Abstract
Kombinationen av patch clamp inspelningar från två (eller flera) synaptically kopplade nervceller (parade inspelningar) i akut hjärn slice beredningar samtidig intracellulär biocytin fyllning möjliggör en korrelerad analys av deras strukturella och funktionella egenskaper. Med denna metod är det möjligt att identifiera och karakterisera både pre- och postsynaptiska neuroner genom sin morfologi och elektrosvarsmönster. Kopplade inspelningar tillåter studera anslutningsmönstren mellan dessa neuroner liksom egenskaperna för både kemisk och elektrisk synaptisk överföring. Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av de förfaranden som krävs för att få tillförlitliga parade inspelningar tillsammans med en optimal återhämtning av neuron morfologi. Vi kommer att beskriva hur par av nervceller anslutna via kemiska synapser eller kanalförbindelser identifieras i hjärnan slice förberedelser. Vi kommer att beskriva hur nervceller rekonstrueras för att få deras 3D morfologi dendritic och axonal domän och hur synaptiska kontakter identifieras och lokaliseras. Vi kommer också att diskutera de förbehåll och begränsningar parade inspelningsteknik, särskilt de som förknippas med dendritiska och axonal stympningar under utarbetandet av hjärnan skivor eftersom dessa påverkar starkt uppskattningar anslutnings. Men på grund av mångsidigheten hos den parade inspelnings strategi kommer det att förbli ett värdefullt verktyg i att karakterisera olika aspekter av synaptisk transmission vid identifierade neuronala mikrokretsar i hjärnan.
Introduction
Neuronala mikrokretsar mellan två synaptically kopplade nervceller är byggstenar i storskaliga nätverk i hjärnan och är grundläggande enheter av synaptiska informationsbehandling. En förutsättning för karakterisering av sådana neuronala mikrokretsar är att veta morfologi och funktionella egenskaper hos både pre- och postsynaptiska partner neuroner, typen av den synaptiska anslutning (er) och dess struktur och funktionsmekanism. Men i många studier av synaptiska förbindelser åtminstone en av de nervceller i en mikrokrets är inte väl karakteriserade. Detta beror på de relativt ospecifika stimuleringsprotokoll som ofta används i studier av synaptiska uppkoppling. Därför är de strukturella och funktionella egenskaperna hos den presynaptiska nervcellen antingen inte identifieras alls eller endast till en ganska liten utsträckning (dvs. uttrycket av markörproteiner osv). Kopplade inspelningar i kombination med intracellulär färgning av markörer sUCH som biocytin, neurobiotin eller fluorescerande färger är bättre lämpade för att studera små neuronala mikrokretsar. Denna teknik medger en för att undersöka många strukturella och funktionella parametrar av en morfologiskt identifierade synaptisk förbindelse samtidigt.
Så kallade "enhetlig" monosynaptic anslutningar mellan två nervceller har undersökts i både kortikala och subkortikala hjärnregioner 1-10 använder akuta slice förberedelser. Inledningsvis var skarpa mikroelektroder användes i dessa försök; senare var patch clamp inspelning användes för att erhålla inspelningar av synaptiska signaler med lägre ljudnivå och en förbättrad tidsupplösning.
En betydande tekniskt framsteg var användningen av infraröd differential interferens kontrast (IR-DIC) optik 11-14, en mikroskopisk teknik som avsevärt förbättrat synligheten och identifiering av nervceller i hjärnan skiva så att det blev möjligt to få inspelningar från visuellt identifierade synapsförbindelser 15-17. I allmänhet är parade inspelningar görs i akuta skiva preparat; endast ett fåtal publikationer är tillgängliga rapporterings inspelningar från synaptically anslutna nervceller in vivo 18-20.
Den viktigaste fördelen med parade inspelningar är det faktum att en funktionell karakterisering kan kombineras med en morfologisk analys vid både ljus- och elektronmikroskopi mikroskopisk nivå (se t ex., 7,16,21). Efter histokemisk bearbetning, är det dendritiska och axonal morfologi synaptiskt anslutna neuron paret spåras. Därefter är det möjligt att kvantifiera morfologiska funktioner såsom längd, rumslig densitet, orientering, förgrening mönster etc. Dessa parametrar kan sedan ge en grund för en objektiv klassificering av en specifik synaptisk anslutning. Dessutom, till skillnad från de flesta andra tekniker som används för att studera neuronala connectivitet, parade inspelningar medger också att identifiera synaptiska kontakter för enhets synapsförbindelser. Detta kan göras direkt med hjälp av en kombination av ljus och elektronmikroskopi 16,21-27 eller använda kalcium avbildning 28,29 av Dendritutskotten. Men med den senare metoden bara retande men inte hämmande anslutningar kan studeras eftersom det kräver kalciuminflödet via postsynaptiska receptorkanaler.
Förutom en detaljerad analys av synaptisk transmission vid en definierad neuronala mikrokrets parade inspelningar också tillåta studiet av synaptisk plasticitet regler 30,31 eller - i kombination med agonist / antagonist ansökan - modulering av synaptisk transmission av signalsubstanser såsom acetylkolin 32 och adenosin 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden har genomförts i enlighet med EU: s direktiv om skydd av djur, den tyska djurskyddslagen (Tierschutzgesetz) och riktlinjerna för Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Ställ upp för Elektro
Innan med parade inspelning, har en elektrofysiologi set-up som ska byggas. En kort sammanfattning om hur en sådan set-up monteras ges nedan:
- Installera en anti-vibrationsbord som mikroskopet, manipulatorerna och all annan utrustning kommer att placeras.
OBS: Vibration eller någon annan typ av rörelse måste vara så liten som möjligt vid inspelning från synapsförbindelser eftersom detta kräver en förändring av pipetter (sökning elektrod ersättas med inspelning elektrod). - Placera en Faraday-bur runt den antivibrationsbord för att minska elektriskt brus. Anslut all utrustning inne i Faraday caGE med elektrisk jord.
- Installera ett mikroskop med en motoriserad fokus axel som är baserad på en motordriven xy tabell på antivibrationsbordet enligt tillverkarens anvisningar. Detta gör det möjligt att på ett tillförlitligt flytta mikroskop för att nervceller som inte finns i samma synfält som det är fallet för translaminär anslutningar i neocortex.
- Installera en videokamera på kameraporten av mikroskopet och anslut den till analog och / eller digitala skärmar för att observera skiva beredning och rörelsen av elektroder. Använd en kamera, som kan kopplas mellan en låg- och en hög effekt förstoring för att få en överblick och en närbild bild, respektive av den synaptically kopplade neuronala cellparet. Detta hjälper också till att kontrollera förflyttning av lappelektrod.
- Installera ett prov tabell som innehåller en infälld för badet kammaren (borrade in-house från en Perspex block) för hjärnan skiva beredning. Detta exemplar tabellen får inte anslutas tillmikroskop, dvs måste förankras luftbordet och mikroskopet ska vara manövrerbart under den.
- Montera två (eller fler vid behov) med hög precision mikromanipulatorer som kan flyttas i alla tre dimensioner. Installera patch-clamp förförstärkare på manipulatorer och anslut dem till huvudförstärkaren.
OBS: Om krävs ytterligare manipulatorer kan installeras för t.ex. mer än två pre-förstärkare, extracellulära stimuleringselektroder, drug delivery system etc. - Placera badkammaren i provet tabellen. Installera en lösning inlopp och utlopp och anslut dem till perfusionssystemet.
- Använd en peristaltisk pump för att upprätthålla perfusion av inspelningen kammare med artificiell cerebrospinalvätska (ACSF, tabell 1) vid en stabil flödeshastighet av 4-6 ml / min för optimal skiva viabilitet.
OBS: Överskrid inte denna flödeshastighet betydligt eftersom det kommer att leda till turbulens i ASCF och därmed rörelse av skiva. Installera hållare för temperaturgivare och Ag / AgCl jordelektrod på preparatbordet. Detta är nödvändigt för att proben och elektroden att sampla badet i kammaren. - För en bra synlighet nervceller i slice beredningen använder infraröd belysning i mikroskopet. Detta minskar ljus diffraktion och därmed oskärpa. Kontrollera att Mikroskopet är utrustat med differentialinterferenskontrastoptik för att åstadkomma en '3D' liknande visualisering. Detta kommer att hjälpa att lappa nervceller och tillåta inriktning nervceller djupt i slice (60 pm eller djupare).
- Under experimentet hålla hjärnan skivor i en experimentell kammare med ett täckglas på botten. Placera en "platina harpa 'på toppen av skiva för att hindra skivorna från flytande. En platina harpa är tillverkad av U-formade, tillplattad platinatråd med strängar av tandtråd limmade på den.
- Håll ACSF perfusion av skiva vid en temperatur av 32-35 ° C för att säkerställa optimal kontroll av syresättning och pH. Detta kan göras genom upphettning av lösningen med en Peltier-anordning installerad i närheten av ACSF inflödet i badkammaren.
OBS: Använd ultratunna täckglas så att även mikroskop kondensorer med en hög numerisk bländare och kort arbetsavstånd kan fokuseras på provet. Detta är nödvändigt för en optimal belysning av skiva.
För en bild och en beskrivning av ett elektrofysiologi installation optimerad för parade inspelningar i hjärnan skiva beredning se figur 4 i ref. 34.
2. Brain Slice Förberedelser
- Milt söva djuret från vilket hjärnvävnaden bör tas med isofluran (slutlig koncentration <0,1%).
Observera: Andra anestetika kan även användas. Användning av bedövningsmedel bör uppfylla respektive djur kommitténs rekommendationer och regler. Se alltid till att djuret inte är irriterad eller stressad efter att ha lagtanestetikumet. - Halshugga djuret, öppna skallen och ta bort hjärnan så snabbt som möjligt med användning av förfarandet beskrivet i ref. 34,35.
- Överför hjärnan i kyld (4 ° C) artificiell cerebrospinalvätska luftad med en blandning av karbogen gas med 95% O2 och 5% CO2.
- Isolera hjärnan region som bör studeras.
OBS: De parametrar för att uppnå optimal konservering och minimal trunkering av dendriter och axoner av pre- och postsynaptiska neuroner bör fastställas i förväg för varje neuronal anslutning och utvecklingsstadiet under utredning. I ett optimalt dissekeras hjärnan skiva, är axonet av presynaptiska neuron behöver inte vara parallell med slice ytan. Snarare bör de pekar in i skivor med en flack vinkel. Den gäller för den apikala Dendrite av postsynaptiska pyramidala nervceller; detta bör kontrolleras under ljusmikroskop. Detta är särskilt viktigt för icke-lokal eller translaminar synapsförbindelser, dvs., där pre- och postsynaptiska somata är mer än 200 pm isär och sannolikheten för dendritiska och axonal stympningar sannolikt är betydligt högre än för lokala anslutningar. - Överför hjärnan till mikrotomen kammaren. Utifrån empiriska rön, olika extracellulära skivning lösningar används beroende på djurets ålder (se tabellerna 2 och 3, användbar information kan också hittas under " http://www.brainslicemethods.com/ ").
- Trimma hjärnan tills målregionen är synlig.
- För att få skivor med en god cell synlighet, skär 300-400 um tjocka hjärnan skivor om djuret är mogen (> 3 veckor). Om djuret är omogen (1 st till 2: a efter födsel vecka för möss och råttor) skivor kan skäras upp till en tjocklek på ~ 600-800 nm utan väsentligt försämra cell visibbilitet.
OBS: Detta kommer att förbättra stabiliteten i "omogna" skivor och minska antalet möjliga stympningar av långväga dendritiska och axonal säkerheter. - Överföra skivor från mikrotomen kammaren till en inkubation kammare fylld med skivning lösning luftad med en blandning av 95% O2 och 5% CO2. Förvara skivorna i inkubationskammaren under minst 30 min till 1 h antingen vid RT eller vid ~ 30 ° C, beroende på vilken typ av experiment.
3. Kopplade Patch-Clamp Inspelning och biocytin Fyllning
Beroende på vilken typ av synaptiska anslutning tre olika metoder används för att hitta synaptically kopplade nervceller. Om anslutningen sannolikheten är låg (som kan förväntas för de flesta excitatoriska anslutningar) Gör så här:
- Neuronala anslutningar med låg anslutning
- Fyll patchpipetter med en inre lösning av kompositionen listadi tabell 4 För alla inspelningar i konfigurationen hela-cell lägga biocytin vid koncentrationer mellan 3 -. 5 mg / ml till den interna (pipett) lösning för att uppnå goda färgningsresultat för pre- och postsynaptiska neuroner. Låt biocytin diffusa in i cellen under åtminstone 15-30 min (beroende på storleken av neuron).
OBS: Lägg inte till biocytin till lösningen som används i de "söker" pipetter som nämns nedan. - Patch en förmodad postsynaptisk neuron i hela celler läge. Använd patch pipetter med en lång och smal skaft. Detta underlättar manövrerbarhet av pipetten inom målet och minskar rörelseartefakter som kan uppstå när elektroden införes i segmentet.
- Sedan, patcha en potentiell presynaptisk neuron i en cell-anslutna konfigurationen med en "söka" patch pipett av 8-10 Mohm motstånd och en liten spets diameter. Med dessa pipetter upprätta en "lös" cell-anslutna patch. Fill den "söka" pipett med en inre lösning i vilken K + ersätts av Na + (tabell 5) i syfte att inte depolarisera neuron under söka efter en presynaptisk cell.
OBS: Den "lösa" sigill motstånd är inte i GΩ intervallet men vanligtvis omkring 30-300 MQ. - Håll membranpotentialen under "lös" sigill till ca -30 till -60 mV i strömtång läge. Sedan gäller stora strömpulser (0,2-2 nA) för att framkalla en aktionspotential i den potentiella presynaptiska cellen. Observera denna åtgärd potential som en liten spikelet på spänningssvaret.
- Ställ stimuleringsfrekvensen till 0,1 Hz för att förhindra neddragning av en postsynaptisk svar. Använd lägre stimuleringsfrekvenser vid hjärnvävnaden är väldigt omogen eller den synaptiska anslutningen inte mycket tillförlitliga.
- Om den "postsynaptiska" neuron inte svarar på stimulering av testad "presynaptiska" neuron, patcha en ny neuron i "lös" sigill läge. Ersätter inte "söka" patch elektrod så länge tätning med ett motstånd på> 30 Mohm är etablerad. Testa upp till 30 potentiellt presynaptiska neuroner i detta sätt.
OBS: För att förhindra skador på neuron under sökningsförfarandet med lös patch clamp, bara försiktigt sug ska appliceras på söknings pipetten jämfört med den som tillämpas på hela-cell patch pipett. - Om stimuleringen i "lösa" tätning resulterar detta i en EPSP / IPSP med latens <5 ms i den postsynaptiska neuron bort "söker" pipett från presynaptiska neuron.
- Ersätt "söka" patch pipett med en patch elektrod fylld med biocytin innehållande, regelbunden intern lösning. Se till denna inspelning patch pipett har en resistans på 4-8 Mohm; den större soma storlek desto lägre elektrodmotståndet kan vara.
- Patch presynaptiskaneuron och rekord i hel-cell, strömklämma läge. Elicit aktionspotentialer genom ströminjektion i presynaptiska neuron och registrera postsynaptiska svar. Lagra data på en dator för senare off-line analys.
- Fyll patchpipetter med en inre lösning av kompositionen listadi tabell 4 För alla inspelningar i konfigurationen hela-cell lägga biocytin vid koncentrationer mellan 3 -. 5 mg / ml till den interna (pipett) lösning för att uppnå goda färgningsresultat för pre- och postsynaptiska neuroner. Låt biocytin diffusa in i cellen under åtminstone 15-30 min (beroende på storleken av neuron).
- Neuronala anslutningar med hög konnektivitet
OBS: För neuronala mikrokretsar med en hög andel konnektivitet (> 30%) använder ett annat förfarande för att hitta synapsförbindelser. Detta förfarande beskrivs nedan och används ofta för hämmande synaptisk anslutning som har i genomsnitt en högre kvot anslutning än excitatoriska anslutningar 36. Det bör inte användas när anslutningstalet faller under detta värde.- Patch en presynaptiska nervcellen direkt i helcells-läge. Sedan, patcha en potentiell postsynaptisk neuron, även i hela cellen läge. Båda celler bör vara under strömtång kontroll. Framkalla en aktionspotential i den presynaptiska cellen. Övervaka blivande postsynaptiska neuron för en postsynaptic potential.
- I fallet neuron inte visar ett svar på presynaptisk stimulering, patcha en ny neuron i hel-cell-läge med en patch elektrod fylld med regelbunden intern lösning. Om en anslutning hittas inte byta plåster pipett men fortsätta med inspelningen. Fortsätt sedan som i steg 3.1.9.
- Neuronala anslutningar via gap-junctions
OBS: Om du vill söka efter elektriska (gap-junction) anslutningar använda följande procedur som är en modifierad version av den som används för låg sannolikhet anslutningar.- Patch en postsynaptisk neuron i hel-cell patch clamp konfiguration.
- Därefter patcha en förmodad presynaptisk neuron i den lösa-tätningskonfiguration (lågt sigill resistans 30-300 Mohm) med hjälp av en "söka" patch pipett av 7-10 Mohm motstånd. Denna pipett ska fyllas med den modifierade höga Na + intern lösning för löst tätning stimulering.
- Inject 100-300 ms långa hyperpolarizing strömpulser via "lös" sigill; pipetten kommandopotentialen bör sättas till ca -60 till -70 mV. Observera ett gap junction anslutning om denna stimulering resulterar i en liten hyperpolarizing svar i "postsynaptiska" neuron.
- Repatch den "presynaptiska" neuron i hela celler läget och fortsätt enligt beskrivningen ovan.
OBS: För att säkerställa en god färgning av axonal och dendritiska processer, använda protokollet anges nedan. Detta protokoll beskrivs i korthet här, dock är ett detaljerat protokoll för histokemisk bearbetning används i vårt laboratorium som ges i ref. 37.
4. Histokemisk Processing
- Överför hjärnan skiva med paret av synaptiskt kopplade neuroner in i en ampull innehållande 4% paraformaldehyd löst i 0,1 M fosfatbuffert och fixera segment under 24 h. För elektronmikroskopi, fixera segment med hjälp 2,5% glutaraldehyd och 1% paraformaldehyd.
- På nästa dag, överföra skivor i normal fosfatbuffert innehållande ingen fixativ. Tvätta skivor med fosfatbuffert för 6 - 8 gånger under 10 - 15 minuter vardera för att avlägsna överskott fixativ.
- Inkubera skivor för 20 minuter i en 3% H2O 2-lösning i 0,1 M fosfatbuffert för att minimera endogen peroxidas-reaktionen. Observera stark bubbelbildning. Fortsätt reaktionen tills inga vidare bubblor produceras. Sedan skölja skivorna i 0,1 M fosfatbuffert under 6-8 gånger (10 min vardera) för att avlägsna eventuellt kvarvarande H2O 2.
- Immunocytokemiska och kromogena reaktioner
Visualisering av biocytin fyllda neuroner är baserad på en streptavidin-biotinylerat pepparrotsperoxidas reaktion katalyseras med diaminobenzidin; detta ger en mörk fällning som producerar en skarp fläck med en hög rumslig upplösning. Följande procedurer används för kromogena reaktion: <ol> - Bered ABC-lösning enligt tillverkarens protokoll. Lägg till 14,55 ml fosfatbuffert med tillsats av 150 | il 10% Triton X 100 (tabell 6; enbart för Ijusmikroskopi) och hålla lösningen under ca 30 minuter i mörker. Inkubera skivor i denna lösning O / N före användning.
- Inkubera skivor i ABC-lösning på en skak under 1 h vid RT och i mörker. Därefter hålla skivor O / N vid 4 ° C i ett kylskåp. På nästa morgon, inkubera skivor vid RT under ytterligare en timme.
- Efter detta, skölj skivor åtminstone fyra gånger i 10 min vardera i fosfatbuffert. Därefter inkubera på en skak under omkring 30 minuter i mörker i 2 ml av en nickel intensifierat 3-3'-diaminobensidin lösning (tabell 7). Var mycket försiktig när du hanterar diaminobenzidin och använd endast under dragskåp; det är extremt cancerframkallande även vid mycket låga koncentrationer.
- Lägg 6,5 pl 3% H2O 2 till diaminobensidin innehållandelösning. Övervaka kromogena reaktion under ett ljusmikroskop tills brun-svart färgade nervceller syns tydligt. Sedan stoppa reaktionen omedelbart genom att tvätta skivor flera gånger i fosfatbuffert.
- Montera skivor med färgade nervceller på lim, silanbelagda Histobond eller gelatinestandardobjektglas.
- Håll glasen i en fuktkammare med åtminstone 80% luftfuktighet O / N. På nästa dag, låt skivorna lufttorka under ytterligare 10 min. Innan inbäddning, glidskivorna i lösningar med ökande koncentrationer av etanol (20-100%) i syfte att dehydratisera dem.
OBS! Dehydratiseringsprocessen bör vara långsam annars snedvridningar i de dendritiska och axonal processer kan förekomma 37. Om ett alternativt inbäddning förfarande väljs, t.ex., en med den glycerolbaserat Moviol, en dehydratisering krävs inte; men detta är sannolikt att resultera i en inhomogen kompression av skiva och därmed en förvrängd neuronal morpholoGy. - Slutligen, inkubera under 10 min i xylol, bädda skivorna i en hydrofob inbäddning medium för ljusmikroskop och placera en ultratunna täck ovanpå. Låt objektglasen torka i 20 min vid RT.
5. Neuronal återuppbyggnad och Synaptic Kontakt Lokalisering
- Undersök glasen med biocytin-märkta neuroner under ett ljusmikroskop utrustat med en 60X / 100X oljeimmersionsobjektiv och en kondensor med en hög numerisk apertur för optimal spatial upplösning. Se till att axonal boutons och Dendritutskotten syns tydligt.
- Trace nervceller eller synaptically kopplade neuron paren med ett kommersiellt neuron system för spårning (se tabell på specifika material / utrustning) för att erhålla 3D neuronala rekonstruktioner. Utför spårning manuellt under konstant visuell inspektion för att upptäcka även små axonal eller dendritiska säkerheter. För parade inspelningar från synaptically kopplade nervceller manuell spårning fortfarande metodenval eftersom tilldelningen av t.ex. en axonal profil till antingen före eller postsynaptiska neuron kräver betydande rekonstruktion upplevelse.
- Om det behövs, gör räkningar av axonal boutons och / eller Dendritutskotten. Eftersom ryggar eller ens ryggrad subtyper och axonal boutons kan uppvisa en viss fördelning och täthet med avseende på t.ex. kortikala lager eller område, kan detta bidra till att karakterisera neuronala celltyper.
- För synaptically kopplade neuron par, kontrollera presynaptiska axon och postsynaptiska dendriter för nära appositions på högsta förstoringen tillgängliga. Beakta en axonal bouton och en postsynaptisk dendritiska ryggraden eller axeln är i samma fokalplanet kan betraktas som en förmodad synaptisk kontakt. Markera den här kontakten i återuppbyggnaden.
- Rätta de neuronala rekonstruktioner för krympning i alla tre rumsliga dimensioner i lämpligt avsnitt av spårning programmet.
OBS: Under fixering, histokemiskt bearbetningoch uttorkning betydande mekanisk deformation och krympning inträffar; detta kommer att påverka mätningarna axonal och dendritiska längd och allvarligt snedvrida deras rumsliga arrangemang. Krympning korrektionsfaktorer för inbäddningsmediet är ~ 1,1 för x- och y-riktningarna och ~ 2,1 för z-riktningen 37. - För en kvantitativ morfologisk analys använder ett dataanalys program för neurofysiologi (se tabell på specifika material / utrustning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kopplade inspelningar är metoden för en fördjupad karaktärisering av morfologiskt identifierade uni- eller dubbelriktade synapsförbindelser samt gap junction (elektriska) anslutningar (Figur 1). Ett exempel på en hopparad inspelning i skiktet 4 av somatosensoriska fat cortex visas i figur 1A. Både enkelriktad retande och hämmande synapsförbindelser kan karakteriseras (Figur 1B, C). Dessutom parade inspelningar tillåter att spela in från dubbelriktade synapsförbindelser, dvs, från kopplingar där båda nervceller i ett par är pre- och postsynaptiska till varandra. Detta illustreras i figur 1D, som visar inspelningar från en hämmande interneuronen och en excitatorisk neuron. Framkalla en aktionspotential i den excitatoriska neuron (röda spår) resulterar i en EPSP i postsynaptiska hämmande interneuronen (svarta spår). Men när en aktionspotential är evoked i interneuronen, kan en IPSP vara införd i den excitatoriska neuron. Figur 1E visar att det också är möjligt att spela in från nervceller kopplade via gap junction eller via en lucka korsning och en kemisk synaps. Ömsesidiga och gap junction anslutningar kan endast identifieras genom parvis elektrofysiologiska inspelningar hittills men inte med någon annan teknik.
Kombinationen av biocytin fyllning av kopplade nervceller via fläckpipetten och elektrofysiologiska inspelningar medger en korrelation av morfologiska egenskaper hos nervceller till synaptiska egenskaper. Efter histokemiska bearbetnings nervceller syns som mörka strukturer i fixerade slice (Figur 2A). Därefter registreras neuronala cellparet kan rekonstrueras morfologiskt och neuronala celltyper kan identifieras. Dessutom är det möjligt att identifiera antalet och placeringen av förmodade synaptiska kontakter (Figur 2A höger sida och Figure 2B infälld). Neuron paret visas i figur 2B är ömsesidigt ansluten och därmed synaptiska kontakter etableras på båda nervceller. I våra händer, var förmodade, lätta mikroskopiskt identifierade synaptiska kontakter bekräftades som sanna synaptiska kontakter med elektronmikroskop med en 80-90% grad av exakthet 16,21,26.
Figur 3 visar ett exempel på en parad inspelning från en presynaptisk pyramidala neuron i hjärnbarkens skikt 6 av pipan cortex och en excitatoriska taggig neuron i lager 4. Detta translaminär neuronal mikrokrets har en låg anslutnings sannolikhet men kan identifieras med hjälp av sökning förfarande som beskrivs i steg 3.1.1 - 3.1.9 för neuronala anslutningar med låg anslutning. Med den parade inspelningsteknik är det möjligt att identifiera synapsförbindelser med en mycket låg anslutning som är fallet med vissa långväga translaminär anslutningar (detta exempel) eller kopplingar mellan neurons belägna i olika kortikala "kolumner" (interkolonn synapsförbindelser).
Figur 1. Kopplade inspelningar från synaptically kopplade cellparen. (A) Vänster, IR-DIC bild av en hjärna skiva. Höger, en interneuronen (överst) och en excitatoriska neuron (nederst). (B) En presynaptiska aktionspotential (överst) i en excitatoriska neuron framkallar en monosynaptic excitatoriska postsynaptiska potentialen (EPSP) i en annan excitatoriska neuron (nederst). (C) En aktionspotential (överst) i en presynaptisk hämmande interneuronen väcker en monosynaptic hämmande postsynaptisk potential (IPSP) i en excitatoriska neuron (nederst). (D) En aktionspotential (överst till vänster) i en presynaptisk excitatoriska neuron väcker en EPSP (nederst till vänster) i en hämmande interneuronen. I sin tur, en aktionspotentiali den inhiberande interneuronen (överst till höger) framkallar ett IPSP i den excitatoriska neuronen (nere till höger). (E) En serie av hyper- och depolariserande spänningssteg som framkallas av ström injektioner i en neuron (överst till vänster) återspeglas i ett gap-junction kopplat andra neuron (nederst till vänster). Dessutom en presynaptisk aktionspotential (överst till höger) i den första neuron väcker en tidig liten depolarisation (spikelet, infälld) följt av en sen djupt hyperpolarisation (IPSP) i membranpotentialen i den andra neuron (nere till höger). Skala barer i (B) gäller även (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Identifiering av synaptiska kontakter och morfologisk Reconstruktion av biocytin fyllda cellpar. (A) Vänster, låg effekt mikrofotografi av ett ömsesidigt kopplade cellparet omfattar en taggig stel och en snabbt tillsatta interneuronen i lager 4 som fylldes med biocytin under inspelning. Lätta mikroskopiskt identifierade förmodade excitatoriska synaptiska kontakter mellan presynaptiska taggig neuron och postsynaptiska interneuronen är markerade med gröna prickar. Förmodade ömsesidiga hämmande synaptiska kontakter anges med blå prickar. Höger, hög effekt bilder av synaptiska kontakter. Gröna öppna cirklar, excitatoriska kontakter; blå öppna cirklar, hämmande kontakter. Layer gränserna bestämdes genom cytoarchitectonic strukturen hos den färgade hjärnan skiva under det låga effekt mikroskop. (B) Neurolucida rekonstruktion av samma cell paret visas i (A) och figur 1C. Blå, interneuronen axon; rött, interneuronen soma och dendrit; grön, taggig neuron axon; vit, taggig neuron soma och dendrit. Den infälldavisar somatodendritiska fack pre- och postsynaptiska neuron tillsammans med de förmodade synaptiska kontakter. Barrel konturer identifierades i låg effekt ljus-fältmikrofotografier gjorda av den akuta hjärnan skiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. En företrädare synaptiska samband med mycket låg ratio anslutning. (A) En presynaptisk aktionspotential (överst) i ett skikt 6 pyramidal cell framkallar en monosynaptiska excitatorisk postsynaptisk potential (botten) i ett skikt 4 stjärna pyramidala neuron. Lägg märke till den långa latens (> 3,0 ms) i denna trans-laminära anslutning jämfört med den för lokala inom laminärt anslutningar (≈1.0 ms). (B) Postsynaptiska response av skikt 4 stjärnigt pyramidala neuron till två aktionspotentialer vid 10 Hz framkallade i ett skikt 6 pyramidala celler. Notera den kortsiktiga underlättande av denna förbindelse, jämfört med det kortsiktiga nedtryckning av lokala anslutningar (data visas ej). (C) Utökad fokaldjup avbildning av samma anslutning som i (A, B). Inset, den somato / dendritiska domän av ett skikt 4 stjärna pyramidala neuron. Notera förekomsten av en framstående apikal Dendrite markerad med en pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukos | 25 | 4,5 |
| NaHCOs 3 | 2,1 | |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 2 | 0,294 |
| MgCl2 | 1 | 0,095 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasades med 95% O2 och 5% CO2 | ||
Tabell 1. Artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för perfusion under inspelning.
| mM | g / L | |
| NaCl | 125 | 7,305 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukos | 25 | 4,5 |
| NaHCOs 3 | 25 | 2,1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 5 | 0,476 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Askorbinsyra (vitamin C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasades med 95% O2 och 5% CO2 | ||
Tabell 2. Extracellulär lösning för akut hjärnan skivor av omogna djur.
| mM | g / L | |
| Sackaros | 206 | 70,51 |
| KCl | 2,5 | 0,186 |
| Glukos | 25 | 4,5 |
| NaHCOs 3 | 25 | 2,1 |
| NaH 2 PO 4 | 1,25 | 0,173 |
| CaCl2 | 1 | 0,147 |
| MgCl2 | 3 | 0,286 |
| Myo-inositol | 3 | 0,54 |
| Na-pyruvat | 2 | 0,22 |
| Askorbinsyra (vitamin C) | 0,4 | 0,07 |
| Osmolaritet ~ 310 mOsmol / L | ||
| Gasades med 95% O2 och 5% CO2 | ||
Tabell 3. Extracellulärt lösning för akut hjärnan skivor av vuxna djur (sucrose saltlösning).
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| K-glukonat | 135 | 31,622 | 1,5811 |
| KCl | 4 | 0,298 | 0,0149 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2 + | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Justera pH till 7,3 med KOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
| Sätt 3 - 5 mg / ml biocytin | |||
Tabell 4. Låg klorid pipett lösning.
| mM | g / L | g / 50 ml | |
| Na-glukonat | 105 | 22,92 | 1,146 |
| NaCl | 30 | 1,76 | 0,088 |
| HEPES | 10 | 2.384 | 0,1192 |
| Fosfokreatin | 10 | 2,552 | 0,1276 |
| ATP-Mg2 + | 4 | 2,028 | 0,1014 |
| GTP-Na | 0,3 | 0,156 | 0,0078 |
| Justera pH till 7,3 med NaOH | |||
| Osmolaritet ~ 300 mOsmol / L | |||
Tabell 5. Hög Napipett lösning för sökning synaptically kopplade nervceller.
| förhållande | ml | |
| reagens A | 1 | 0,15 |
| reagens B | 1 | 0,15 |
| 10% Triton X 100 | 1 | 0,15 |
| 0,1 M fosfatbuffert | 97 | 14,55 |
| Hålls för 30 minuter i mörker före användning | ||
Tabell 6. ABC-lösning för histokemisk reaktion.
| vikt | volym | |
| 3-3'-diaminobensidin | 10 mg | - |
| 0,1 M fosfatbuffert | - | 20 ml |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 | - | 5-10 | il |
| 1% CoCl2 | - | 5 pl |
| 1% (NH4) 2 Ni (SO 4) 2 och 1% CoCl2 tillsättes droppe för droppe under omrörning av lösningen. | ||
Tabell 7. Lösning för Diaminobenzidin (DAB) reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kopplade inspelningar från synaptically kopplade retande och / eller hämmande nervceller är en mycket mångsidig strategi för studier av neuronala mikrokretsar. Inte bara denna metod tillåter en att uppskatta synaptiska anslutningar mellan neuron typer men också tillåter att bestämma de funktionella egenskaperna hos anslutningen och morfologi pre- och postsynaptiska neuroner. Vidare kan agonist och / eller antagonist lätt appliceras på neuroner i slice preparat. Detta gör att man kan studera effekterna av neuromodulators på egenskaperna hos synaptisk transmission 32 eller en fördjupad karaktärisering av en definierad enhetlig synaptisk anslutning med, till exempel, quantal analys av synaptisk frisättning 16,17,38,39. Konstaterande av kemiska och / eller elektrisk (gap junction) synapsförbindelser är det mest kritiska steget i detta protokoll. Vi har därför listat olika metoder för att hitta synapsförbindelser, beroende på förhållandet uppkoppling och desstyp (kemisk / elektrisk).
En stor nackdel med slice förberedelser är ofta betydande trunkering av långväga axonal prognoser så att endast små delar av den totala axonal längd axonet återvinns. För vissa pyramidala celltyper, graden av trunke kunde upp till 90% eller ännu mer när man tar utsprång till andra kortikala områden eller subkortikala regioner beaktas. Detta gör skiva beredning olämpliga för studier av synaptiska kopplingar mellan nervceller cellorgan som är mer än> 300 um isär. Men i akuta slice förberedelser, lokala axonal prognoser, särskilt de lokala interneuronen allmänhet återvinnas med en relativt låg grad av dendritiska och axonal trunke (~ 10% eller mindre) på grund av den begränsade horisontella och vertikalt fält span sina axonal hållare . Anslutningar omfattar dessa typer av neuroner kan därför karakteriseras med en hög grad av noggrannhet och reliabbilitet och ger i stort sett korrekta anslutnings uppskattningar. Med undantag för dessa lokala synapsförbindelser, absoluta värden för anslutningsförhållanden mellan två neuron typer erhållits i slice preparat är mycket problematiskt, särskilt för nervceller med stora inter somatiska sträckor som i translaminär eller icke-lokala, långväga intralaminära synapsförbindelser . Detta problem förvärras när skivningsförhållanden inte har optimerats för en given synaptisk anslutning vid en definierad ålder. För mer realistiska anslutnings uppskattade nya metoder såsom tät elektronmikroskopiska rekonstruktioner 40 och strukturell axo-dendritiska överlappning 41 har utvecklats. Även dessa tekniker dock måste ta hänsyn till den stora mångfalden av hämmande intern och även excitatoriska nervceller.
Ett ytterligare problem med uppskattningar anslutnings är att distala synaptiska kontakter, t.ex. de på apikala tofs av pyramidala nervceller, kanundgå upptäckt. Mätt på soma amplituden av deras synaptiska respons är mycket liten och kommer sannolikt att försvinna i bruset (Qi et al., 2014, i underkastelse). Men denna typ av problem inte begränsad till den parade inspelningen tillvägagångssätt men kommer också att uppträda med andra tekniker som används för att studera synaptisk anslutning.
Under senare år Ijusinducerad aktivering av neuronala mikrokretsar (dvs, genom foto frisättning av bur glutamat eller genom aktivering av channelrhodopsin) har använts för att undersöka nervkopplingar, även på en större skala 42-52. Men det är med dessa optiska metoder inte är möjligt att identifiera de strukturella egenskaperna hos den presynaptiska neuron typen. Dessutom kan antalet och placeringen av synaptiska kontakter som upprättats av en neuronal anslutningen inte identifieras, åtminstone inte hittills. Kopplade inspelningar, å andra sidan, tillåter karakterisering av både pre- och postsynaptiska neurpå typerna i en synaptisk mikrokrets. Detta är särskilt viktigt eftersom många studier har visat att både GABAerga interneuronen och excitatoriska nervceller är mycket varierande med avseende på deras morfologi och synaptisk fysiologi 53-56. Således är identifieringen av både pre-och postsynaptiska neuroner en förutsättning för en beskrivning av en synaptisk anslutning 57. Slutligen parade inspelningar tillåta registrering av olika konfigurationer av synaptisk anslutning (ömsesidiga förbindelser, samexisterar kanalforbindelser och kemiska synapser). Därför kommer den parade inspelningsteknik förbli en viktig metod för att studera neuronala mikrokretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2 - 3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
