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Neuroscience

स्टेम नेटवर्क संस्कृतियों में जैविक neurotoxins के कार्यात्मक मूल्यांकन केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र न्यूरॉन्स सेल व्युत्पन्न

Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Research Division, Cellular Molecular Biology Branch, United States Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Abstract

Presynaptically लक्षित clostridial न्यूरोटोक्सिन (CNTs) के चिकित्सीय और यंत्रवत अध्ययनों से कार्य synapses के उत्पादन और नशा करने के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं से होकर गुजरती है कि एक स्केलेबल, सेल आधारित मॉडल के लिए जरूरत से सीमित किया गया है। यहाँ हम कुशलतापूर्वक synaptically सक्रिय, नेटवर्क न्यूरॉन्स की परिभाषित प्रजातियों में murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) को अलग करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि का वर्णन। एक 8 दिन भेदभाव प्रोटोकॉल के बाद, माउस भ्रूणीय स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (ESNs) तेजी, एक्सप्रेस और neurotypic प्रोटीन compartmentalize न्यूरोनल morphologies फार्म और आंतरिक विद्युत प्रतिक्रियाओं का विकास। निरोधात्मक संतुलन: भेदभाव के बाद 18 दिनों (DIV 18) करके, ESNs सक्रिय glutamatergic और γ aminobutyric एसिड (गाबा) ergic synapses और एक उत्तेजक द्वारा विशेषता आकस्मिक नेटवर्क व्यवहार दिखा रहे हैं। CNTs साथ नशा कार्यात्मक जिससे वें नकल, अन्तर्ग्रथनी neurotransmission antagonizes कि क्या यह निर्धारित करने के लिएई में बोटुलिज़्म या टिटनेस के नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार है कि pathophysiology, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी टिटनेस न्यूरोटॉक्सिन (तम्बू) या बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन से अवगत कराया ESNs में सहज लघु उत्तेजक बाद synaptic धाराओं (mEPSCs) (BoNT) यों के लिए इस्तेमाल किया गया था विवो सीरमप्रकारों / ए / जी। सभी मामलों में, ESNs 20 घंटा के भीतर synaptic गतिविधि के पास पूरा नुकसान का प्रदर्शन किया। अपरिवर्तित आराम झिल्ली क्षमता और आंतरिक विद्युत प्रतिक्रियाओं द्वारा प्रदर्शन के रूप में नशे में धुत्त न्यूरॉन्स, व्यवहार्य बने रहे। आगे इस दृष्टिकोण की संवेदनशीलता को चिह्नित करने के लिए, synaptic गतिविधि पर नशे की खुराक पर निर्भर प्रभाव BoNT / एक के बाद इसके अलावा 20 घंटा मापा गया। 0,005 बजे BoNT / ए के साथ नशा 0.013 प्रधानमंत्री के एक औसत निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) के साथ, mEPSCs में एक महत्वपूर्ण घटती में हुई। मंझला खुराक की तुलना अन्तर्ग्रथनी निषेध के कार्यात्मक माप तेज, और अधिक विशिष्ट और जाल की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं कि संकेत मिलता हैदरार assays के या माउस मारक परख। इन आंकड़ों CNTs की अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील पता लगाने के लिए synaptically युग्मित, स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपयोग के लिए मान्य है।

Introduction

इस विधि के समग्र लक्ष्य कार्यात्मक clostridial न्यूरोटोक्सिन उजागर करने के लिए स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के नेटवर्क संस्कृतियों में synaptic गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए है। यह कार्यात्मक बोटुलिज़्म के नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार pathophysiologies replicates और CNTs, चिकित्सकीय जांच और यंत्रवत अध्ययनों का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त मॉडल के रूप में ESNs पुष्टि की है कि इन विट्रो व्युत्पन्न मॉडल का पहला प्रदर्शन है।

BoNTs क्लोस्ट्रीडियम प्रजाति के सदस्यों द्वारा उत्पादित अत्यधिक घातक जीवाणु न्यूरोटोक्सिन हैं। हाल ही में प्रस्तावित BoNT / एच सहित आठ antigenically अलग BoNT सीरमप्रकारों (/ ए / एच) 1,2 वर्णित किया गया है। सभी सीरमप्रकारों हैं कि 150 केडीए पेप्टाइड्स के रूप में व्यक्त कर रहे हैं के बाद translationally एक डाइसल्फ़ाइड बंधन 3 से जुड़े एक 100 केडीए भारी श्रृंखला (एचसी) से बना एक dichain और एक 50 केडीए प्रकाश श्रृंखला (नियंत्रण रेखा) का उत्पादन करने के लिए nicked। कोर्ट प्रीसानेप्टिक रिसेप्टर्स और ईएनटी के लिए बाध्य mediatesअन्तर्ग्रथनी endocytosis के माध्यम से न्यूरॉन में विष की RY। Endosomal प्रसंस्करण के दौरान, कोर्ट प्रीसानेप्टिक साइटोसॉल में नियंत्रण रेखा के स्थानान्तरण की सुविधा पुटिका झिल्ली में एक ताकना फार्म करने के लिए संरचनात्मक पुनर्गठन आए। नियंत्रण रेखा तो विशेष रूप से लक्ष्य और प्रीसानेप्टिक डिब्बे में cleaves घुलनशील एन -ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील संलयन लगाव प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन: स्नैप-25 (BoNT / ए, सी /, / ई), VAMP2 (BoNT / बी / डी, / एफ, / जी) या syntaxin (BoNT / सी) 1। इन जाल प्रोटीन में से किसी की दरार जिससे न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज अवरुद्ध, अन्तर्ग्रथनी एक्सोसाइटोसिस मशीनरी की विधानसभा से बचाता है। कुशल न्यूरोनल लक्ष्यीकरण और प्रीसानेप्टिक स्थानीयकरण के इस संयोजन का सबसे खतरनाक जहर 0.1 के रूप में के रूप में कम अनुमानित मानव घातक खुराक के साथ, ज्ञात BoNTs renders - 1 एनजी / 1 किलो।

जैव रासायनिक assays उच्च संवेदनशीलता के साथ CNT के साख पत्र की उपस्थिति या गतिविधि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इन तरीकों मैं करने में विफल, बाँध दर्ज करने के लिए विष की क्षमता nterrogate, सक्रिय करने और न्यूरॉन्स के भीतर समारोह है, और इसलिए सक्रिय विष की उपस्थिति के अप्रत्यक्ष और संभवतः गुमराह करने के उपाय कर रहे हैं। इसके विपरीत, इस तरह के माउस मारक परख (विधायक) के रूप में नशे की कार्यात्मक assays के व्यापक विष गतिविधि के अधिक प्रासंगिक और विशिष्ट आकलन उपलब्ध कराने, सफलतापूर्वक तेज और सक्रियण के सभी चरणों के लिए बातचीत करने के लिए CNTs की क्षमता का मूल्यांकन। विधायक BoNT का पता लगाने के सोने के मानक है, यह एक अंत बिंदु के रूप में मौत का उपयोग करता है कि एक Vivo में विधि है और इसलिए एक अनुसंधान मंच के रूप में सीमित उपयोगिता है। यंत्रवत अध्ययन और चिकित्सकीय जांच के लिए उपयुक्त CNT के नशे की सेल आधारित मॉडल को विकसित करने के प्रयास भी महत्वपूर्ण सीमाओं का सामना करना पड़ा है। प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों शारीरिक प्रासंगिकता के एक उच्च डिग्री प्रदान करते हैं, वहीं उनके उपयोग उच्च संसाधन लागत अपेक्षाकृत कम उपज, कई न्यूरोनल उप की उपस्थिति सहित कारकों की एक संख्या से जटिल हैप्रकार और पशु उपयोग के साथ शामिल व्यापक विनियामक और प्रशासनिक निरीक्षण। प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए एक विकल्प के रूप में, इस तरह के neuroblastomas और अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं के रूप में (रासायनिक उत्तेजना से न्यूरॉन-जैसे गुणों को अपनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है) तंत्रिकाजन्य सेल लाइनों नशे की इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इन कोशिकाओं प्रेरण करने से पहले लगातार सुसंस्कृत हैं, वे उच्च स्केलेबल और मध्यम throughput के दृष्टिकोण के लिए इसलिए अच्छी तरह से अनुकूल है। प्रेरित phenotypes, आम तौर पर विषम हैं CNTs को खराब प्रति संवेदनशील हैं और कामकाज synapses के चार में इकट्ठा कि पूर्व और बाद synaptic डिब्बों के लिए फार्म असमर्थता सहित महत्वपूर्ण न्यूरोनल व्यवहार, प्रदर्शन करने में विफल रहता है के बाद से हालांकि, उनकी प्रासंगिकता संदिग्ध है। Physiologically बरकरार प्रीसानेप्टिक डिब्बों के अभाव में विष की पूरी रेंज: न्यूरॉन बातचीत नहीं दोहराया जा सकता है और नशे की इसलिए कार्यात्मक माप 5 संभव नहीं हैं। नाटी हैरत की बात है, यंत्रवत पढ़ाई या प्रेरित तंत्रिकाजन्य सेल लाइनों का उपयोग BoNTs के लिए दवा स्क्रीनिंग में विवो और प्राथमिक न्यूरॉन पढ़ाई 6 के साथ असंगत हैं कि निष्कर्षों में हुई है संचालन करने के लिए प्रयास करता है।

यह सेल व्युत्पन्न केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स सुसंस्कृत सेल लाइनों 7-10 के लचीलेपन के साथ प्राथमिक न्यूरॉन्स की प्रासंगिकता को जोड़ती है कि BoNT अनुसंधान के लिए एक अगली पीढ़ी के सेल आधारित मंच प्रदान कर सकता है कि स्टेम प्रस्ताव किया गया है। विशेष रूप से, माउस स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (ESNs) BoNT / ए / जी के शारीरिक खुराक के लिए अत्यधिक संवेदनशील होने के लिए और अंतर persistences, गतिविधि-बढ़ाया नशा है, और सीरोटाइप सहित नशा करने विवो प्रतिक्रियाओं में कई दोहराने के लिए पाया गया है -specific potencies 5,8,11। इन कार्यों BoNT तेज, प्रसंस्करण, तस्करी और गतिविधि की विवो तंत्र में ESNs में संरक्षित कर रहे हैं कि सुझाव देते हैं। अन्तर्ग्रथनी activit का हालांकि, निषेधY बोटुलिज़्म के हस्ताक्षर अभिव्यक्ति है, और इसलिए CNTs द्वारा नशा निम्नलिखित synaptic गतिविधि का एक नुकसान का प्रदर्शन ESNs CNT के अध्ययन के लिए इन विट्रो व्युत्पन्न सेल आधारित मॉडल में एक उपयुक्त हैं कि समापन करने से पहले आवश्यक है।

Synaptic गतिविधि पर CNTs के साथ नशे के प्रभाव को मापने के लिए, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी वाहन का इलाज या CNT के इलाज DIV के 21 + ESNs में monosynaptic धाराओं यों के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम BoNT / ए / जी या तम्बू के साथ ESNs की है कि नशे के सभी मामलों में 20 घंटा के भीतर synaptic गतिविधि के> 95% नुकसान का कारण बना पाया। BoNT / ए 0,005 बजे से नीचे का पता लगाने की एक सीमा होती है और 0.013 बजे एक आईसी 50 मूल्य के साथ, synaptic गतिविधि पर एक खुराक पर निर्भर प्रभाव से पता चला है के साथ आगे लक्षण वर्णन नशा के बाद 20 घंटा का आयोजन किया। इन निष्कर्षों को नशे की electrophysiological पता लगाने की संवेदनशीलता और समय सीमा के काफी तुलनीय immunoblot आधारित एना अधिक सुधार कर रहे हैं संकेत मिलता है किsynaptically सक्रिय न्यूरॉन संस्कृतियों में नशे की कार्यात्मक माप अधिक संवेदनशील, विशिष्ट और तेजी से तरीकों को सुविधा हो सकती है कि प्रदर्शन तस्वीर 25 दरार की और इन विवो माउस मारक assays में lyses, BoNT के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया चिह्नित करने के लिए।

Protocol

ESCs के 1. अनुकूलन सेल मुक्त निलंबन संस्कृति फीडर को

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना ESCs बर्फ की एक मुट्ठी भर लोगों रहता है जब तक।
  2. 10 6 पूर्व गर्म ईएससी माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त एक गैर टिशू कल्चर इलाज पकवान ESCs अलग एक्स 2.5 - एक P1000 pipet का प्रयोग, धीरे 1 हस्तांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
  3. 20 घंटे के बाद, धीरे से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब निलंबन संस्कृति स्थानांतरित द्वारा कोशिकाओं को धो लें। 200 x जी पर 3 मिनट के लिए गोली ESCs। स्पिन के दौरान, कम आसंजन पकवान वापस करने के लिए नए सिरे से ईएससी माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, ख्याल रख रही सेल गोली dislodging से बचने के लिए, और 1 मिलीलीटर गोली सेल ताजा ईएससी मध्यम जोड़ने के लिए। एक P1000 pipet का उपयोग बैक्टीरियल पकवान कोशिकाओं स्थानांतरण और इनक्यूबेटर में लौटने।
  5. समुच्चय नग्न आंखों (आमतौर पर 4 से दृष्टिगोचर हो जब तक दैनिक कोशिकाओं का पालन - 8 दिन (घ); समुच्चय 0.2 हो जाएगा- 0.5 मिमी)। समुच्चय 4 घ के बाद स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, 1.3 चरण दोहराएँ। समुच्चय दिखाई दे रहे हैं एक बार, अलग कर देना और धारा 2 में वर्णित के रूप में ESCs बनाए रखें।

2. ईएससी Passaging और रखरखाव

  1. ईएससी एक 15 मिलीलीटर के लिए एक बाँझ 10 मिलीलीटर pipet का उपयोग शंक्वाकार ट्यूब समुच्चय स्थानांतरण और समुच्चय एक कॉम्पैक्ट गोली को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं (आमतौर पर 3-5 मिनट)। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, सावधान किया जा रहा सेल गोली में खलल न डालें बचने के लिए और 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ समुच्चय धोने के लिए। गुरुत्वाकर्षण निपटाने 2.5 मिनट के लिए 100 XG पर, वैकल्पिक रूप से गोली कोशिकाओं की सिफारिश की है हालांकि बजाय समय बचाने के लिए।
  2. महाप्राण पीबीएस और 500 μl trypsin जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 3 मिनट के लिए trypsin में समुच्चय सेते हैं। ट्रिप्सिन पतला और धीरे समुच्चय को तोड़ने के लिए एक P1000 pipet के साथ 10 बार triturate के लिए 500 μl ईएससी मध्यम जोड़ें। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  3. गोली 1.0 की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 200 XG और resuspend कोशिकाओं में तीन मिनट के लिए कोशिकाओं dissociatedईएससी माध्यम में 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल। स्थानांतरण 150 एक 10 सेमी जीवाणु डिश में ताजा ईएससी माध्यम के 10 मिलीलीटर μl (1.5 x 10 6 कोशिकाओं) और 48 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में लौटने। 10% DMSO के, या त्याग के साथ पूरक 90% ईएससी माध्यम में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल - अतिरिक्त ESCs 1 पर cryopreserved, भेदभाव किया जा सकता है।
  4. पैसेज हर 48 घंटा समुच्चय। पारित होने के लिए तैयार समुच्चय 0.5 मिमी से अधिक व्यास के साथ, स्पष्ट रूप से दिखाई जाएगी।
    नोट: - 1.4 cryopreserved, निलंबन-रूपांतरित कोशिकाओं के विगलन और संस्कृति चरणों 1.2 प्रति पूरा कर रहे हैं। 72 घंटा - समुच्चय 48 भीतर passaging के लिए तैयार हो जाएगा।

3. neuronal भेदभाव

नोट: - दोपहर के बाद पूर्व दोपहर को 3.5 और कदम 3.7 आचार 3.1 कदम। भेदभाव प्रक्रियाओं का अवलोकन चित्रा 1 ए में प्रस्तुत किया है।

  1. 2.5 - चरणों 2.1 में के रूप में ESCs अलग कर देना। अलग कर देना का स्थानांतरण 350 μl (3.5 एक्स 10 6)25 एमएल भेदभाव मध्यम युक्त एक 10 सेमी कम लगाव पकवान डी ESCs। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर अंदर 45 RPM - 30 के लिए सेट एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रखें। इस भेदभाव के पहले दिन, इन विट्रो (DIV) में कहा जाता दिन है -8।
    ध्यान दें: एक अल्ट्रा कम लगाव पकवान का उपयोग विधि की लागत बढ़ जाती है, लेकिन समुच्चय कभी कभी पेट्री डिश का पालन कर सकते बाद से बैक्टीरियल पेट्री डिश तुलना में थोड़ा बड़ा पैदावार पैदा करता है। विभिन्न पकवान आकार पसंद कर रहे हैं, मध्यम मात्रा और सेल नंबर तदनुसार बढ़ाया जा सकता है।
  2. 48 घंटा (DIV -6) के बाद, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब फर्क सेल समुच्चय हस्तांतरण करने के लिए एक 25 मिलीलीटर pipet का उपयोग करें। इसके तत्काल बाद पेट्री डिश के लिए भेदभाव माध्यम की एक ताजा 25 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. 2 मिमी गहरी - 1 है कि एक दृश्य गोली उत्पादन, 5 मिनट - समुच्चय 2 से अधिक व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। निलंबन में शेष एकल कक्षों या छोटे समुच्चय पर ध्यान न दें। ध्यान से मध्यम महाप्राण और सीई हस्तांतरणडालूँगा वापस एक P1000 का उपयोग कर पेट्री डिश के लिए गोली। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रोटरी प्रकार के बरतन पर रखें।
  4. DIV -4 दोहराने कदम 3.2। 4 मिमी गहरी - गोली 2 हो जाएगा। पेट्री डिश के लिए 6 माइक्रोन सब-पार retinoic एसिड (आरए) के साथ पूरक 30 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम बदलें। एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रोटरी प्रकार के बरतन पर लौटें।
  5. DIV -2 दोहराने कदम 3.3 से कम। इस बिंदु पर गहरी 8 मिमी - गोली 4 हो जाएगा।
  6. DIV के -1, धारा 4 के रूप में चढ़ाना सतहों तैयार करते हैं।
  7. एक टिशू कल्चर हुड में 10 मिनट और जगह - DIV के शून्य में, 5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर aliquoted-पूर्व और जमे हुए एनपीसी trypsinization के माध्यम के 5 मिलीलीटर पिघलना। स्थानांतरण एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब समुच्चय फर्क, एक 25 मिलीलीटर pipet का प्रयोग। समुच्चय बसा है और ध्यान से महाप्राण मध्यम करने की अनुमति दें। धो समुच्चय washes के बीच व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है, 10 एमएल पीबीएस के साथ दो बार गोली।
  8. दूसरा पीबीएस धोने के बाद, गोली के लिए एनपीसी trypsinization के माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ने और 37 पर सेते6, 5 मिनट के लिए सी। धीरे 2.5 मिनट के बाद ट्यूब झटका।
  9. ट्रिप्सिन निष्क्रिय और inverting द्वारा मिश्रण करने के लिए 0.1% सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला (एसटीआई) के 5 मिलीलीटर जोड़ें। एक अपेक्षाकृत समरूप सेल निलंबन का उत्पादन किया है, जब तक एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet के साथ 15 बार - धीरे 10 triturate।
  10. धीरे-धीरे एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष में रखा एक 40 माइक्रोन या 70 माइक्रोन सेल झरनी के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण। सभी निलंबन फ़िल्टर कर दिया गया है, फिल्टर के माध्यम से शेष कोशिकाओं को धोने और 200 x जी पर छह मिनट के लिए अलग सेल निलंबन गोली एन 2 मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  11. गोली परेशान बिना महाप्राण मध्यम। 200 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं pelleting और एक P1000 के साथ washes के बीच triturating, 10 एमएल एन 2 मध्यम के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। दूसरे धोने से पहले, एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  12. / 2 सेमी 200,000 कोशिकाओं - 150000 के एक सेल घनत्व पर मिलीलीटर और प्लेट ESNs प्रति एक 10 x 7 कोशिकाओं में एन 2 मध्यम में Resuspend कोशिकाओं।
  13. नव बेनी स्थानांतरणएक humidified 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर और 5% सीओ 2 के लिए एड ESNs और धारा 5 के रूप में बनाए रखने के लिए।

DIV के शून्य पर चढ़ाना तंत्रिका व्यापारियों के लिए संस्कृति सतहों की तैयारी 4.

  1. चढ़ाना करने के लिए कम से कम एक दिन पूर्व टिशू कल्चर इलाज व्यंजन तैयार करते हैं। (पी; बाँझ एच 2 ओ में 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) पर्याप्त polyethyleneimine जोड़ें या पाली-डी-लाइसिन (पीडीएल, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / बाँझ एच 2 ओ में) में हे / एन प्लास्टिक के बर्तन ऊतक संस्कृति इलाज को कवर किया और सेते 37 डिग्री सेल्सियस।
  2. चढ़ाना की सुबह, डबल आसुत एच 2 ओ के साथ दो बार बर्तन धोने और एक बार पीबीएस के साथ। अंतिम धोने के बाद, पकवान कवर करने के लिए पर्याप्त एन 2 मध्यम जोड़ने (उदाहरण के लिए, एक 12 अच्छी तरह से पकवान के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर या 6 सेमी पकवान प्रति 4 मिलीलीटर)।
  3. कम से कम एक दिन पूर्व न्यूरॉन चढ़ाना के लिए 18 मिमी कांच coverslips तैयार करें। प्लाज्मा-सफाई 4 मिनट के लिए साफ coverslips।
  4. इसके तत्काल बाद एक के तल में एक इथेनॉल धोया parafilm के लिए साफ coverslips के हस्तांतरणबड़े बाँझ पकवान और कदम 4.1 में तैयार के रूप में पी या पीडीएल समाधान के 400 μl, जोड़ें। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  5. सुबह में, धोने के पानी के साथ तीन बार coverslips और 1 के लिए पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल laminin जोड़ - 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा। पहले न्यूरॉन्स अलग कर लिए, laminin के महाप्राण और तुरंत सामना करना पड़ रहा इलाज किया पक्ष रखने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है एनपीसी माध्यम से 1 मिलीलीटर, जिसमें एक 12 अच्छी तरह से पकवान की एक अच्छी तरह से करने के लिए coverslip के हस्तांतरण।
  6. स्टोर व्यंजन और 37 डिग्री सेल्सियस पर coverslips के NPCs के थाली करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक।

न्यूरॉन्स की 5. रखरखाव

  1. और div 1, महाप्राण मध्यम पर एन 2 मध्यम संस्कृति के साथ बदलें।
  2. और div 2 और 4, महाप्राण मध्यम पर B27 मध्यम संस्कृति के साथ बदलें।
  3. DIV के आठ में, महाप्राण मध्यम और B27 संस्कृति के माध्यम से युक्त mitotic inhibitors के साथ की जगह गैर neuronal कोशिकाओं contaminating खत्म करने के लिए।
  4. DIV के 12, B27 मध्यम संस्कृति के साथ बदलें।
  5. DIV के न निकालेंतैयार है जब तक 5% सीओ 2 से 12 ESNs उपयोग करने के लिए।

लघु उत्तेजक बाद synaptic धाराओं बढ़ाता के लिए synaptic प्रसारण (धुंध) परख की 6. मापा निषेध

चेतावनी: - 1 एनजी / किलो Clostridial न्यूरोटोक्सिन 0.1 के रूप में के रूप में कम अनुमानित मानव एलडी 50 मूल्यों के साथ जाना जाता है सबसे जहरीला पदार्थ, कर रहे हैं। इन विषाक्त पदार्थों का उपयोग करने और उचित सावधानियों का उपयोग करने से पहले आवश्यक अनुमोदन प्राप्त करते हैं।

  1. ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए वांछित अंतिम ESN संस्कृति के माध्यम में एकाग्रता और गर्म 100x के लिए BoNT / एक पतला। 21 + ESN संस्कृतियों div संस्कृति पकवान ज़ुल्फ़, और इनक्यूबेटर पर लौटने के लिए विष का उचित मात्रा में जोड़ें।
  2. कोशिकाओं नशा के बाद अधिक से अधिक 4 घंटा विश्लेषण किया जाएगा, तो इस तरह के सीधे इनक्यूबेटर में के रूप में या एक निरंतर सीओ 2 चैम्बर में, 5% सीओ 2 से हटाने के बिना पकवान और चक्कर आने के लिए विष जोड़ें।
  3. उचित समय बिंदु पर, ASPIRAते ESN संस्कृति के माध्यम से और बाह्य रिकॉर्डिंग बफर (ERB) के साथ दो बार धो लें। ERB की जोड़ें 4 मिलीलीटर क्रमश: कार्रवाई क्षमता अवरुद्ध और GABA एक रिसेप्टर गतिविधि नाराज, 5.0 माइक्रोन tetrodotoxin और 10 माइक्रोन bicuculline के साथ पूरक।
  4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तैयार करने के लिए पकवान स्थानांतरण। न तो छिड़काव न ही तापमान नियंत्रण धुंध परख के लिए आवश्यक है।
  5. प्रतिरोध के 5-10 mΩ के साथ एक रिकॉर्डिंग पिपेट उत्पादन और intracellular रिकॉर्डिंग बफर के साथ भरने के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग borosilicate ग्लास खींचो। धीरे पूर्व रिकॉर्डिंग करने के लिए अभिकर्मक siliconizing में भरा रिकॉर्डिंग पिपेट डुबकी।
  6. रिकॉर्डिंग पिपेट ERB में उतारा है के रूप में हवा से भरा सिरिंज का प्रयोग, सकारात्मक दबाव प्रदान करते हैं। धीरे दर्ज किया जा न्यूरॉन सोमा पर रिकॉर्डिंग पिपेट लैंडिंग के बाद, सकारात्मक दबाव को हटाने और एक gigaseal के रूप में। एम वी -70 पकड़े वोल्टेज कम होती है। ध्यान से पूरे सेल विन्यास में तोड़ने के लिए नकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  7. पर नजर रखने और झिल्ली क्षमता आराम रिकॉर्ड करने के लिए वर्तमान दबाना करने के लिए स्विच करें। तरल जंक्शन क्षमता के लिए समायोजन के बिना, आराम झिल्ली क्षमता -82 के लिए -67 के बीच एम वी किया जाएगा।
  8. लघु उत्तेजक बाद synaptic धाराओं (mEPSCs) का पता लगाने के लिए 5 मिनट - 4 के लिए एक सतत -70 एम वी वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते हैं।
  9. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कील खोज सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर mEPSC का पता लगाने के लिए दर्ज आंकड़ों के चार मिनट का विश्लेषण करें: थ्रेसहोल्ड, 5; अवधि एक स्थानीय अधिकतम खोज करने के लिए, 10,000 μsec; आधारभूत के लिए एक चोटी से पहले समय, 5000 μsec; अवधि एक क्षय समय खोज करने के लिए, 20,000 μsec; चोटी के अंश, 0.37 एक क्षय समय मिल करने के लिए; अवधि एक आधारभूत औसत करने के लिए, 1000 μsec; क्षेत्र दहलीज, 20; औसत शिखर, एक के अंक की संख्या; चोटी की दिशा, नकारात्मक।
  10. लीजिए और पता चला की घटनाओं के बारे में जानकारी को बचाने के। हर्ट्ज में mEPSC आवृत्ति निर्धारित करने के लिए 240 से 4 मिनट में पता चला की घटनाओं की संख्या फूट डालो।
  11. 12 शेष भाग - 8 के लिए mEPSC आवृत्तियों लीजिएrols और 8 - प्रत्येक जोखिम हालत के लिए 12 BoNT इलाज नमूने हैं। उम्र और बहुत-मिलान नियंत्रण के खिलाफ आवृत्ति का विश्लेषण करें। एक तरह से एनोवा परीक्षण और Dunnett की पोस्ट-हॉक परीक्षण का उपयोग synaptic गतिविधि का% निषेध के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित।

Representative Results

हम (चित्रा 1 ए में विस्तृत) माउस ESCs से अत्यधिक शुद्ध स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की बड़ी मात्रा के आर्थिक उत्पादन 8,11 सक्षम बनाता है एक भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस विधि reproducibly परिभाषित प्रजातियों 12-14 के न्यूरॉन्स में निजी तौर पर उत्पन्न होता है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईएससी लाइनों अंतर करने के लिए वर्षों की अवधि में इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण तत्वों सेल मुक्त निलंबन संस्कृति फीडर के लिए ESCs के (1) अनुकूलन शामिल हैं; निलंबन संस्कृतियों के (2) उचित रखरखाव; रोटरी शर्तों के तहत और (3) भेदभाव। निलंबन संस्कृति के लिए संक्रमण नाटकीय रूप से समय और ईएससी रखरखाव की लागत कम कर देता है, और पूर्व भेदभाव करने के लिए फीडर कोशिकाओं को दूर करने की जरूरत obviates। निलंबन अनुकूलन के बाद, Oct3 / 4 अभिव्यक्ति (चित्रा 1 बी डी pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति को बदल नहीं है कि निलंबन अनुकूलन का संकेत है, कम से कम 30 मार्ग के माध्यम से संगत है 7 कोशिकाओं से अधिक एक बार ESCs neuronal भेदभाव के लिए उपयुक्त हैं। यह आमतौर पर निलंबन अनुकूलन के बाद दस अंश या पहले से निलंबन अनुकूलित थे कि ESCs के विगलन के बाद पांच मार्ग के भीतर होता है। समुच्चय फर्क मैकेनिकल रोटेशन में भी वृद्धि हुई न्यूरोनल उपज के लिए महत्वपूर्ण हो पाया था। एक रोटरी प्रकार के बरतन के अलावा कुल व्यवहार्यता बढ़ रही है और div 0 (चित्रा 1E) में तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) की उपज में एक ~ 300% वृद्धि के उत्पादन, सुपर कुल गठन का सफाया कर दिया।

एक ठेठ भेदभाव DIV में 3.5 एक्स 10 6 ESCs के साथ शुरू होता है -8 और जीवित रहते हैं और न्यूरॉन्स हो जाएगा लगभग 60% जिनमें से DIV के 0 में 115 X 10 6 NPCs, पैदा करता है। शेष 40% गैर neuronal कोशिकाओं शामिल है और काफी हद तक DIV के 0 के बीच सीरम अभाव से समाप्त हो जाते हैं - glia बने की छोटी संख्या mitotic INH के अलावा द्वारा हटाया जा सकता है 1.div से ibitors 2-4 या div 8 - 12. चढ़ाना घनत्व DIV के 0 में महत्वपूर्ण है; बहुत कम चढ़ाया न्यूरॉन्स 2 सप्ताह से परे नहीं बच जाएगा। चढ़ाना के दिनों के भीतर, विभेदित न्यूरॉन्स न्यूरोनल morphologies दिखा रहे हैं और इस तरह के somatodendritic मार्कर MAP2 और axonal मार्कर ताउ (2A चित्रा) के रूप में neurotypic प्रोटीन, compartmentalize। DIV के 14 synapsin -1 + puncta synapse गठन की विचारोत्तेजक axodendritic इंटरफेस है, कम से पहचाना जा सकता है। यह सात 8,11 div करने से पहले अन्तर्ग्रथनी मार्कर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ संगत है। Neuronal morphologies, DIV के 21 के माध्यम से परिपक्व, जिस पर समय संस्कृतियों विस्तृत axodendritic arbors और बड़े अन्तर्ग्रथनी puncta (2A चित्रा) का प्रदर्शन जारी है। उचित रूप से बनाए रखा है, तो ESNs चढ़ाना के बाद कम से कम चार सप्ताह के लिए व्यवहार्य और सक्रिय रहते हैं।

शाही सेना अनुक्रमण का उपयोग कर अनुदैर्ध्य अभिव्यक्ति की रूपरेखा न्यूरोनल विनिर्देश एक की रूपात्मक और प्रोटिओमिक सबूत पुष्टि11,15 परिपक्वता चाहते हैं। विकासात्मक प्रगति के प्रतिनिधि मार्करों Oct3 / 4, nestin, DCX, NeuN और KCC2 (चित्रा 2B) सहित मंच-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल, प्रदर्शन किया। DIV के शून्य से, ESNs MAP2 और ताऊ सहित न्यूरॉन विशिष्ट संरचनात्मक प्रोटीन की प्रचुर मात्रा प्रतियां व्यक्त किया। पिछले निष्कर्षों के साथ संगत, केवल दो न्यूरोनल उपप्रकार के लिए मार्कर मनाया गया: vGluT2 व्यक्त hindbrain / मध्यमस्तिष्क glutamatergic न्यूरॉन्स और GABAergic interneurons 8। तदनुसार, glutamatergic और GABAergic मार्करों की एक विस्तृत सरणी neurotransmitter रिहाई के लिए आवश्यक पूर्व synaptic जाल प्रोटीन सहित DIV के शून्य और div 7 के बीच अभिव्यक्ति में तेज बढ़ता है, का प्रदर्शन किया; बाद synaptic प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक स्नायुसंचारी रिसेप्टर्स; और मचान प्रोटीन बाद synaptic झिल्ली करने के लिए इन रिसेप्टर्स तार करने के लिए आवश्यक। न्यूरॉन्स DIV के द्वारा DIV के 14 और सहज लघु उत्तेजक बाद synaptic धाराओं से परिपक्व आंतरिक विद्युत विशेषताओं का प्रदर्शन16 16।

Synaptic प्रसारण (धुंध) परख के मापा निषेध synaptic गतिविधि पर नशे के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। नशे में धुत्त और वाहन का इलाज DIV के बीच 24 + ESNs mEPSC आवृत्तियों की तुलना करके, धुंध synaptic गतिविधि (चित्रा 3 ए) के कार्यात्मक निषेध पर आधारित नशे की मात्रात्मक और विशिष्ट माप प्रदान करता है। धुंध प्रत्येक विष के स्नान के बाद इसके अलावा 20 घंटा में ESNs में synaptic गतिविधि पर BoNT / ए / जी या तम्बू के प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विषाक्त पदार्थों के एक एकाग्रता के बराबर में जोड़ा गया था 10 गुना पहले से जाल प्रोटीन दरार 11 के immunoblot विश्लेषण द्वारा निर्धारित रूप में, चुनाव आयोग 50 मूल्य। सभी विषाक्त पदार्थों को वाहन का इलाज नियंत्रण के कम से कम 5% करने के लिए mEPSC आवृत्तियों कम कर दिया। अन्तर्ग्रथनी दरों में कटौती नशे में धुत्त ESNs समझौता किया जा रहा करने में सक्षम थे, के बाद से, मौत या बदल आंतरिक प्रतिक्रियाओं सेल के कारण नहीं थे दोहराया कार्रवाई क्षमता निकाल दियाऔर वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में झिल्ली क्षमता (चित्रा 3 बी, सी) आराम में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का प्रदर्शन किया।

CNTs, का पता लगाने और मंझला निरोधात्मक एकाग्रता की सीमा (आईसी 50) का पता लगाने के लिए मौजूदा तरीकों को धुंध की संवेदनशीलता की तुलना करने के ESNs को BoNT / एक के बाद इसके अलावा 20 घंटा निर्धारित किया गया है। के रूप में छोटे 0,005 रूप बजे BoNT / ए द्वारा नशा एक आईसी 50 0.013 प्रधानमंत्री के मूल्य और 12:05 (चित्रा -4 ए) के ऊपर synaptic गतिविधि का पूरा मुंह बंद करने के साथ, mEPSC आवृत्ति में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन किया। इस आईसी 50 मूल्य लगभग 0.5 माउस घातक इकाइयों / एमएल, कि धुंध का सुझाव संवेदनशील के रूप में दो बार और 2 के लिए BoNT / ए की उपस्थिति का पता लगाने में तेजी से विधायक की तुलना में चार गुना से मेल खाती है। तस्वीर-25 दरार की immunoblot माप धुंध लगभग अधिक संवेदनशील 30 गुना का संकेत है कि, 12:38 और 12:05 की एक न्यूनतम से detectable खुराक के एक चुनाव आयोग 50 मूल्य का उत्पादनcleaved जाल प्रोटीन (4B चित्रा) के immunoblot आधारित पता लगाने की तुलना में।

चित्र 1
चित्रा 1. सस्पेंशन अनुकूलित ESNs mitotically स्थिर रहेगा और pluripotency के मार्कर व्यक्त करते हैं। ईएससी रखरखाव और भेदभाव के (ए) योजनाबद्ध। retinoic एसिड (आरए) या ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) की उपस्थिति या अनुपस्थिति A + या द्वारा चिह्नित है -। प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए इन विट्रो (DIV) और शास्त्रीय विकास के चरणों (डी एस) में दिन के बीच एक तुलना में 17 प्रदान की जाती है। आर 1, डी 3 और C57BL / 6J ES सेल लाइनों के लिए (बी) के प्रसार दरों निलंबन संस्कृति के लिए संक्रमण के बाद पांच मार्ग द्वारा स्थिर। (सी) के आंकड़ों निलंबन संस्कृति में 25 अंश पर मापा आर 1, डी 3 और C57BL / 6J ES सेल लाइनों में Oct3 / 4 अभिव्यक्ति में कोई ठोस परिवर्तन का प्रदर्शन cytometry (प्रवाहएन = प्रत्येक के लिए 6)। (डी) मार्ग 5 और 30 (काला लाइन) के बीच मापा निलंबन अनुकूलित आर 1 ईएससी लाइन के लिए नियमित passaging के दौरान वास्तविक सेल पैदावार। कोई कोशिकाओं passaging के दौरान खारिज कर रहे हैं अगर सैद्धांतिक संचयी पैदावार भी (लाल रेखा) प्रस्तुत कर रहे हैं। (ई) स्थैतिक (बाएं) या रोटरी शर्तों (दाएं) के तहत उत्पादित DIV के शून्य समुच्चय के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। रोटरी शर्तों ढेर बिना गोलाकार समुच्चय का उत्पादन किया और (पी <0.001 छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग निर्धारित) एनपीसी तीन गुना पैदावार में वृद्धि हुई 11। * एक पी <0.05 इंगित करता है। यह आंकड़ा हबर्ड एट अल। 11 से संशोधित किया गया है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. रूपिम, जनसंपर्कन्यूरोनल विनिर्देश और परिपक्वता की oteomic और transcriptomic सबूत DIV के 7 से (ए) Immunocytochemistry -। DIV के 49 न्यूरोनल द्रुमायण और axodendritic इंटरफेस पर synaptic puncta के उपस्थिति को दर्शाता है। Axons ताउ (हरा) के साथ चिह्नित कर रहे हैं, डेन्ड्राइट MAP2 (लाल) के साथ चिह्नित कर रहे हैं, पूर्व synaptic डिब्बों synapsin (सफेद) के साथ चिह्नित कर रहे हैं, और नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं। (बी) के विकास के चरण-विशिष्ट अभिव्यक्ति का प्रदर्शन और neuronal उपप्रकार को निर्दिष्ट प्रतिनिधि जीन की अनुदैर्ध्य अभिव्यक्ति की रूपरेखा। सभी जीन टेप सेल प्रति टेप की अनुमानित संख्या के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ESNs के तहत। BoNT / एजी और तम्बू के संपर्क में जब synaptic गतिविधि के निषेध जाना (ए) ESNs से प्रतिनिधि निशान के स्नान के बाद इसके अलावा 20 घंटा एकत्र ~ 10 एक्स चुनाव आयोग BoNT / ए के 50 मूल्यों - / जी, तम्बू या वाहन। प्रत्येक न्यूरोटॉक्सिन नियंत्रण की तुलना में अधिक 95% द्वारा synaptic गतिविधि कम कर दिया। > एन, (बी) के नशे में न्यूरॉन्स (BoNT / A के लिए प्रदर्शन किया है, लेकिन सभी नशे में धुत्त संस्कृतियों में मनाया के रूप में) और (सी) सी (संभावित नकारात्मक विश्राम झिल्ली में कोई बदलाव नहीं प्रदर्शित की मौजूदा इंजेक्शन depolarizing के जवाब में दोहराया ए पी एस आग में सक्षम बने प्रत्येक उपचार के लिए 18)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
BoNT / में धुंध की संवेदनशीलता की चित्रा 4. निर्धारण एक इलाजESNs। (ए) BoNT / ए के स्नान के बाद इसके अलावा synaptic गतिविधि 20 घंटा की धुंध माप। प्रतिनिधि वोल्टेज दबाना ट्रेस खंडों BoNT / ए जोखिम (बाईं ओर) निम्नलिखित mEPSC आवृत्ति में कमी का प्रदर्शन किया। MEPSC आवृत्ति के quantitation (बार ग्राफ, दाईं ओर, एन नियंत्रण के लिए = 20; N = 11 - प्रत्येक खुराक के लिए 22) mEPSC आवृत्ति में एक खुराक पर निर्भर कमी की पुष्टि करता है। मंझला निरोधात्मक एकाग्रता एक चार पैरामीटर चर ढलान (> 0.91 आर 2) का उपयोग कर एक गैर रेखीय प्रतिगमन के फिट एक कम से कम वर्गों के साथ निर्धारित किया गया था। ESNs में धुंध से पता लगाने की सीमा नोट में कम से कम 0,005 बजे है। (बी) BoNT / तस्वीर-25 की दरार में ESNs परिणामों के एक नशा जेल गतिशीलता पारियों द्वारा कल्पना के रूप में (सही पर तस्वीर-25 दरार का एक बार ग्राफ दिखा मात्रा का ठहराव के साथ बाईं ओर एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा; एन = 4) । एक समापन बिंदु के रूप में जाल प्रोटीन दरार (स्नैप-25) का उपयोग कमी हुई संवेदनशीलता नोट (ईसी 12:36 से 50) बनाम 50)। * एक पी <0.05 इंगित करता है; *** एक पी <0.001 इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

CNT का पता लगाने, सीरोटाइप दृढ़ संकल्प और quantitation के लिए वर्तमान सोने के मानक के विधायक है। विधायक मेजबान की संपूर्ण रेंज पूछताछ: सब्सट्रेट के vivo में घटित करने के लिए नशा के लिए आवश्यक विष बातचीत (जैसे, विष, एक कोशिका की सतह रिसेप्टर के लिए कोशिका द्रव्य में विष-रिसेप्टर जटिल, नियंत्रण रेखा स्थानान्तरण के internalization बाध्यकारी, नियंत्रण रेखा की मध्यस्थता दरार और अन्तर्ग्रथनी neurotransmission की निषेध) 18। विधायक नशे की physiologically प्रासंगिक मॉडल प्रदान करता है हालांकि, हालांकि, यह contaminants से चकित किया जा सकता है, गहन संसाधन है और एक समापन बिंदु के रूप में मौत के साथ चूहों की बड़ी संख्या शामिल है। वैकल्पिक रूप से, BoNT का पता लगाने और quantitation के लिए सेल आधारित assays भी जानवर का उपयोग करें, या synapses के लिए फार्म और आम तौर पर न्यूरोटोक्सिन से 8 गरीब संवेदनशीलता का प्रदर्शन करने में विफल जो neuroblastoma सेल लाइनों, करने के लिए आवश्यकता होती है जो प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों, तक ही सीमित कर दिया गया है। वें में नशे की तिथि करने के लिए, सबसे मापESE सेल आधारित प्लेटफार्मों तस्वीर-25, VAMP1 / 2 या syntaxin-1 11 के proteolytic दरार का पता लगाने पर भरोसा किया है। जाल प्रोटीन दरार सही रूप में नशा 19,20 से नशा या वसूली का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है इसलिए गैर रैखिक विवो में synaptic निषेध के साथ जुड़ा होना दिखाया गया है और इस वजह से समस्याग्रस्त है।

CNT का पता लगाने के लिए एक आदर्श सेल आधारित मॉडल प्रणाली (मैं) न्यूरॉन आधारित हो सकता है; (Ii) के synaptically neurotypic बिजली प्रतिक्रियाओं के साथ मिलकर किया जा; (Iii) सभी CNT के सीरमप्रकारों या उपप्रकार को अत्यधिक संवेदनशील हो; और (iv) विधायक से अधिक, कम कीमत पर, और पशुओं के उपयोग की आवश्यकता के बिना के बराबर या सुधार कर रहे हैं कि प्रस्ताव Scalability, throughput और परख बार। इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस ईएससी लाइनों से अत्यधिक संवर्धित, नेटवर्क glutamatergic की संस्कृतियों और GABAergic न्यूरॉन्स की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम तो यों तो धुंध परख विकसितप्रतिक्रिया में synaptic निषेध तम्बू और BoNT / ए / जी के साथ नशा करने के लिए। धुंध परख किसी भी synaptically सक्रिय न्यूरॉन आबादी (जैसे, प्राथमिक न्यूरॉन्स या मस्तिष्क स्लाइस) पर आयोजित किया जा सकता है, जबकि वर्तमान में ESNs reproducibly आकस्मिक नेटवर्क व्यवहार विकसित करता है और इसलिए धुंध परख के लिए उपयुक्त है कि केवल इन विट्रो व्युत्पन्न न्यूरॉन मॉडल हैं।

ईएससी संस्कृति और भेदभाव में कई नवाचारों CNT के अध्ययन के लिए परिभाषित वंश के न्यूरॉन्स के लिए पर्याप्त मात्रा में आवश्यक निर्माण किया। सबसे पहले, के लिए चयन और निलंबन-अनुकूलन जीवित रह सकते हैं कि ESCs संवर्धन द्वारा, हम फीडर कोशिकाओं और भेदभाव के शुरू में ESCs से फीडर कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए जरूरत से संदूषण के लिए संभावित सफाया कर दिया। निलंबन-अनुकूलन अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात हैं, निलंबन अनुकूलित ESCs mitotically सक्रिय रहते हैं, Oct3 / 4 अभिव्यक्ति को बनाए रखने और तंत्रिकाजन्य होना जारी है। इस विधि का प्रयोग, ~ 1.5 10 x 7 ईअनुसूचित जातियों आम तौर पर हर बीतने बरामद कर रहे हैं। दूसरा, NPCs के उत्पादन जाहिरा तौर पर समुच्चय के अंदरूनी हिस्सों को पोषक तत्व पहुंच बढ़ाने, भेदभाव के दौरान ढेर को रोकने के लिए यांत्रिक आंदोलन को शामिल करके ~ 300% की वृद्धि हुई थी। प्रक्रिया के दौरान, हम ईएससी संस्कृति और neuronal भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया सीरम तंत्रिकाजन्य ESCs बनाए रखने में सबसे महत्वपूर्ण घटक है कि पाया। सबसे अच्छी सफलता के लिए, हम निलंबन सीरम से प्रत्येक बहुत कुछ करने के लिए ES कोशिकाओं अनुकूल और समाप्ति तिथि के माध्यम से ईएससी संस्कृति और neuronal भेदभाव का समर्थन करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सीरम एकत्रीकरण की सलाह देते हैं।

सबसे synaptically सक्रिय संस्कृतियों के साथ के रूप में, DIV के 14 + ESNs दो सांद्रता 24 घंटे के भीतर न्यूरोटॉक्सिटी में परिणाम कर सकते हैं पीएच में अचानक परिवर्तन, और वायुमंडलीय सीओ को भी एक संक्षिप्त प्रदर्शन करने के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं। हे / एन या उससे अधिक समय, न्यूरॉन्स सीधे इलाज किया जाना चाहिए स्थायी incubations के द्वारा पीछा संस्कृतियों के उपचार की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए मैंइनक्यूबेटर या प्रयोग करने से पहले एक निरंतर सीओ 2 चैम्बर को हस्तांतरित एन।

तकनीक की एक किस्म आईसीसी, ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा और पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सहित न्यूरोजेनेसिस और neuronal परिपक्वता, की पुष्टि की। जीन की अभिव्यक्ति और न्यूरॉन आकृति विज्ञान में अस्थायी परिवर्तन न्यूरोजेनेसिस के विकास के चरणों के माध्यम से एक तेजी से प्रगति के साथ संगत कर रहे थे, और div 16 से, ESNs उत्तेजक और आकस्मिक नेटवर्क के साथ निरोधात्मक लघु बाद synaptic धाराओं 16 व्यवहार प्रदर्शित की। अन्तर्ग्रथनी गतिविधि का सबूत ESNs बोटुलिज़्म और टिटनेस के नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ के लिए जिम्मेदार pathophysiologies दोहराने सकता है कि सुझाव दिया। इस BoNT / ए / जी या वाहन का इलाज या अनुपचारित न्यूरॉन्स की तुलना में> 95% से तम्बू बिगड़ा mEPSC आवृत्तियों के साथ कि नशा दिखाने के लिए धुंध का उपयोग करके इस बात की पुष्टि की गई थी।

BoNT / A के लिए धुंध की संवेदनशीलता का माप एक मंझला निरोधात्मक संकेत दियाएकाग्रता .013 (0.5 माउस घातक इकाइयों / मिलीलीटर के बराबर) प्रधानमंत्री और एक सीमा-की-खोज 0,005 बजे से नीचे के (आईसी 50), स्नान के बाद इसके अलावा 20 घंटा में मापा जाता है। 4 गुना तेजी से विधायक की तुलना में और cleaved तस्वीर-25 के immunoblot आधारित पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील 30 गुना - इन मूल्यों के आधार पर, धुंध के रूप में 2 लगभग दो बार के रूप में संवेदनशील है और।

सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के नेटवर्क आबादी नशे की physiologically प्रासंगिक, सेल आधारित मॉडल का प्रस्ताव है कि सलाह देते हैं। का एक और अधिक तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट उपाय प्रदान करते हुए निलंबन अनुकूलित ESCs से नेटवर्क ESN संस्कृतियों प्राप्त करने के तरीकों में सुधार के साथ संयोजन में, धुंध का उपयोग पशु परीक्षण और जुड़े नुकसान, लागत और विधायक की नैतिक चिंताओं के लिए की जरूरत को कम करना चाहिए नशा। पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सक्रिय न्यूरोटोक्सिन की उपस्थिति की पहचान करने के लिए एक कम throughput विधि है, यद्यपि यह एक संकल्प और spe प्रदान करता हैआणविक विधियों के प्रयोग से पहुंच से बाहर है कि एड। इन निष्कर्षों को भी गतिविधि पर निर्भर तरीकों के आवेदन synaptic गतिविधि मूल्यांकन करने के लिए और नेटवर्क व्यवहार न्यूरोटोक्सिन का तेजी से और विशिष्ट पहचान सक्षम हो सकता है कि सबूत प्रदान करते हैं। इस तरह के उच्च throughput के दृष्टिकोण CNTs सहित neuromodulatory एजेंटों की एक विस्तृत सरणी के लिए संभव यंत्रवत अध्ययन, चिकित्सीय स्क्रीनिंग या नैदानिक ​​assays के लिए करना होगा।

Acknowledgments

संयुक्त विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यालय, चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रभाग (अनुदान संख्या CBM.THRTOX.01.10 - इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय एलर्जी के संस्थान और संक्रामक रोगों (आई ए ए संख्या AOD12058-0001-0000) और डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया .RC.023 और CBM.THRTOX.01.RC.014)। पंजाब एक डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी-राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद रिसर्च एसोसिएटशिप अवार्ड का आयोजन किया और के.एच. एक राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद रिसर्च एसोसिएटशिप अवार्ड का आयोजन किया है, जबकि इस शोध किया गया था। हम एंजेला Adkins और तकनीकी सहायता के लिए Kaylie Tuznik (USAMRICD) धन्यवाद; और संपादकीय सहायता के लिए सिंडी Kronman (USAMRICD)। इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं और सेना के विभाग, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं करते।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. ESC and ESN
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018 Media: ESC culture medium
Formulation and notes: 500 mL
100x MEM NEAA Life Technologies 11140-050 Media: store at 4 °C for up to 1 month
Formulation and notes: 6 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine ATCC 30-2115 6 mL
ES qualified FBS Applied Stem Cell ASM-5007 90 mL
100x antibiotics Sigma-Aldrich A5955 3 mL
55 mM 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023 1.1 mL
107 Units/mL LIF Millipore ESG1107 60 μL
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018 Media: ESC differentiation medium
Formulation and notes: 436.6 mL
100x MEM NEAA Life Technologies 11140-050 Media: store at 4 °C for up to 1 month
Formulation and notes: 5 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine ATCC 30-2115 5 mL
ESC-qualified serum Applied Stem Cell ASM-5007 50 mL
100x antibiotics Sigma-Aldrich A5955 2.5 mL
55 mM 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023 0.9 mL
Dulbecco's PBS Sigma-Aldrich D8537 Media: NPC trypsinization medium
Formulation and notes: 100 mL
0.5 M EDTA (18.3%) Sigma-Aldrich 3690 Media: freeze in 5 mL aliquote
Formulation and notes: 0.266 mL
Trypsin Sigma-Aldrich T8802 50 mg
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Media: Surface coating solutions
Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20
Poly-D-lysine (PDL) Sigma-Aldrich P7280 Media: use within 1 wk
Formulation and notes: 100 µg/mL in H20
Laminin Sigma-Aldrich L2020 5 µg/mL in H20
DMEM/F12 + GlutaMAX Life Technologies 10565-018 Media: NPC culture medium
Formulation and notes: 492.5 mL
100x N2 vitamins Life Technologies 17502-048 Media: store at 4 °C for up to 1 month
Formulation and notes: 5 mL
100x antibiotics Sigma-Aldrich A5955 2.5 mL
Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal A Life Technologies 10888-022 Media: ESN culture medium
Formulation and notes: 482.5 mL
50x B27 vitamins Life Technologies 17504-044 Media: store at 4 °C for up 1 month
Formulation and notes: 10 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamine ATCC 30-2115 5 mL
100x antibiotics Sigma-Aldrich A5955 2.5 mL
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) Sigma-Aldrich F0503 Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C
Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium.
Uridine Sigma-Aldrich U3003
TrypLE Express Trypsin Life Technologies 12605-010 Media: Miscellaneous
Formulation and notes: store at RT
DMSO Sigma-Aldrich D8418 store at RT
soybean trypsin inhibitor (STI) Sigma-Aldrich T6414 store at -20 °C
ethanol Sigma-Aldrich E7023 store at RT
ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix.
retinoic acid (RA) Sigma-Aldrich R2625 Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos.
Table 2. MIST
NaCl Sigma-Aldrich 71386 Media: Extracellular Recording Buffer
Final Concentration (mM): 58.44
MW: 140
KCl Sigma-Aldrich 60135 Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO)
Final Concentration (mM): 74.56
MW: 3.5
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo.
Final Concentration (mM): 119.98
MW: 1.25
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115 Final Concentration (mM): 110.98
MW: 2
MgCl2 Sigma-Aldrich 63069 Final Concentration (mM): 95.21
MW: 1
D-glucose Sigma-Aldrich G8644 Final Concentration (mM): 180.16
MW: 10
HEPES Sigma-Aldrich H0887 Final Concentration (mM): 238.3
MW: 10
K-gluconate Sigma-Aldrich P1847 Media: Intracellular Recording Buffer
Final Concentration (mM): 234.5
MW: 140
NaCl Sigma-Aldrich 71386 Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO)
Final Concentration (mM): 58.44
MW: 5
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187 Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo.
Final Concentration (mM): 507.18
MW: 2
Li-GTP Sigma-Aldrich G5884 Final Concentration (mM): 523.18
MW: 0.5
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115 Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo.
Final Concentration (mM): 110.98
MW: 0.1
MgCl2 Sigma-Aldrich 63069 Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo.
Final Concentration (mM): 95.21
MW: 1
EGTA Sigma-Aldrich E3889 380.35
HEPES Sigma-Aldrich H0887 Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo.
Final Concentration (mM): 238.3
MW: 10
bicuculline Tocris 131 Media: Miscellaneous
Final Concentration (mM): 0.01
MW: 417.85
CNQX Sigma-Aldrich C239 Final Concentration (mM): 0.01
MW: 276.12
Tetrodotoxin Sigma-Aldrich A8001 Final Concentration (mM): 0.005
MW: 645.74
BoNT/A-/G Metabiologics N/A Media:
Final Concentration (mM): TBD
MW: 150,000
Tetanus toxin Sigma-Aldrich T3194 Final Concentration (mM): TBD
MW: 150,000
Sigmacote Sigma-Aldrich SL-2 Final Concentration (mM): N/A
MW: N/A
Table 3. Equipment and Software
MiniAnalysis (version 6.0.7) Synaptosoft, Inc. N/A Event detection software
Igor Pro (version 6.22A) WaveMetrics N/A Software for visualization of recordings
Patchmaster Heka N/A Data acquisition software
Olympus IX51 inverted microscope Olympus N/A
micromanipulator Sutter Instrument MPC-365
patch-clamp amplifier Heka ECB10USB
micropipette puller Sutter Instrument P-1000
borosilicate capillary tubes Sutter Instrument B150-86-10 Corning 7740
18 mm glass coverslips Fisher 12-545-84
plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
cell strainer (40 µm) Fisher 08-771-1
Stovall Belly Dancer Shaker Fisher 15-453-211
low adhesion dishes Fisher 05-539-101 Corning 3262
bacterial dishes VWR 25384-302 100 x 15 mm

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 96 भ्रूण स्टेम कोशिकाओं स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन का पता लगाने इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी Synapse neuronal नेटवर्क glutamatergic अन्तर्ग्रथन GABAergic अन्तर्ग्रथन
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Hubbard, K., Beske, P., Lyman, M., McNutt, P. Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons. J. Vis. Exp. (96), e52361, doi:10.3791/52361 (2015).

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