de redes de grande escala no cérebro e são as unidades fundamentais do processamento de informações sináptica. Um pré-requisito para a caracterização de tais microcircuitos neuronais é conhecer a morfologia e as propriedades funcionais de ambos os neurónios parceiros pré e pós-sinápticos, o tipo de conexão sináptica (s) e a sua estrutura e mecanismo funcional. No entanto, em muitos estudos de ligações sinápticas, pelo menos, um dos neurónios em um microcircuito não está bem caracterizada. Isto resulta a partir dos protocolos de estimulação relativamente não específicos, muitas vezes utilizados em estudos de conectividade sináptica. Portanto, as propriedades estruturais e funcionais do neurónio pré-sináptico quer não são identificadas em todos ou apenas a um pequeno grau (ou seja, a expressão de proteínas marcadoras etc.). Gravações emparelhados em combinação com coloração intracelular por marcadores such como biocitina, neurobiotin ou corantes fluorescentes são mais adequados para o estudo de pequenas microcircuitos neuronais. Esta técnica permite investigar muitos parâmetros estruturais e funcionais de uma conexão sináptica identificadas morfologicamente, ao mesmo tempo.
Os chamados conexões monosinápticos «unitária» entre dois neurônios têm sido investigados em ambas as regiões cerebrais corticais e subcorticais 10/01 usando preparações fatia agudas. Inicialmente, microeléctrodos afiados foram usadas nestas experiências; mais tarde, a gravação de patch clamp foi utilizada a fim de obter gravações de sinais sinápticos com um nível de ruído mais baixo e uma resolução temporal melhorada.
Um avanço técnico significativo foi o uso de diferencial de infravermelho interferência contraste (IR-DIC) óptica 11-14, uma técnica microscópica que melhorou significativamente a visibilidade e identificação de neurônios na fatia do cérebro, de modo que se tornou possível to de obter gravações de visualmente identificados conexões sinápticas 15-17. Em geral, as gravações emparelhados são feitas em preparações de fatias agudas; só muito poucas publicações são gravações de relatórios disponíveis de neurônios conectados synaptically in vivo 18-20.
A vantagem mais importante das gravações emparelhados é o facto de que uma caracterização funcional pode ser combinada com uma análise morfológica, tanto a luz e electrões nível microscópico (ver por ex., 7,16,21). Após o processamento histoquímica, a morfologia dendrítica e axonal do par neurônio synaptically conectado é rastreado. Subsequentemente, é possível quantificar características morfológicas, tais como comprimento, densidade espacial, orientação, padrão de ramificação, etc. Estes parâmetros podem então proporcionar uma base para a classificação objectiva de uma conexão sináptica específico. Além disso, em contraste com a maioria das outras técnicas utilizadas para estudar connecti neuronaisvidade, emparelhado gravações também permitir a identificação dos contatos sinápticos para conexões sinápticas unitários. Isso pode ser feito diretamente, usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica 16,21-27 ou usando imagens de cálcio 28,29 das espinhas dendríticas. No entanto, com esta última abordagem só excitatório, mas não conexões inibidoras pode ser estudada como requer o influxo de cálcio através dos canais dos receptores pós-sinápticos.
Além de uma análise detalhada da transmissão sináptica em um microcircuito emparelhado gravações neuronais definidas também permitem o estudo das regras de plasticidade sináptica 30,31 ou - em combinação com a aplicação de agonista / antagonista - a modulação da transmissão sináptica por neurotransmissores tais como acetilcolina e 32 adenosina 33.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a Directiva da União Europeia para a Protecção dos Animais, o Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz) e as Diretrizes da Federação de Associação de Ciência Animal Laboratório Europeu.
1. Set-up de Eletrofisiologia
Antes de começar com a gravação emparelhado, um eletrofisiologia set-up tem que ser construído. Um breve esboço como tal set-up é montado é dado abaixo:
- Instalar uma tabela anti-vibração em que o microscópio, os manipuladores e todos os outros equipamentos serão colocados.
NOTA: vibração ou qualquer outra espécie de movimento deve ser tão pequeno quanto possível quando a gravação a partir de conexões sinápticas porque esta requer uma mudança de pipetas (procurando eléctrodo substituído por eléctrodo de gravação). - Coloque uma gaiola de Faraday volta da mesa de anti-vibração para reduzir o ruído elétrico. Conecte todos os equipamentos dentro do ca Faradayge com o aterramento elétrico.
- Instale um microscópio com um eixo foco motorizado que se baseia em uma mesa xy motorizada na mesa de anti-vibração de acordo com as orientações do fabricante. Isto permite de forma fiável para mover o microscópio para neurónios que não estão no mesmo campo de visão, como é o caso para as ligações translaminar no neocórtex.
- Instalar uma câmera de vídeo na porta da câmera do microscópio e conectá-lo ao analógico e / ou telas digitais para observar a preparação fatia e o movimento de eletrodos. Use uma câmera, que pode ser alternado entre uma imagem de um close-up de baixa e uma ampliação de alta potência para obter uma visão geral e, respectivamente, do par de células neuronais synaptically acoplado. Isto também ajuda a controlar o movimento dos eléctrodos de conexão.
- Instalar uma mesa de amostra que contenha uma aposta para a câmara de banho (perfurados em casa a partir de um bloco de perspex) para a preparação fatia do cérebro. Esta tabela amostra não deve ser ligada àmicroscópio, ou seja, deve ser fixado à mesa de ar e do microscópio deve ser manobrável sob ele.
- Monte dois (ou mais se necessário) micromanipuladores de alta precisão, que podem ser movidos em todas as três dimensões. Instale patch-clamp pré-amplificador sobre os manipuladores e conectá-los ao amplificador principal.
NOTA: Se manipuladores adicionais necessários podem ser instalados para, por exemplo, mais de dois pré-amplificadores, eletrodos de estimulação extracelulares, sistemas de distribuição de medicamentos, etc. - Coloque a câmara de banho na tabela do espécime. Instale uma solução de entrada e saída e conectá-los ao sistema de perfusão.
- Usar uma bomba peristáltica para manter a perfusão da câmara de registo com fluido cerebrospinal artificial (ACSF; Tabela 1) a um caudal estável de 4 - 6 ml / min para a viabilidade da fatia óptima.
NOTA: Não exceda este caudal de forma significativa, uma vez que irá resultar em turbulência no ASCF e, portanto, o movimento da fatia. Instale titulares para a sonda de temperatura e eletrodo terra Ag / AgCl para a mesa de amostra. Isto é necessário para permitir que a sonda e eletrodo para provar o banho na câmara. - Para uma boa visibilidade dos neurônios na preparação fatia usar iluminação infravermelha no microscópio. Isso reduz a difração da luz e, portanto, a desfocagem da imagem. Certifique-se de que o microscópio é equipado com óptica de contraste de interferência diferencial para atingir um "visualização 3D' semelhante. Isso ajudará a remendar neurônios e permitem que atinge os neurônios profundas na fatia (60 m ou mais profundo).
- Durante a experiência, manter em fatias de cérebro de uma câmara experimental com uma lamela de vidro na parte inferior. Coloque um 'harpa platina' no topo da fatia para evitar fatias de flutuar. Uma harpa platina é feita a partir de em forma de U, fio de platina achatada com cordas de fio dental colada.
- Manter o ACSF perfundir a fatia a uma temperatura de 32 - 35 ° C para assegurar a optcontrole imal de oxigenação e pH. Isto pode ser realizado por aquecimento da solução com um dispositivo Peltier instalado perto da entrada para a câmara de ACSF banho.
NOTA: Use cobertura ultrafina desliza para que mesmo condensadores microscópio com uma alta abertura numérica e distância de trabalho curta pode ser focado no espécime. Isto é necessário para uma iluminação óptima da fatia.
Para uma imagem e uma descrição de um eletrofisiologia set-up otimizado para gravações emparelhados na preparação fatia do cérebro ver Figura 4 na Ref. 34.
2. Cérebro Slice Preparação
- Ligeiramente anestesiar o animal a partir do qual o tecido cerebral deve ser tomado com isoflurano (concentração final <0,1%).
NOTA: Outros anestésicos também pode ser usado. O uso do anestésico deve cumprir as recomendações e regras do respectivo comitê animal. Assegure-se sempre que o animal não está irritado ou sob estresse depois de adicionaro anestésico. - Decapitar o animal, abrir o crânio e remover o cérebro tão rapidamente quanto possível, utilizando o procedimento descrito no Refs 34,35..
- Transferir o cérebro em solução arrefecida (4 ° C) fluido cerebrospinal artificial arejada com uma mistura de gás carbogénio com 95% de O2 e 5% de CO 2.
- Isolar a região do cérebro que devem ser estudados.
NOTA: Os parâmetros para obter preservação óptima e truncagem mínima de dendritos e axônios dos neurônios pré e pós-sinápticos deve ser determinado com antecedência para cada ligação neuronal e estágio de desenvolvimento sob investigação. Em uma fatia de cérebro optimamente dissecado, o axónio do neurónio pré-sináptico, não é necessária a ser paralelo à superfície da fatia. Em vez disso, eles devem apontar para as fatias com um ângulo raso. A aplica-se para o dendrito apical de neurônios piramidais pós-sinápticos; este deve ser verificado sob o microscópio de luz. Isto é particularmente importante para não local ou tconexões sinápticas ranslaminar, isto é., onde somata pré- e pós-sináptica são mais do que 200 um de distância e a probabilidade de truncamentos dendríticas e axonais é susceptível de ser substancialmente mais elevada do que para ligações locais. - Transferir o cérebro para a câmara de micrótomo. Com base em resultados empíricos, diferentes soluções de corte extracelular são utilizadas, dependendo da idade do animal (ver Quadros 2 e 3; informações úteis também podem ser encontrados sob " http://www.brainslicemethods.com/ ').
- Apare o cérebro até a região alvo é visível.
- Para obter fatias com uma visibilidade célula boa, corte 300-400 ^ M grossas fatias de cérebro se o animal está madura (> 3 semanas). Se o animal é imaturo (1ª a 2ª semana pós-natal para camundongos e ratos) fatias podem ser cortadas com uma espessura de ~ 600-800 mm, sem prejudicar substancialmente visib celularility.
NOTA: Isto irá melhorar a estabilidade de fatias "imaturas" e reduzir o número de possíveis truncations de dendrítica de longo alcance e garantias axonal. - Transferir fatias a partir da câmara de micrótomo para uma câmara de incubação com a solução corte arejada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO 2. Manter as fatias na câmara de incubação durante pelo menos 30 minutos a 1 hora ou à temperatura ambiente ou a ~ 30 ° C, dependendo do tipo de experiência.
3. Emparelhados patch-clamp Gravação e biocitina Filling
Dependendo do tipo de conexão sináptica três abordagens diferentes são usados para encontrar neurônios synaptically acoplados. Se a probabilidade de conexão é baixa (como pode ser esperado para conexões mais excitatórios), proceda da seguinte forma:
- Conexões neuronais com uma baixa conectividade
- Encha as pipetas com uma solução de remendo interno da composição listadana Tabela 4 Para todas as gravações com a configuração de célula inteira adicionar biocitina a concentrações entre 3 -. 5 mg / ml para a solução interna (pipeta) para se obter bons resultados de coloração para os neurónios pré e pós-sinápticos. Deixe biocitina difusa para dentro da célula durante, pelo menos, de 15 - 30 minutos (dependendo do tamanho do neurónio).
NOTA: Não adicionar biocitina à solução utilizada nas pipetas 'procurando' mencionados abaixo. - Remendar um neurónio pós-sináptico putativo no modo de célula inteira. Use pipetas de patch com uma haste longa e esguia. Isso facilita a manobrabilidade da pipeta no âmbito do objectivo e reduz artefatos de movimento que podem ocorrer quando o eletrodo é introduzido na fatia.
- Então, remendar um potencial neurônio pré-sináptico em uma configuração ligado à célula usando uma 'procura' pipeta pedaço de 8-10 resistência mohms e um diâmetro pequeno ponta. Com estas pipetas estabelecer um patch anexado-cell 'solto'. Fill a 'procura' pipeta com uma solução interna em que K + são substituídos por Na + (Tabela 5), a fim de não despolarizar os neurónios durante procura para uma célula pré-sináptica.
NOTA: A resistência do selo 'solto' não está na faixa GÊ mas normalmente em torno de 30-300 mohms. - Segure o potencial de membrana sob o selo 'solto' para cerca de -30 a -60 mV no modo braçadeira atual. Em seguida, aplicam-se grandes pulsos de corrente (0,2-2 nA) para eliciar um potencial de acção no potencial da célula pré-sináptica. Observe este potencial de ação como uma pequena spikelet sobre a resposta de tensão.
- Defina a frequência de estimulação a 0,1 Hz para evitar run-down de uma resposta pós-sináptica. Use freqüências de estimulação inferiores no caso de o tecido cerebral é muito imaturo ou a conexão sináptica não muito confiável.
- No caso de o neurônio "pós-sináptico" não responder à estimulação do testados neu 'pré-sináptico'ron, remendar um novo neurônio em modo 'solto' selo. Não substitua o 'pesquisar' eletrodo remendo enquanto o selo com uma resistência de> 30 mohms é estabelecida. Teste até 30 neurônios pré-sinápticos potencialmente desta forma.
NOTA: Para evitar a danificação do neurónio durante a pesquisa com o procedimento de fixação de membranas solta, apenas suavemente sucção deve ser aplicado para a pipeta de pesquisa em comparação com a aplicada ao penso pipeta de célula inteira. - Se a estimulação nos modo selo resultados 'soltas' em um EPSP / IPSP com uma latência <5 ms no neurônio pós-sináptico remover o 'pesquisar' pipeta da neurônio pré-sináptico.
- Substitua a 'procura' pipeta de patch com um eletrodo de patch preenchido com solução interna regular contendo biocitina. Assegurar esta pipeta remendo gravação tem uma resistência de 4-8 mohms; quanto maior for o tamanho menor será a soma da resistência do eléctrodo pode ser.
- Corrija a pré-sinápticoneurônio e registro na célula inteira, o modo atual-clamp. Provocar potenciais de ação por injeção de corrente nos neurônios pré-sinápticos e gravar a resposta pós-sináptica. Armazenar os dados em um computador para análise posterior off-line.
- Encha as pipetas com uma solução de remendo interno da composição listadana Tabela 4 Para todas as gravações com a configuração de célula inteira adicionar biocitina a concentrações entre 3 -. 5 mg / ml para a solução interna (pipeta) para se obter bons resultados de coloração para os neurónios pré e pós-sinápticos. Deixe biocitina difusa para dentro da célula durante, pelo menos, de 15 - 30 minutos (dependendo do tamanho do neurónio).
- Conexões neuronais com uma conectividade de alta
NOTA: Para microcircuitos neuronais com uma relação de conectividade de alta (> 30%) utilizam um procedimento diferente para encontrar conexões sinápticas. Este procedimento está descrito a seguir e é frequentemente utilizado para a conexão sináptica inibidora que têm, em média, uma proporção mais elevada do que a conectividade conexões excitatórios 36. Ela não deve ser usado quando o rácio conectividade cai abaixo deste valor.- Remendar um neurónio pré-sináptico directamente no modo de célula inteira. Então, remendar um potencial neurônio pós-sináptico, também no modo de células inteiras. Ambas as células devem estar sob o controle de aperto atual. Eliciar um potencial de acção na célula pré-sináptica. Monitorar o neurônio pós-sináptico prospectivo para uma postsypotencial naptic.
- No caso de o neurónio não mostram uma resposta à estimulação pré-sináptico, um remendo neurónios novo no modo de célula completa usando um eléctrodo de adesivo cheio com solução interna regular. Se a conexão for encontrada, não altere a pipeta de patch, mas continuar com a gravação. Em seguida, proceda como no passo 3.1.9.
- Conexões neuronais via GAP-junções
NOTA: Para procurar as ligações eléctricas (gap-junction) use o procedimento a seguir, que é uma versão modificada do que usado para conexões de baixa probabilidade.- Remendar um neurónio pós-sináptico na configuração de fixação de membranas de células inteiras.
- Posteriormente, remendar um neurônio pré-sináptico putativo na configuração solta-seal (baixa resistência selo de 30-300 mohms) usando uma 'procura' pipeta pedaço de 7-10 resistência mohms. Esta pipeta deve ser preenchido com a solução interna modificada alta Na + para a estimulação solta-seal.
- INJECt 100-300 ms longos pulsos de corrente hiperpolarizantes através do selo 'solto'; o potencial de comando pipeta deve ser definido para cerca de -60 a -70 mV. Observar uma conexão junção gap Se isso resultar de estimulação em uma pequena resposta hiperpolarizante no neurônio 'pós-sináptica.
- Repatch o neurónio "pré-sináptica", no modo de célula inteira e proceder como acima descrito.
NOTA: Para garantir uma boa coloração dos processos axonais e dendríticas, utilize o protocolo dado abaixo. Este protocolo é descrito em breve aqui, no entanto, um protocolo detalhado para processamento histoquímica utilizada no nosso laboratório é dada no Exemplo de Ref. 37.
4. Histochemical Processing
- Transferir a fatia de cérebro com o par de neurónios sinapticamente acoplados para um frasco contendo 4% de paraformaldeído dissolvido em tampão fosfato 0,1 M e fixar a fatia durante 24 h. Para a microscopia eletrônica, fixar a fatia usando 2,5% glutaraldeído e 1% de paraformaldeído.
- No dia seguinte, transferir as fatias em tampão de fosfato não contendo normais fixador. Lavar as fatias com tampão fosfato para 6 - 8 vezes durante 10 - 15 minutos cada para remover o excesso de fixador.
- Incubar durante 20 min fatias em um 3% de H 2 O 2 em solução tampão de fosfato 0,1 M para minimizar a reacção da peroxidase endógena. Observar a formação de bolhas forte. Continuar a reacção até que não haja mais bolhas são produzidos. Em seguida, enxaguar as fatias em tampão fosfato 0,1 M para 6 - 8 vezes (durante 10 min cada) para remover qualquer remanescente H 2 O 2.
- Reacções imunocitoquímicos e cromogénicos
A visualização dos neurónios encheu-biocitina baseia-se numa reacção de peroxidase de rábano biotinilada-estreptavidina catalisada com diaminobenzidina; isso produz um precipitado escuro que produz uma mancha roupas com alta resolução espacial. Os seguintes procedimentos são utilizados para a reacção cromogénica: <ol> - Preparar a solução ABC, conforme o protocolo do fabricante. Adicionar a 14,55 ml de tampão de fosfato suplementado com 150 ul de 10% de Triton X100 (Tabela 6; apenas por microscopia de luz) e manter a solução durante cerca de 30 min no escuro. Incubar fatias nesta solução O / N antes do uso.
- Incubar fatias em solução ABC num agitador durante 1 hora à temperatura ambiente e no escuro. Subsequentemente, manter fatias O / N a 4 ° C num frigorífico. Na manhã seguinte, as fatias incubar à temperatura ambiente durante uma hora adicional.
- Depois disto, enxaguar fatias pelo menos quatro vezes durante 10 minutos cada em tampão de fosfato. Em seguida, incubar num agitador durante cerca de 30 min no escuro em 2 ml de uma solução 3-3'-diaminobenzidina-níquel intensificada (Tabela 7). Tenha muito cuidado ao manusear diaminobenzidina e usar apenas sob o exaustor; é extremamente cancerígeno mesmo em concentrações muito baixas.
- Adicionar 6,5 mL de 3% de H 2 O 2 para o contendo diaminobenzidinasolução. Monitorar a reacção cromogénica sob um microscópio de luz até neurônios manchadas marrom-preto são claramente visíveis. Em seguida, parar a reacção por lavagem imediatamente fatias várias vezes em tampão de fosfato.
- Fatias Monte com neurônios manchadas em adesivo, Histobond revestido de silano ou extrusadas lâminas objeto padrão.
- Mantenha as lâminas em câmara úmida, com, pelo menos, 80% de umidade O / N. No dia seguinte, as fatias de deixar secar ao ar durante mais 10 min. Antes da incorporação, as lâminas de transferência em soluções com concentrações crescentes de etanol (20 - 100%), a fim de desidratar-los.
NOTA: O processo de desidratação deve ser lento em contrário distorções nos processos dendríticos e axonal é provável que ocorram 37. Se um procedimento alternativo de incorporação é escolhido, por exemplo, um com o Moviol à base de glicerol, uma desidratação não é necessária; no entanto, este é provável que resulte em uma compressão inhomogeneous da fatia e, portanto, uma morpholo neuronal distorcidaGy. - Finalmente, incubar por 10 min em xilol, incorporar as fatias em um meio de incorporação hidrofóbico para microscopia de luz e colocar um lamelas de ultra-finas na parte superior. Deixe lâminas secar durante 20 minutos à temperatura ambiente.
5. Neuronal Reconstrução e Synaptic Contato Localização
- Examinar as lâminas com neurónios rotulados-biocitina sob um microscópio de luz equipado com uma objectiva 60X / imersão em óleo de 100X e um condensador com uma elevada abertura numérica para resolução espacial óptima. Certifique-se de que boutons axonal e espinhas dendríticas são claramente visíveis.
- Seguir neurônios ou pares de neurônios synaptically acoplado usando um neurônio comercial sistema de rastreamento (ver Tabela de Specific materiais / equipamentos) para obter reconstruções neuronais 3D. Realizar rastreamento manualmente sob inspeção visual constante para detectar até mesmo pequenos axonal ou colaterais dendríticas. Para gravações pareadas de neurônios acoplados synaptically traçado manual ainda é o método deescolha, porque a atribuição de, por exemplo, um perfil axonal, quer o neurônio pré ou pós-sináptica requer experiência reconstrução substancial.
- Se necessário, fazer contagens de boutons axonal e / ou espinhas dendríticas. Por causa espinhas ou mesmo subtipos da coluna e boutons axonal pode apresentar uma distribuição e densidade específica em relação à eg, camada cortical ou área, isso pode ajudar a caracterizar os tipos de células neuronais.
- Para pares de neurônios acoplados synaptically, verifique o axônio pré-sináptico e pós-sinápticos dendrites para aposições perto com a maior ampliação disponíveis. Observar uma Bouton axonal e uma espinha dendrítica pós-sináptico ou o eixo está no mesmo plano focal pode ser considerado como um contacto sináptico putativo. Marque esse contato na reconstrução.
- Corrija as reconstruções neuronais para o encolhimento em todas as três dimensões espaciais na seção apropriada do programa de rastreamento.
NOTA: Durante a fixação, processamento histoquímicae desidratação deformação mecânica substancial e a contracção ocorrem; isso vai afetar medidas de comprimento axonais e dendríticas e distorcer gravemente o seu arranjo espacial. Fatores de correção contração para o meio de incorporação são ~ 1.1 para direções x e y e ~ 2.1 para a direção z 37. - Para uma análise morfológica quantitativa usar um programa de análise de dados para a neurofisiologia (ver Tabela de Specific materiais / equipamentos).
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Representative Results
Gravações emparelhados são o método de escolha para uma caracterização detalhada das conexões sinápticas uni ou bidirecionais morfologicamente identificadas, bem como a junção da diferença conexões (elétricas) (Figura 1). Um exemplo de uma gravação emparelhado na camada 4 do córtex somatossensorial tambor é mostrado na Figura 1A. Ambos excitatório unidireccional e conexões sinápticas inibidoras pode ser caracterizado (Figura 1B, C). Além disso gravações emparelhadas permitem gravar a partir de conexões sinápticas bidireccionais, ou seja, a partir de ligações em que ambos os neurónios em um par são pré- e pós-sináptico para o outro. Isto é ilustrado na Figura 1D, o qual mostra as gravações de um inibidor interneurónio e um neurónio excitatório. Identificação de um potencial de ação no neurônio excitatório (traços vermelhos) resulta em um EPSP no interneuron inibitório pós-sináptica (traços pretos). No entanto, quando um potencial de acção é evoked no interneuron, um IPSP pode ser gravado no neurônio excitatório. Figura 1E mostra que também é possível gravar a partir de neurônios acoplados via junção gap ou através de uma junção de lacuna e uma sinapse química. Conexões de junção recíprocas e diferença só pode ser identificado por registros eletrofisiológicos emparelhados até agora, mas não por qualquer outra técnica.
A combinação de enchimento biocitina de neurônios acoplados através da pipeta patch e os registros eletrofisiológicos permite uma correlação de propriedades morfológicas dos neurônios às propriedades sinápticas. Após processamento neurónios histoquímicos são visíveis como estruturas escuras na fatia fixado (Figura 2A). Em seguida, o par de células neuronais gravado pode ser reconstruído morfologicamente e os tipos de células neuronais pode ser identificado. Além disso, é possível identificar o número e localização dos contactos sinápticos putativos (Figura 2A painéis direitos e Figure 2B inserção). O par neurônio mostrado na Figura 2B mutuamente conectado e contatos sinápticos, portanto, são estabelecidos em ambos os neurônios. Em nossas mãos, putativos, luz microscopicamente identificados contatos sinápticos foram confirmadas como verdadeiras contatos sinápticos com o microscópio eletrônico com um 80 - grau de 90% de precisão 16,21,26.
A Figura 3 mostra um exemplo de uma gravação emparelhado a partir de um neurónio pré-sináptico na camada piramidal neocortical 6 do córtex barril e um neurónio espinhoso excitatório em camada 4. Este microcircuito neuronal translaminar tem uma baixa probabilidade de ligação, mas pode ser identificada usando o procedimento descrito na pesquisa passos 3.1.1 - 3.1.9 para conexões neuronais com uma baixa conectividade. Com a técnica de gravação emparelhado é possível identificar conexões sinápticas com uma conectividade muito baixo como é o caso de algumas ligações de longo alcance translaminar (neste exemplo) ou conexões entre neurons localizados em diferentes 'colunas' corticais (conexões sinápticas inter-colunar).
Figura 1. gravações pares de pares de células synaptically acoplados. (A) Esquerda, imagem IR-DIC de uma fatia do cérebro. Direita, um interneurónio (topo) e uma neurónios excitatórios (parte inferior). (B) Um potencial de acção pré-sináptico (topo) num neurónio provoca um potencial excitatório pós-sináptico excitatório monossináptico (EPSP) em outro neurónio excitatório (parte inferior). (C) O potencial de ação (parte superior) em um interneuron inibitório pré-sináptico evoca um potencial pós-sináptico inibitório monosynaptic (IPSP), em um neurônio excitatório (em baixo). (D) Um potencial de ação (canto superior esquerdo) em um neurônio pré-sináptico excitatório evoca uma EPSP (canto inferior esquerdo) em interneurônio inibitório. Por sua vez, um potencial de acçãono interneuron inibitória (canto superior direito) provoca uma IPSP no neurônio excitatório (canto inferior direito). (E) Uma série de passos de tensão hiper e despolarização desencadeados pela injeções de corrente em um neurônio (canto superior esquerdo) é refletida em um gap-junction segundo neurônio acoplado (canto inferior esquerdo). Além disso, um potencial de acção pré-sináptico (superior direito), em primeiro neurónio evoca uma pequena despolarização precoce (espiguetas, inserir) seguido por uma hiperpolarização profunda tardia (IPSP) no potencial de membrana do segundo neurónio (inferior direito). Barras de escala em (B) aplicam-se também a (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Identificação de contatos sinápticos e Reconstr morfológicaução de pares de células cheias de biocitina. (A) Esquerda, photomicrograph baixo consumo de energia de um par de células reciprocamente acoplado compreendendo um estreladas espinhoso e um interneuron fast-spiking na camada 4, que foram preenchidos com biocitina durante a gravação. Luz microscopicamente identificados contatos sinápticos excitatórios putativos entre o neurônio pré-sináptico e espinhoso o interneuron pós-sináptica são marcados por pontos verdes. Putativos contatos sinápticos inibitórios recíprocas são indicados por pontos azuis. Imagens certas, de alta potência de contatos sinápticos. Círculos abertos verdes, contatos excitatórios; círculos abertos, azul contactos inibitórios. Camada fronteiras foram determinadas pela estrutura citoarquitetônicos da fatia cerebral coradas sob o microscópio de baixa potência. (B) Neurolucida reconstrução da mesma célula par mostrado em (A) e a Figura 1C. Azul, axônio interneuron; vermelho, soma interneuron e dendritos; verde, axônio do neurônio espinhoso; branco, soma espinhoso neurônio e dendritos. A inserçãomostra os compartimentos somatodendríticos dos neurônios pré e pós-sinápticos, juntamente com os contatos sinápticos putativos. Barril contornos foram identificadas nas de baixa potência photomicrographs brilhante em campo feitas a partir da fatia cerebral aguda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A conexão sináptica representante com muito baixa taxa de conectividade. (A) Um potencial de acção pré-sináptico (em cima) numa camada de células piramidais 6 evoca um potencial pós-sináptico excitatório monossináptico (parte inferior) em estrela uma camada 4 de neurónios piramidais. Repare na longa latência (> 3,0 mseg) desta ligação trans laminar comparada com a de ligações intra-laminares locais (≈1.0 mseg). (B) respons pós-sinápticose da camada de 4 estrelas piramidal neurônio para dois potenciais de ação em 10 Hz atingida em uma camada de 6 células piramidais. Note-se a facilitação de curto prazo desta ligação em comparação com a depressão a curto prazo de ligações locais (dados não mostrados). (C) Maior profundidade de foco de imagem da mesma ligação, como em (A, B). Inset, o somato / domínio dendrítica de uma camada de 4 estrelas piramidal neurônio. Observe a presença de um dendrito apical proeminente marcado por uma seta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glicose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 2.1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 2 | 0,294 |
| MgCl2 | 1 | 0,095 |
| Osmolaridade ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gaseificada com 95% de O2 e 5% de CO 2 | ||
Tabela 1. Artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) para perfusão durante a gravação.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glicose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 5 | 0,476 |
| Mio-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-piruvato | 2 | 0,22 |
| Ácido ascórbico (vitamina C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolaridade ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gaseificada com 95% de O2 e 5% de CO 2 | ||
Tabela 2. solução extracelular de fatias cerebrais agudas em animais imaturos.
| mM | g / L | |
| Sacarose | 206 | 70,51 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glicose | 25 | 4,5 |
| NaHCO3 | 25 | 2.1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 3 | 0,286 |
| Mio-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-piruvato | 2 | 0,22 |
| Ácido ascórbico (vitamina C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolaridade ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gaseificada com 95% de O2 e 5% de CO 2 | ||
Tabela 3. solução extracelular de fatias cerebrais agudos de animais maduros (sucrose salina).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-gluconato | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfocreatina | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajustar o pH para 7,3 com KOH | |||
| Osmolaridade ~ 300 mOsmol / L | |||
| Adiciona-se 3 - 5 mg / ml biocitina | |||
Tabela 4. Adição da solução de cloreto de baixo.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-gluconato | 105 | 22.92 | 1.146 |
| NaCl | 30 | 1,76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfocreatina | 10 | 2.552 | 0,1276 |
| ATP-Mg 2+ | 4 | 2.028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Ajustar o pH para 7,3 com NaOH | |||
| Osmolaridade ~ 300 mOsmol / L | |||
Tabela 5. Na altapipeta solução para a busca neurônios synaptically acoplados.
| relação | ml | |
| Um reagente | 1 | 0,15 |
| reagente B | 1 | 0,15 |
| 10% de Triton X100 | 1 | 0,15 |
| Tampão fosfato 0,1 M | 97 | 14.55 |
| Mantido durante 30 min no escuro antes do uso | ||
Tabela 6. solução ABC para reação histoquímica.
| peso | volume | |
| 3-3'-diaminobenzidina | 10 mg | - |
| Tampão fosfato 0,1 M | - | 20 ml |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5-10 ul |
| 1% CoCl2 | - | 5 ul |
| 1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 e 1% de CoCl2 são adicionados gota a gota enquanto se agitava a solução. | ||
Tabela 7. Solução de reacção diaminobenzidina (DAB).
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Discussion
Gravações pares de excitatório sinapticamente acoplados e / ou os neurónios inibitórios são uma abordagem muito versátil para o estudo de microcircuitos neuronais. Não só esta abordagem permitem estimar conectividade sináptica entre os tipos de neurônios, mas também permite determinar as características funcionais da conexão e da morfologia dos neurônios pré e pós-sinápticos. Além disso, agonista e / ou antagonista pode ser facilmente aplicado aos neurónios em preparações de fatias. Isto permite estudar os efeitos da neuromoduladores sobre as propriedades de transmissão sináptica 32 ou uma caracterização detalhada de uma conexão sináptica unitária definida utilizando, por exemplo, análise de quantal 16,17,38,39 libertação sináptica. Descoberta de química e / ou (junção gap) elétrica conexões sinápticas é a etapa mais crítica do presente protocolo. Temos, portanto, listadas diferentes abordagens para encontrar conexões sinápticas, dependendo da relação de conectividade e suaTipo (químico / elétrico).
A principal desvantagem das preparações fatia é o truncamento muitas vezes substancial das projeções axonais de longo alcance, de modo que apenas pequenas partes do comprimento axonal total do axônio são recuperados. Para alguns tipos de células piramidais, o grau de truncagem poderia até 90% ou mesmo mais, quando tendo projecções para outras áreas corticais ou subcorticais regiões em conta. Isto torna a preparação fatia inadequados para o estudo das conexões sinápticas entre os neurónios dos corpos celulares das quais são mais do que> 300 mm aparte. No entanto, em preparações de fatias agudas, as projecções axonais locais, em particular aqueles de interneurónios locais são geralmente recuperados com um grau relativamente baixo de truncamento dendrítica e axonal (~ 10% ou menos), devido à extensão campo horizontal e verticalmente limitada dos seus mandris axonais . As ligações que envolvem estes tipos de neurónios podem, portanto, ser caracterizados com um elevado grau de precisão e reliability e produzir estimativas de conectividade em grande parte corretos. Com exceção dessas conexões sinápticas locais, os valores absolutos para os rácios de conectividade entre dois tipos de neurônios obtidos em preparações fatia são altamente problemática, em particular para os neurônios com grandes distâncias inter-somáticas como em translaminar ou de longo alcance não-local intralaminar conexões sinápticas . Este problema é exacerbado quando as condições de fatiar não foram optimizadas para uma determinada ligação sináptica em uma idade definida. Para conectividade estimado novas metodologias mais realistas, como elétrons densa reconstruções microscópicas 40 e axo-dendrítica estrutural sobreposição 41 foram desenvolvidos. No entanto, até mesmo estas técnicas têm que levar em conta a grande diversidade de interneurónios inibitórios e também neurónios excitatórios.
Um problema adicional com as estimativas de conectividade é que contatos sinápticos distais, por exemplo, aqueles em tufo apical de neurônios piramidais, podeescapar à detecção. Quando medido na soma da amplitude de sua resposta sináptica é muito pequena e é provável que desapareça no ruído (Qi et al., 2014, em submissão). No entanto, este tipo de problema não se restringe à abordagem de gravação emparelhado mas também vai ocorrer com outras técnicas utilizadas para estudar a conectividade sináptica.
Em recente anos induzida por luz ativação de microcircuitos neuronais (ie, por photo-liberação de glutamato enjaulado ou por ativação de channelrhodopsin) tem sido utilizado para investigar a conectividade neuronal, mesmo em uma escala maior 42-52. No entanto, com estas abordagens ópticas que não é possível identificar as propriedades estruturais do tipo neurónio pré-sináptico. Além disso, o número e localização dos contactos sinápticos estabelecidos por uma ligação neuronal não pode ser identificado, pelo menos até à data. Gravações emparelhados, por outro lado, permitem que a caracterização de ambos neur pré- e pós-sinápticosobre os tipos em um microcircuito sináptica. Isto é particularmente importante uma vez que vários estudos têm demonstrado que ambos os interneurónios sensíveis a GABA e neurónios excitatórios são altamente diverso com respeito à sua fisiologia e morfologia sináptica 53-56. Assim, a identificação de ambos os neurônios pré e pós-sinápticos é um pré-requisito para a descrição de uma conexão sináptica 57. Finalmente, gravações emparelhados permitir a gravação de diferentes configurações de conexão sináptica (conexões recíprocas, coexistindo junções comunicantes e sinapses químicas). Portanto, a técnica de gravação emparelhado continuará a ser uma importante abordagem para o estudo de microcircuitos neuronais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
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