Abstract
Terapeutiske og mekanistiske studier af præsynaptisk målrettede clostridielle nervegifte (CNTs) er blevet begrænset af behovet for en skalerbar, celle-baserede model, der producerer fungerende synapser og gennemgår fysiologiske reaktioner på forgiftning. Her beskriver vi en enkel og robust metode til effektivt at differentiere murine embryonale stamceller (EKSF) i definerede slægter af synaptisk aktive, netværksbaserede neuroner. Efter en 8 dages differentiering protokol, mus embryonale stamceller-afledte neuroner (ESNs) hurtigt udtrykke og inddeler neurotypic proteiner, danner neuronale morfologi og udvikle iboende elektriske reaktioner. Med 18 dage efter differentiering (DIV 18), ESNs udviser aktiv glutamaterge og γ-aminosmørsyre (GABA) erge synapser og adfærd emergent netværk kendetegnet ved en excitatorisk: hæmmende balance. For at bestemme om forgiftning med CNTs funktionelt antagoniserer synaptic neurotransmission og derved replikerende the in vivo patofysiologi, der er ansvarlig for de kliniske manifestationer af botulisme eller tetanus blev helcelle-patch clamp elektrofysiologi anvendes til at kvantificere spontane miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs) i ESNs udsat for tetanusneurotoksin (telt) eller botulinum neurotoksin (BoNT) serotyper / A- / G. I alle tilfælde udviste ESNs næsten fuldstændig tab af synaptisk aktivitet inden for 20 timer. Berusede neuroner forblev levedygtige, hvilket fremgår af uændrede hvilende membran potentialer og iboende elektriske reaktioner. For yderligere at karakterisere følsomheden af denne tilgang, var dosisafhængige virkninger af forgiftning på synaptisk aktivitet målt 20 timer efter tilsætning af BoNT / A. Forgiftning med 0,005 pM BoNT / A resulterede i en signifikant dekrement i mEPSCs, med en median hæmmende koncentration (IC50) af 0,013 pM. Sammenligninger af median doser viser, at funktionelle målinger af synaptisk hæmning er hurtigere, mere specifikke og mere følsomme end SNAREspaltningsanalyser eller musen letalitet assay. Disse data validere anvendelse af synaptisk koblet stamceller afledt neuroner for den meget specifikke og følsomme påvisning af CNTs.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at funktionelt evaluere synaptisk aktivitet i netbaserede kulturer af stamceller celleafledte neuroner udsat for clostridiale nervegifte. Dette er den første demonstration af en in vitro afledt model, funktionelt replikerer de patofysiologier ansvarlige for kliniske manifestationer af botulisme og validerer ESNs som en passende model til påvisning af CNTs, terapeutisk screening og mekanistiske undersøgelser.
BoNTs er meget dødelige bakterielle neurotoxiner produceret af medlemmer af Clostridium arter. Herunder den nyligt foreslåede BoNT / H er otte antigent forskellige BoNT serotyper blevet beskrevet (/ A- / H) 1,2. Alle serotyper er udtrykt som 150 kDa peptider, som er posttranslationelt nicked at frembringe en dichain består af en 100 kDa tung kæde (HC) og en 50 kDa let kæde (LC) forbundet af en disulfidbinding 3. HC medierer binding til præsynaptiske receptorer og entRy af toksinet ind i neuron via synaptiske endocytose. Under endosomal behandling, HC undergår strukturelle omorganisering for at danne en pore i vesikelmembranen lette translokation af LC i den præsynaptiske cytosol. LC derefter specifikt mål og spalter opløselig N -ethylmaleimide-sensitive binding fusionsprotein receptor (SNARE) proteiner i præsynaptiske rum: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) eller syntaxin (BoNT / C) 1. Spaltning af nogen af disse SNARE proteiner forhindrer samling af den synaptiske exocytose maskiner derved blokerer neurotransmitterfrigivelse. Denne kombination af effektiv neuronal målretning og præsynaptiske lokalisering gør BoNTs de mest potente giftstoffer kendte med skønnede humane dødelige doser helt ned til 0,1-1 ng / kg 1..
Biokemiske assays kan anvendes til at detektere tilstedeværelsen eller aktiviteten af CNT LC'ere med høj følsomhed. Men disse metoder ikke interrogate evne toksin til at binde, indtaste, aktivere og funktion i neuroner, og derfor er indirekte og muligvis vildledende foranstaltninger af tilstedeværelsen af aktivt toksin. Derimod funktionelle assays på forgiftning, såsom mus dødelighed assay (MLA) omfattende evaluering evne CNTs at kunne forhandle alle faser af optagelse og aktivering, der giver mere relevante og konkrete vurderinger af toksin aktivitet. Mens MLA er guld-standard for BoNT afsløring, det er en in vivo metode, der bruger døden som et endepunkt og har derfor begrænset anvendelighed som en forskningsplatform. Forsøg på at udvikle cellebaserede modeller af CNT forgiftning egnet til mekanistiske undersøgelser og terapeutiske screening har også lidt betydelige begrænsninger. Mens primære neuron kulturer giver en høj grad af fysiologisk relevans, er deres anvendelse kompliceres af en række faktorer, herunder høj ressource omkostninger, relativt lavt udbytte, tilstedeværelsen af multiple neuronal subtyper og omfattende lovgivningsmæssige og administrative tilsyn involveret med brug af dyr. Som et alternativ til de primære neuroner har neurogene cellelinier (som kan induceres til at vedtage neuron-lignende egenskaber ved kemisk stimulation), såsom neuroblastomer og adrenale chromaffinceller blevet anvendt som in vitro-modeller af forgiftning. Da disse celler kontinuerligt dyrket før induktion, er de meget skalerbar og derfor velegnet til moderat gennemløb tilgange. Men deres relevans er tvivlsom, da inducerede fænotyper er typisk heterogene, er dårligt følsomme over for CNTs og undlader at udvise kritiske neuronale adfærd, herunder manglende evne til at danne præ- og post-synaptiske rum, der samler til fungerende synapser 4. I mangel af fysiologisk intakte præsynaptiske rum, hele spektret af toksin: kan neuron interaktioner ikke blive gentaget, og derfor funktionelle målinger af forgiftning er ikke muligt 5. Ingent overraskende, forsøger at gennemføre mekanistiske undersøgelser eller narkotika screening for BoNTs hjælp af inducerede neurogene cellelinjer har resulteret i fund, der er uforenelige med in vivo og primære neuron undersøgelser 6.
Det er blevet foreslået, at stamceller afledt centrale nervesystem (CNS) neuroner kan tilvejebringe en næste generation cellebaseret platform for BoNT forskning, der kombinerer relevansen af primære neuroner med fleksibiliteten af dyrkede cellelinier 7-10. Især har muse stamceller celleafledte neuroner (ESNs) vist sig at være meget følsomme over for fysiologiske doser af BoNT / A / G og at replikere mange in vivo respons på forgiftning, herunder differentierede persistences, aktivitet forbedret forgiftning, og serotype -specifikke potenser 5,8,11. Disse adfærdsmønstre tyder på, at in vivo mekanismer BoNT optagelse, behandling, handel og aktivitet er konserveret i ESNs. Men hæmning af synaptisk Aktivitety er signaturen manifestation af botulisme, og dermed demonstrerer et tab af synaptisk aktivitet efter forgiftning af CNTs er afgørende før den konkluderede, at ESNs er en egnet in vitro afledt celle-baserede model for CNT studier.
For at måle effekten af forgiftning med CNTs på synaptisk aktivitet, blev hel-celle patch-clamp elektrofysiologi anvendes til at kvantificere monosynaptiske strømninger i bærerbehandlede eller CNT-behandlede DIV 21 + ESNs. Vi fandt, at forgiftning af ESNs med BoNT / A- / G eller telt forårsagede> 95% tab af synaptisk aktivitet inden 20 timer i alle tilfælde. Yderligere karakterisering udført 20 timer efter forgiftning med BoNT / A viste en dosisafhængig effekt på synaptisk aktivitet, med en detektionsgrænse under 0,005 pM og en IC50 værdi på 0,013 pM. Disse resultater viser, at følsomheden og tidsramme for elektrofysiologisk påvisning af forgiftning betydeligt forbedres i løbet af sammenlignelig immunoblot-baserede anaaf re- duktion af SNAP-25 spaltning og in vivo mus letalitet assays, der viser, at funktionelle målinger af forgiftning i synaptisk aktive neuron kulturer kan fremme mere følsomme, specifikke og hurtige metoder til at karakterisere den cellulære respons på BoNT.
Protocol
1. Tilpasning af økonomiske og sociale råd til Feeder Cellefri Suspension Culture
- Optø ESC ved 37 ° C, indtil en sliver is tilbage.
- Ved hjælp af en P1000 pipette forsigtigt overføre 1-2,5 x 10 6 dissocierede økonomiske og sociale råd til en ikke-vævskultur-behandlet skål indeholdende 10 ml forvarmet ESC medium. Inkuber i en befugtet vævskultur-inkubator i 20 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 20 timer vaskes cellerne ved forsigtigt at overføre suspensionen kultur til en 15 ml konisk rør ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Pellet ESC i 3 minutter ved 200 x g. Under centrifugering tilsættes 10 ml frisk ESC medium tilbage til lav friktion fad.
- Aspirer supernatanten, idet man undgå løsner cellepelleten, og der tilsættes 1 ml frisk ESC medium til cellepellet. Overfør celler til den bakterielle skålen ved hjælp af en P1000 pipette og vende tilbage til inkubatoren.
- Overhold celler dagligt indtil aggregater bliver synlige med det blotte øje (typisk 4-8 dage (d); aggregater vil være 0,2- 0,5 mm). Hvis aggregater er ikke synlige efter 4 d Gentag trin 1.3. Når aggregater er synlige, dissociere og vedligeholde økonomiske og sociale råd, som beskrevet i afsnit 2.
2. ESC Passage og vedligeholdelse
- Overførsel ESC aggregater til en 15 ml konisk rør ved hjælp af en steril 10 ml pipette og tillade aggregater at afregne til en kompakt pellet (typisk 3 - 5 min). Aspirer supernatanten, være omhyggelig med at undgå at forstyrre cellepelleten, og vask aggregater med 5 ml PBS. Selvom tyngdekraften bundfældning anbefales alternativt pellet celler ved 100 xg i 2,5 min i stedet for at spare tid.
- Aspirer PBS og tilsæt 500 pi trypsin. Inkuber aggregater i trypsin i 3 minutter i et vandbad ved 37 ° C. Tilføj 500 pi ESC medium at fortynde trypsin og forsigtigt udriv 10 gange med en P1000 pipette til at bryde op aggregater. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Pellet dissocierede celler i 3 minutter ved 200 xg og resuspender cellerne til en slutkoncentration på 1,0x 10 7 celler / ml i ESC medium. Transfer 150 ul (1,5 x 10 6 celler) til 10 ml frisk ESC medium i en 10 cm bakteriel skålen og vende tilbage til vævskultur inkubator i 48 timer. Overskydende økonomiske og sociale råd kan differentieres, kryokonserveret på 1 - 5 x 10 6 celler / ml i 90% ESC medium suppleret med 10% DMSO, eller kasseres.
- Passage aggregater hver 48 timer. Aggregater klar til passage vil være tydeligt, med diametre på mere end 0,5 mm.
BEMÆRK: Optøning og kultur cryopræserverede, suspension-tilpassede celler opnås per trin 1,2-1,4. Aggregater vil være klar til passage inden 48-72 timer.
3. neuronal differentiering
BEMÆRK: Conduct trin 3,1-3,5 inden middag og trin 3,7 efter middag. En oversigt over differentiering procedurer er vist i figur 1A.
- Adskille økonomiske og sociale råd som i trin 2,1-2,5. Transfer 350 ul (3,5 x 10 6), i afstandU-økonomiske og sociale råd til en 10 cm lav tilknytning skål indeholdende 25 ml differentiering medium. Placer på en orbitalryster indstillet til 30-45 rpm inde i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2. Dette er den første dag i differentiering, betegnet dag in vitro (DIV) -8.
BEMÆRK: Brugen af en ultra-lav vedhæftning fad øger omkostningerne ved den metode, men producerer lidt større udbytter end bakterielle petriskåle da aggregater lejlighedsvis kan klæbe til petriskåle. Hvis anden skål størrelser foretrækkes, kan mellemstore mængder og celletal skaleres tilsvarende. - Efter 48 timer (DIV -6), skal du bruge en 25 ml pipette til at overføre de differentierende celleaggregater til en 50 ml konisk rør. Umiddelbart tilføje en frisk 25 ml differentiering medium til petriskålen.
- Tillad aggregater at afvikle over 2 - 5 min, der producerer en synlig pellet, der er 1 - 2 mm dyb. Ignorer enkelte celler eller små aggregater tilbage i suspension. Aspirere forsigtigt mediet og overføre cell pelletere tilbage til petriskål ved anvendelse af en P1000. Sted på roterende rysteapparat i en vævskulturinkubator.
- På DIV -4 gentag trin 3.2. Pelleten vil være 2 - 4 mm. Erstat 30 ml differentiering medium suppleret med 6 uM all-trans-retinsyre (RA) til petriskålen. Retur til rotationsryster i vævskultur inkubator i yderligere 48 timer.
- På DIV -2 gentag trin 3.3. Pelleten bliver 4-8 mm dyb på dette punkt.
- Hos DIV -1, forberede plating overflader som i afsnit 4.
- På DIV 0 tø 5 ml af præ-alikvoter og frosset NPC trypsinisering medium ved 37 ° C i 5 - 10 min og sted i en vævskultur hætte. Anvendelse af en 25 ml pipette, overførsel differentiere aggregater til et 50 ml konisk rør. Tillad aggregater at bosætte sig og omhyggeligt aspirer medium. Wash pellet to gange med 10 ml PBS, så aggregaterne at afvikle mellem vaskene.
- Efter den anden PBS vask, tilsættes 5 ml NPC trypsinering medium til pelleten og inkuberes ved 376 C i 5 min. Knips forsigtigt på glasset efter 2,5 min.
- Der tilsættes 5 ml 0,1% sojabønnetrypsininhibitor (STI) for at inaktivere trypsin og blandes ved at vende. Forsigtigt udriv 10 - 15 gange med en 10 ml serologisk pipette, indtil en relativt homogen cellesuspension fremstilles.
- Langsomt overføre cellesuspensionen til en 40 um eller 70 um cellefilter placeret i toppen af en 50 ml konisk rør. Når alle suspensionen er blevet filtreret, tilsættes 1 ml N2 medium at vaske resterende celler gennem filteret og pelletere dissocierede cellesuspension i 6 min ved 200 x g.
- Aspirer medium uden at forstyrre pellet. Vask cellerne to gange med 10 ml N2-medium, pelletering celler i 5 minutter ved 200 xg og triturering mellem vaskene med P1000. Forud for den anden vask, tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Resuspender celler i N2-medium ved 1 x 10 7 celler pr ml og plade ESNs ved en celletæthed på 150.000 - 200.000 celler / cm2.
- Overfør nyligt plated ESNs til en befugtet vævskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 og vedligeholde som i afsnit 5.
4. Forberedelse Kultur overflader til Plating Neural Forstadier til DIV 0
- Forbered væv kultur-behandlede skåle mindst 1 dag før udpladning. Tilsæt tilstrækkeligt polyethylenimin (PEI; 25 pg / ml i sterilt H2O) eller poly-D-lysin (PDL, 100 ug / ml i sterilt H2O) til at dække væv kultur-behandlede plastskåle og inkuberes O / N på 37 ° C.
- Morgenen i yderklædningen, vaske op to gange med dobbelt-destilleret H2O og en gang med PBS. Efter den sidste vask tilsættes tilstrækkelig N2-medium til at dække skålen (f.eks, 1 ml per brønd af en 12-brønds skål eller 4 ml pr 6 cm skål).
- Forbered 18 mm dækglas mindst én dag før neuron plating. Rene dækglas ved plasma-rengøring for 4 min.
- Umiddelbart overføre rengjorte dækglas til en ethanol-vasket parafilm i bunden af enstore steril skål og tilsættes 400 pi PEI eller PDL opløsning, fremstillet som i trin 4.1. Inkuber O / N ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator.
- Om morgenen, vask dækglas tre gange med vand og tilsættes 5 pg / ml laminin i PBS til 1 - 3 timer ved 37 ° C. Før adskille neuroner, opsug laminin og straks overføre dækglasset til en brønd i en 12-brønds skål indeholdende 1 ml NPC medium, og sørg for at holde den behandlede side opad.
- Store retter og dækglas ved 37 ° C, indtil NPC'ere er klar til pladen.
5. Vedligeholdelse af neuroner
- Ved DIV 1, aspireres medium og erstatte med N2 dyrkningsmedium.
- Ved DIV 2 og 4, aspireres medium og erstatte med B27 dyrkningsmedium.
- Hos DIV 8, at aspirere medium og erstatte med B27 dyrkningsmedium indeholdende mitotiske hæmmere eliminere kontaminerende ikke-neuronale celler.
- Hos DIV 12, erstatte med B27 dyrkningsmedium.
- Fjern ikke DIV12 + ESNs fra 5% CO2 indtil klar til brug.
6. Målt Hæmning af Synaptic Transmission (MIST) Indhold til kvantificering Miniature Excitatorisk Post-synaptiske strømforhold
ADVARSEL: clostridium neurotoksiner er de mest giftige stoffer, der vides med skønnede menneske LD 50 værdier helt ned til 0,1-1 ng / kg. Opnå nødvendige godkendelser, før du bruger disse toksiner og tage passende forholdsregler.
- Fortyndes forsigtigt BoNT / A til 100x den ønskede slutkoncentration i ESN dyrkningsmedium og opvarmes til 37 ºC. Tilføj passende mængde toksin til div 21 + ESN kulturer, hvirvle dyrkningsskålen, og vende tilbage til inkubatoren.
- Hvis cellerne vil blive analyseret mere end 4 timer efter forgiftning, tilføje toksin til skålen og hvirvel uden at fjerne fra 5% CO 2, såsom direkte i inkubatoren eller i en konstant CO 2 kammer.
- På passende tidspunkt, Aspirate ESN dyrkningsmedium og vaskes to gange med ekstracellulær optagelse buffer (ERB). Tilsæt 4 ml ERB suppleret med 5,0 uM tetrodotoxin og 10 uM bicucullin, blokering aktionspotentialer og antagoniserende GABAA-receptor-aktivitet hhv.
- Overførsel parabol til elektrofysiologi rig. Der kræves hverken perfusion eller temperaturregulering til tågen analysen.
- Træk borosilikatglas Med en mikropipette aftrækker til at producere en optagelse pipette med 5-10 MOhm af resistens og fyld med intracellulær optagelse buffer. Dyppes forsigtigt udfyldt optagelse pipette i siliconizing reagens før optagelse.
- Ved hjælp af en luftfyldt sprøjte give overtryk som optagelsen pipette sænkes ned i ERB. Efter blidt lander optagelsen pipetten på soma af neuron, der skal optages, skal du fjerne positivt tryk og danne en gigaseal. Formindsk bedriften spænding til -70 mV. Anvende forsigtigt undertryk til at bryde ind hel-celle konfiguration.
- Skift til strøm-clamp til at overvåge og registrere hvilende membranpotentiale. Uden justering for flydende junction potentialer, vil den hvilende membranpotentiale være mellem -67 til -82 mV.
- Udfør en kontinuerlig -70 mV spænding-clamp optagelse i 4 - 5 min at opdage miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs).
- Analyser 4 min af optagede data for mEPSC detektion ved hjælp spike afsløring software med følgende indstillinger: Threshold, 5; Periode for at søge et lokalt maksimum, 10.000 usek; Tid før et højdepunkt for baseline, 5.000 usek; Periode for at søge et henfald tid, 20.000 usek; Fraktion af top for at finde et henfald tid, 0,37; Periode til gennemsnit en baseline, 1.000 usek; Område tærskel, 20; Antal point til gennemsnitlig peak, 1; Retning af peak, negativ.
- Indsamle og gemme oplysninger om fundne begivenheder. Divider antallet af konstaterede hændelser i 4 min ved 240 at bestemme mEPSC i Hz.
- Saml mEPSC frekvenser for 8-12 fortsrols og 8-12 BoNT-behandlede prøver for hver eksponering tilstand. Analyser frekvens mod alders- og lot-matchede kontroller. Bestem den statistiske signifikans af% inhibering af synaptisk aktivitet ved hjælp af en-vejs ANOVA test og Dunnetts post-hoc test.
Representative Results
Vi har udviklet en differentiering protokol, der muliggør økonomisk produktion af store mængder yderst rent stamceller celleafledte neuroner fra muse ESC (beskrevet i figur 1A) 8,11. Denne metode er blevet anvendt i løbet af en årrække at reproducerbart differentiere privat genereres og kommercielt tilgængelige ESC linjer i neuroner i definerede slægter 12-14. Kritiske elementer i denne protokol omfatter (1) tilpasning af økonomiske og sociale råd til feeder cellefri suspension kultur; (2) korrekt vedligeholdelse af suspensionskulturer; og (3) differentiering under roterende forhold. Overgang til suspension kultur drastisk reducerer tid og omkostninger til ESC vedligeholdelse, og overflødiggør behovet for at fjerne feeder celler før differentiering. Efter suspension tilpasning, Oct3 / 4-ekspression er konsistent gennem mindst 30 passager, hvilket indikerer, at suspension tilpasning ændrer ikke udtryk for pluripotens markører (Figur 1B-D 7 celler pr passage. Dette sker typisk inden for ti passager efter suspension tilpasning eller fem passager efter optøning af økonomiske og sociale råd, der tidligere suspension tilpasset. Mekanisk rotation differentiere aggregater blev også fundet at være kritisk for øget neuronal udbytte. Tilsætningen af en rotationsryster slået super-aggregatdannelse, øget samlet levedygtighed og produktion af en stigning i udbyttet af neurale progenitorceller (NPCs) ved DIV 0 (figur 1E) ~ 300%.
En typisk differentiering starter med 3,5 x 10 6 økonomiske og sociale råd på DIV -8 og producerer 115 x 10 6 NPC'ere på DIV 0, omkring 60% vil overleve og blive neuroner. De resterende 40% består af ikke-neuronale celler og er stort set elimineret ved serum afsavn mellem DIV 0 - 1. Det lille antal vedvarende glia kan fjernes ved tilsætning af mitotiske inhibitors fra DIV 2 - 4 eller DIV 8 - 12. udpladningsdensitet er kritisk på DIV 0; neuroner belagte for tyndt, vil ikke overleve ud over 2 uger. Få dage efter udpladning, differentierede neuroner udviser neuronale morfologi og inddeler neurotypic proteiner, såsom somatodendritisk markør MAP2 og axonal markør Tau (figur 2A). Ved DIV 14 synapsin-1 + puncta kan identificeres ved axodendritic grænseflader, der tyder på synapse dannelse. Dette er i overensstemmelse med ekspression af synaptiske markørproteiner før div 7 8,11. Neuronal morfologier fortsat modnes gennem DIV 21, på hvilket tidspunkt kulturerne udviser udførlige axodendritic dorne og store synaptiske puncta (figur 2A). Hvis vedligeholdes korrekt, ESNs forblive levedygtig og aktiv i mindst 4 uger efter plating.
Longitudinal ekspression profilering anvendelse af RNA-sekventering bekræftede morfologiske og proteomisk tegn på neuronal specifikation end modning 11,15. Repræsentative markører for udviklingsmæssige progression udviste fase-specifikke udtryk profiler, herunder Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN og KCC2 (figur 2B). Af DIV 0, ESNs udtrykte rigelige kopier af neuron-specifikke strukturelle proteiner, herunder MAP2 og Tau. I overensstemmelse med tidligere resultater, markører for kun to neuronale undertyper blev observeret: vGluT2-udtrykkende midthjernen / baghjerne glutamaterge neuroner og GABAerge interneuroner 8. Tilsvarende en bred vifte af glutamaterge og GABAerge markører udviste kraftige stigninger i udtryk mellem DIV 0 og DIV 7, herunder præsynaptiske SNARE-proteiner, der er nødvendige for neurotransmitterfrigivelse; neurotransmitterreceptorer kræves til post-synaptiske reaktioner; og stilladser proteiner der kræves for at binde disse receptorer til den postsynaptiske membran. Neuroner udstille modne iboende elektriske egenskaber af DIV 14 og spontane miniature excitatoriske postsynaptiske strømme af DIV16 16.
De målte Hæmning af Synaptic Transmission (MIST) assay blev anvendt til at vurdere effekten af forgiftning på synaptisk aktivitet. Ved at sammenligne mEPSC frekvenser mellem beruset og vehikelbehandlede DIV 24 + ESNs, MIST giver en kvantitativ og specifik måling af beruselse er baseret på funktionelle hæmning af synaptisk aktivitet (figur 3A). MIST blev brugt til at måle effekterne af BoNT / A- / G eller telt på synaptisk aktivitet i ESNs ved 20 timer efter bad tilsætning af hvert toksin. Toksiner blev tilsat ved en koncentration svarende til 10 gange den EC50-værdi, som tidligere bestemt ved immunoblot-analyse af SNARE protein spaltning 11. Alle toksiner reduceret mEPSC frekvenser til mindre end 5% af vehikelbehandlede kontroller. Reduktioner i synaptiske satser ikke kan henføres til celledød eller ændrede iboende reaktioner, da berusede ESNs var stand til at blive lappet, fyret gentagne aktionspotentialersom reaktion på nuværende injektion og udviste ingen signifikant ændring i hvilende membranpotentiale (figur 3B, C).
At sammenligne følsomheden af tåge til eksisterende metoder til påvisning af CNTs, detektionsgrænse og median hæmmende koncentration (IC50) blev bestemt 20 timer efter tilsætning af BoNT / A til ESNs. Forgiftning med så lidt som 0,005 pM BoNT / A frembragte en statistisk signifikant reduktion i mEPSC frekvens, med en IC50-værdi på 0,013 pM og fuldstændig inaktivering af synaptisk aktivitet over 12:05 (figur 4A). Denne IC50 værdi svarer til ca. 0,5 muse dødelige enheder / ml, hvilket antyder, at tågen dobbelt så følsomt og 2- til 4-fold hurtigere end MLA i detektering af tilstedeværelsen af BoNT / A. Immunoblot målinger af SNAP-25-spaltning produceret en EC50-værdi på 0,38 pM, og en påviselig dosis 12:05 minimum, hvilket indikerer, at tåge cirka 30-gange mere følsomend immunoblot-baseret detektion af spaltede SNARE proteiner (figur 4B).
Figur 1. Suspension tilpassede ESNs forblive mitotisk stabil og hurtig markører for pluripotens. (A) Skematisk af ESC vedligeholdelse og differentiering. Tilstedeværelsen eller fraværet af retinsyre (RA) eller leukæmi inhibitorisk faktor (LIF) er markeret med + eller -. En sammenligning mellem dage in vitro (DIV) og klassiske udviklingsstadier (DS) for primære neuron kulturer billede 17. (B) opformeringsrater for R1, D3 og C57BL / 6J ES cellelinjer stabilisere med fem passager efter overgangen til suspension kultur. (C) Flowcytometri data viser ingen væsentlige ændringer i Oct3 / 4-ekspression i R1, D3 og C57BL / 6J ES-cellelinier målt over 25 passager i suspensionskultur (n = 6 for hver). (D) Faktiske celleudbytter under rutinemæssige passage for en suspension tilpasset R1 ESC linje målt mellem passagerne 5 og 30 (sort linje). Teoretiske kumulative udbytte, hvis der ikke celler kasserede under passage præsenteres også (rød linje). (E) Bright-field billeder af DIV 0 aggregater under statisk (venstre) eller roterende forhold (til højre). Roterende betingelser produceret sfæriske aggregater uden agglomerering og øget NPC giver 3-fold (p <0,001, bestemt under anvendelse af T-test) 11. * Angiver et P <0,05. Dette tal er blevet ændret fra Hubbard et al. 11 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Morfologiske, PRoteomic og transkriptom beviser for neuronal specifikation og modning (A) Immuncytokemi fra DIV 7 -. DIV 49 demonstrerer neuronal arborization og fremkomsten af synaptisk puncta på axodendritic grænseflader. Axoner er mærket med Tau (grøn) er dendritter mærket med MAP2 (rød), er præ-synaptiske rum mærket med synapsin (hvid), og kerner farves med DAPI (blå). (B) Longitudinal udtryk profilering af repræsentative gener demonstrerer udviklingstrin ekspression og præciserer neuronale undertyper. Alle gentranskripter udtrykkes som omtrentlige antal udskrifter pr celle. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. ESNs under. gå hæmning af synaptisk aktivitet, når de udsættes for BoNT / AG og telt (A) Repræsentative spor fra ESNs indsamlet 20 timer efter bad tilsætning af ~ 10 x EF 50 værdier af BoNT / A - / G, telt eller køretøj. Hver neurotoksin reduceret synaptisk aktivitet med over 95% sammenlignet med kontroller. (B) Berusede neuroner forblev i stand til at affyre gentagne AP'er som reaktion på depolariserende strøm injektion (som påvist for BoNT / A, men observeret i alle berusede kulturer) og (C) udviste ingen ændringer i det negative, membran potentiale (C; n> 18 for hver behandling). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Bestemmelse af følsomhed af tåge i BoNT / A-behandledeESNs. (A) MIST målinger af synaptisk aktivitet 20 timer efter bad tilsætning af BoNT / A. Repræsentative spænding-clamp sporsegmenter udviste et fald i mEPSC frekvens efter BoNT / A eksponering (venstre side). Kvantificering af mEPSC frekvens (søjlediagram, højre side, n = 20 for kontrol; n = 11 til 22 for hver dosis) bekræfter en dosisafhængig fald i mEPSC frekvens. Den mediane inhiberende koncentration blev bestemt med et mindste kvadraters fit af en ikke-lineær regression under anvendelse af et fire parameter variabel hældning (R2> 0.91). Bemærk detektionsgrænsen ved tåge i ESNs er mindst 0,005 pM. (B) BoNT / A rus ESNs resulterer i spaltning af SNAP-25, som visualiseret ved gel mobilitetsforskydninger (et repræsentativt Western blot på venstre side med et søjlediagram, der viser kvantificering af SNAP-25-spaltning på højre; n = 4) . Bemærk nedsat følsomhed ved hjælp SNARE protein spaltning (SNAP-25) som et endepunkt (EF 50 af 12:36) vs. (IC50 på 0,013 pm). * Angiver et P <0,05; *** Angiver en P <0,001. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Den nuværende gold standard for CNT afsløring, serotype beslutsomhed og kvantificering er MLA. MLA forespørger hele spektret af vært: toksin interaktioner er nødvendige for forgiftning at forekomme in vivo (fx toksin binding til en celleoverfladereceptor, internalisering af toxin-receptor-komplekset, LC translokation til cytoplasmaet, LC-medieret spaltning af substrat og inhibering af synaptisk neurotransmission) 18. Selv om MLA tilbyder en fysiologisk relevant model for forgiftning, er det imidlertid ressourcekrævende, kan blive beskæmmet af forurenende stoffer og involverer et stort antal mus med døden som et slutpunkt. Alternativt er cellebaserede assays for BoNT detektion og kvantificering været begrænset til primære neuron kulturer, som også kræver brug af dyr, eller neuroblastom-cellelinier, som ikke danner synapser og typisk udviser ringe følsomhed for neurotoksiner 8. Hidtil har de fleste målinger af forgiftning i thESE cellebaserede platforme har påberåbt sig påvisning af den proteolytiske spaltning af SNAP-25, VAMP1 / 2 eller syntaxin-1 11. Dette er problematisk, fordi SNARE protein spaltning har vist sig at være ikke-lineært forbundet med synaptisk hæmning in vivo og kan derfor ikke præcist repræsentere beruselse eller nyttiggørelse fra forgiftning 19,20.
En ideel cellebaseret modelsystem for CNT detektion ville (I) neuron-baserede; (Ii) være synaptisk kombineret med neurotypic elektriske reaktioner; (Iii) være meget følsomme over for alle CNT serotyper eller subtyper; og (iv) tilbyde skalerbarhed, gennemløb og assay gange, der svarer til eller forbedret i løbet af MLA, til en lavere pris, og uden at kræve anvendelsen af dyr. For at opfylde disse krav, har vi udviklet en metode til at producere store mængder af højt beriget, netværksbaserede kulturer af glutamaterge og GABAerge neuroner fra kommercielt tilgængelige mus ØSU linjer. Vi derefter udviklede tågen assay at kvantificeresynaptisk hæmning som reaktion på forgiftning med telt og BoNT / A- / G. Mens kan gennemføres dug analysen på en synaptisk aktiv neuron befolkning (fx primære neuroner eller hjerneskiver), i øjeblikket ESNs er de eneste in vitro afledt neuron model, reproducerbart udvikler emergente netværk adfærd og er derfor hensigtsmæssigt, at tågen analysen.
Producerer tilstrækkelige mængder af neuroner i definerede afstamning for CNT undersøgelser krævede flere nyskabelser i ESC kultur og differentiering. Først ved at selektere for og dyrkning ESC, der kan overleve suspension-tilpasning, vi eliminerede muligheden for forurening med fødeceller og behovet for at oprense fødeceller fra ESC i starten af differentiering. Selvom de molekylære mekanismer bag suspension-tilpasning er ukendte, suspension-tilpassede økonomiske og sociale råd forbliver mitotisk aktive, bevarer Oct3 / 4-ekspression og fortsat være neurogen. Ved hjælp af denne metode, ~ 1,5 x 10 7 ESC'er typisk udvindes hver passage. For det andet blev produktionen af NPC'ere steg ~ 300% ved at indarbejde mekanisk omrøring for at forhindre agglomerering under differentiering, angiveligt stigende næringsstof tilgængelighed til det indvendige af aggregater. Under processen, fandt vi, at serum anvendes til ESC kultur og neuronal differentiering er den mest kritiske komponent i at bevare neurogene økonomiske og sociale råd. For bedst succes, anbefaler vi suspension tilpasning ES-celler til hvert parti af serum og lageropbygning serum ved -20 ° C for at støtte ESC kultur og neuronal differentiering gennem udløbsdatoen.
Som med de fleste synaptisk aktive kulturer, DIV 14 + ESNs er meget modtagelige for pludselige ændringer i pH, og endda en kort udsættelse for atmosfærisk CO 2 koncentrationer kan medføre neurotoksicitet indenfor 24 timer. For eksperimenter, der kræver behandling af kulturer efterfulgt af inkubationer varige O / N eller længere, neuroner bør behandles direkte in inkubatoren eller overføres til en konstant CO 2 kammer før eksperimenteren.
En række teknikker bekræftet neurogenese og neuronal modning, herunder ICC, transkriptionel profilering og helcelle-patch-clamp elektrofysiologi. Permanente ændringer i genekspression og neuron morfologi var i overensstemmelse med en hurtig progression gennem de udviklingsmæssige stadier af neurogenese og ved DIV 16, ESNs udstillede stimulerende og hæmmende miniature postsynaptiske strømninger med emergent netværk adfærd i 16. Bevis for synaptisk aktivitet foreslået, at ESNs kan kopiere patofysiologier ansvarlige for de kliniske manifestationer af botulisme og stivkrampe. Dette blev bekræftet ved hjælp af MIST at vise, at forgiftning med BoNT / A- / G eller telt forringet mEPSC frekvenser> 95% i forhold til bærerbehandlede eller ubehandlede neuroner.
Målinger af følsomhed MIST for BoNT / A viste en median hæmmendekoncentration (IC 50) af 0,013 pM (svarende til 0,5 muse dødbringende enheder / ml) og en grænse-of-detektion under 0,005 pM, målt ved 20 timer efter bad tilsætning. Baseret på disse værdier, Dis er omtrent dobbelt så følsom som og 2 - 4 gange hurtigere end MLA og 30-fold mere følsom end immunoblot-baserede påvisning af spaltet SNAP-25.
Kollektivt antyder disse data, at netværksforbundne populationer af stamceller celleafledte neuroner tilbyder en fysiologisk relevant, celle-baserede model for forgiftning. I kombination med forbedrede metoder til at udlede netværksbaserede ESN kulturer fra suspension-tilpassede økonomiske og sociale råd bør anvendelsen af tåge reducere behovet for dyreforsøg og de dermed forbundne ulemper, omkostninger og etiske bekymringer MLA samtidig give en mere hurtig, følsom og specifik foranstaltning af forgiftning. Selvom hel-celle patch-clamp elektrofysiologi er en low-throughput metode til at identificere tilstedeværelsen af aktive nervegifte, det giver en opløsning og speed, der er uopnåeligt med molekylære metoder. Disse resultater også dokumentere, at anvendelsen af aktivitet-afhængige metoder til at evaluere synaptisk aktivitet og netværk adfærd kan gøre det muligt hurtigt og specifik påvisning af nervegifte. Sådanne højere throughput metoder ville gøre mekanistiske undersøgelser, terapeutisk screening eller diagnostiske analyser muligt for en bred vifte af neuromodulatory midler, herunder CNTs.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health National Institute of Allergy og infektionssygdomme (IAA nummer AOD12058-0001-0000) og Defense Threat Reduction Agency - Fælles for Videnskab og Teknologi Office, Medicinsk S & T Division (tal tilskud CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 og CBM.THRTOX.01.RC.014). Denne forskning blev udført, mens PB holdt et Defense Threat Reduction Agency-National Research Council Research Associateship Award og KH afholdt en National Research Council Research Associateship Award. Vi takker Angela Adkins og Kaylie Tuznik (USAMRICD) til teknisk bistand; og Cindy Kronman (USAMRICD) til redaktionel assistance. Synspunkterne i denne artikel er forfatternes og afspejler ikke den officielle politik for Institut for hæren, Department of Defense, eller den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
- Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
- Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
- Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
- Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
- Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
- Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
- Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127 (2012).
- Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
- Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
- Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423 (2013).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
- Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).
