Abstract
Des études mécanistiques et thérapeutiques des neurotoxines clostridiennes les présynaptique ciblées (NTC) ont été limitées par la nécessité d'un modèle évolutif, à base de cellules qui produit des synapses fonctionnelles et subit réponses physiologiques à l'intoxication. Nous décrivons ici une méthode simple et robuste de différencier efficacement les cellules souches embryonnaires murines (CES) dans lignages définis de neurones, synapses actives en réseau. Suite à un protocole de différenciation 8 jours, les neurones dérivés de cellules souches embryonnaires de souris (ESN) rapidement exprimer et de compartimenter les protéines neurotypic, forment morphologies neuronales et élaborer des réponses électriques intrinsèques. En 18 jours après la différenciation (DIV 18), ESN présentent glutamatergique active et γ-aminobutyrique (GABA) synapses ergiques et les comportements du réseau émergent caractérisé par un excitateur: équilibre inhibitrice. Pour déterminer si l'intoxication avec NTC antagonise fonctionnellement synaptique neurotransmission, reproduisant ainsi èmee in vivo physiopathologie qui est responsable de manifestations cliniques de botulisme ou le tétanos, la cellule entière patch clamp électrophysiologie a été utilisée pour quantifier courants spontanés miniatures excitateurs post-synaptiques (mEPSCs) dans ESN exposés à neurotoxine tétanique (tente) ou neurotoxine botulique (BoNT) sérotypes / A- / G. Dans tous les cas, ESN présentait une perte presque complète de l'activité synaptique dans les 20 heures. Neurones en état d'ébriété restaient viables, comme l'a démontré inchangés potentiels de membrane de repos et réponses électriques intrinsèques. Pour caractériser davantage la sensibilité de cette approche, les effets dose-dépendante de l'intoxication sur l'activité synaptique ont été mesurés 20 heures après l'addition de BoNT / A. Intoxication à 0,005 pM BoNT / A a entraîné une diminution significative de la mEPSCs, avec une concentration inhibitrice médiane (CI50) de 0,013 pM. Les comparaisons des doses médianes indiquent que les mesures fonctionnelles d'inhibition synaptique sont plus rapides, plus précis et plus sensible que SNAREessais de clivage ou l'essai de létalité de la souris. Ces données valident l'utilisation de souches neurones synaptiquement couplés, dérivés de cellules pour la détection hautement spécifique et sensible de NTC.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est d'évaluer fonctionnellement l'activité synaptique dans les cultures en réseau de neurones dérivés de cellules souches exposées à des neurotoxines de Clostridium. Ce est la première démonstration d'un modèle dérivé in vitro qui reproduit fonctionnellement les pathophysiologies responsables de manifestations cliniques de botulisme et valide ESN comme un modèle approprié pour la détection des NTC, ciblage thérapeutique et études mécanistiques.
BoNTs sont des neurotoxines bactériennes très meurtriers produites par les membres de l'espèce Clostridium. Y compris le récemment proposé BoNT / H, huit sérotypes de neurotoxines botuliques antigéniques distinctes ont été décrites (/ A- / H) 1,2. Tous les sérotypes sont exprimés en 150 kDa peptides qui sont post-traductionnelle entaillées pour produire un dichain composé d'un 100 kDa chaîne lourde (HC) et une 50 chaîne légère kDa (LC) liés par une liaison disulfure 3. Le HC médiation de la liaison aux récepteurs présynaptiques et entry de la toxine dans le neurone par endocytose synaptique. Pendant le traitement endosomal, le HC subit réorganisation structurelle pour former un pore dans la membrane de la vésicule, ce qui facilite la translocation de la LC dans le cytosol présynaptique. La LC ensuite cible spécifiquement et clive récepteur soluble de la protéine de fixation de fusion de -ethylmaleimide sensibles N (SNARE) des protéines dans le compartiment pré-synaptique: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) ou la syntaxine (BoNT / C) 1. Le clivage de l'une de ces protéines SNARE empêche l'assemblage de la machinerie de l'exocytose synaptique, bloquant ainsi la libération de neurotransmetteurs. Cette combinaison de ciblage neuronal efficace et la localisation présynaptique rend BoNTs les poisons les plus puissants connus, avec des doses létales humaine estimée aussi faibles que 0,1 à 1 ng / kg 1.
Des dosages biochimiques peuvent être utilisées pour détecter la présence ou l'activité de CNT LC avec une sensibilité élevée. Cependant, ces méthodes ne parviennent pas à interrogate la capacité de la toxine de se lier, entrez, activer et fonction au sein de neurones, et sont donc des mesures indirectes et éventuellement trompeuses de la présence de la toxine active. En revanche, les tests fonctionnels d'intoxication tels que le test de létalité de la souris (MLA) d'évaluer globalement la capacité de NTC de négocier avec succès toutes les phases d'absorption et d'activation, fournir des évaluations plus pertinentes et spécifiques de l'activité de la toxine. Alors que le député est l'étalon-or de la détection BoNT, ce est une méthode in vivo qui utilise la mort comme un point final et a donc une utilité limitée en tant que plate-forme de recherche. Les tentatives visant à développer des modèles à base de cellules de CNT intoxication propice aux études mécanistes et ciblage thérapeutique ont également subi des limites importantes. Bien que des cultures de neurones primaires offrent un haut degré de pertinence physiologique, leur utilisation est compliquée par un certain nombre de facteurs, y compris le coût élevé des ressources, rendement relativement faible, la présence de multiples sous neuronaletypes et vaste surveillance réglementaire et administratif impliqué dans l'utilisation des animaux. Comme alternative aux neurones primaires, les lignées cellulaires neurogènes (qui peuvent être induits à adopter des propriétés analogues à des neurones par stimulation chimique) telles que les neuroblastomes et les cellules chromaffines surrénales ont été utilisés comme modèles in vitro de l'intoxication. Étant donné que ces cellules sont cultivées en continu avant l'induction, elles sont très évolutif et donc bien adapté pour les approches débit modéré. Cependant, leur pertinence est contestable, car les phénotypes induits sont généralement hétérogènes, sont faiblement sensible à nanotubes de carbone et ne parviennent pas à présenter des comportements neuronaux critiques, y compris l'incapacité de former des compartiments pré- et post-synaptiques qui se assemblent en synapses fonctionnent 4. En l'absence de compartiments présynaptiques physiologiquement intactes, la gamme complète de la toxine: interactions neuronales ne peut être reproduit et donc des mesures fonctionnelles d'intoxication ne sont pas possibles 5. Aucunt étonnamment, tente de mener des études mécanistes ou le criblage de médicaments pour BoNTs utilisant des lignées cellulaires induits neurogène ont abouti à des conclusions qui sont incompatibles avec les études in vivo et de neurones primaires 6.
Il a été proposé que les souches du système nerveux central (SNC) neurones dérivés de cellules peuvent fournir une plate-forme à base de cellules de nouvelle génération pour la recherche BoNT qui combine la pertinence de neurones primaires avec la flexibilité des lignées cellulaires cultivées 7-10. En particulier, les neurones dérivés de cellules souches de souris (ESN) ont été trouvés pour être très sensibles à des doses physiologiques de BoNT / A / G et de reproduire un grand nombre de réponses in vivo à l'intoxication, y compris les persistances différentielles, intoxication activité augmentée, et le sérotype puissances spécifique de 5,8,11. Ces comportements suggèrent que dans les mécanismes in vivo de BoNT absorption, le traitement, le trafic et l'activité sont conservées dans ESN. Cependant, l'inhibition de activit synaptiquey est la manifestation de la signature du botulisme, et donc démontrer une perte de l'activité synaptique suivant l'intoxication par NTC est essentiel avant de conclure que ESN sont appropriés dans le modèle in vitro à base de cellules dérivées d'études de la CNT.
Pour mesurer les effets de l'intoxication avec NTC sur l'activité synaptique, cellule entière patch-clamp électrophysiologie a été utilisée pour quantifier courants monosynaptiques dans 21 + ESN traités avec le véhicule ou DIV CNT-traitée. Nous avons trouvé que l'intoxication de ESN avec BoNT / A / G ou TeNT causé la perte de l'activité synaptique> 95% dans les 20 heures dans tous les cas. Une caractérisation plus poussée effectuée 20 heures après l'intoxication à BoNT / A a montré un effet dose-dépendante de l'activité synaptique, avec une limite de détection en dessous de 0,005 pM et une valeur de CI50 de 0,013 pM. Ces résultats indiquent que le cadre de la détection électrophysiologique d'intoxication sensibilité et l'heure sont considérablement améliorée au cours comparables ana base immuno-lyses de SNAP-25 clivage in vivo et dosages de la létalité de la souris, ce qui démontre que les mesures fonctionnelles de l'intoxication dans des cultures de neurones synaptique actifs peuvent faciliter méthodes plus sensibles, spécifiques et rapides pour caractériser la réponse cellulaire à la BoNT.
Protocol
1. Adaptation des CES sur Chargeur Suspension acellulaire Culture
- CES dégel à 37 ° C jusqu'à ce qu'un ruban de glace reste.
- En utilisant une pipette P1000, transférer délicatement 1 à 2,5 x 10 6 dissocié CES à une boîte de culture traitée non-tissu contenant 10 ml de milieu ESC préchauffé. Incuber dans un incubateur humidifié de culture tissulaire pendant 20 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après 20 h, laver les cellules par le transfert en douceur la culture en suspension dans un tube de 15 ml conique en utilisant une pipette 10 ml sérologique. Pellet CES pendant 3 min à 200 x g. Lors de l'essorage, ajouter 10 ml de milieu frais ESC retour à plat à faible adhérence.
- Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas déloger le culot cellulaire, et ajouter 1 ml de milieu ESC frais au culot cellulaire. Transférer les cellules à l'antenne bactérienne en utilisant une pipette P1000 et revenir à l'incubateur.
- Observez cellules tous les jours jusqu'à agrégats deviennent visibles à l'œil nu (typiquement 4-8 jours (D); agrégats seront 0,2- 0,5 mm). Si agrégats ne sont pas apparents après 4 d, répétez l'étape 1.3. Une fois agrégats sont visibles, de dissocier et de maintenir CES comme décrit dans la section 2.
2. ESC repiquage et entretien
- Transfert ESC agrège à un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette stérile de 10 ml et laisser les agrégats de se déposer à une pastille compacte (typiquement de 3 à 5 min). Aspirer le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire, et laver agrégats avec 5 ml de PBS. Bien que la gravité décantation est recommandé cellules, alternativement pellets à 100 g pendant 2,5 min au lieu de gagner du temps.
- Aspirer PBS et ajouter 500 ul trypsine. Incuber agrégats dans trypsine pendant 3 minutes dans un bain d'eau à 37 ° C. Ajouter 500 ul moyenne ESC pour diluer la trypsine et doucement triturer 10 fois avec une pipette P1000 pour briser les agrégats. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Pellet dissocié les cellules pendant 3 minutes à 200 xg de cellules et remettre en suspension à une concentration finale de 1,0x 10 7 cellules / ml dans un milieu ESC. Transfert 150 pi (1,5 x 10 6 cellules) à 10 ml de milieu ESC frais dans un plat bactérienne 10 cm et revenir à la culture tissulaire incubateur pendant 48 heures. CES en excès peuvent être différenciés, cryoconservés à 1-5 x 10 6 cellules / ml dans du milieu de l'ESC à 90% supplémenté avec 10% de DMSO, ou mis au rebut.
- Passage agrège toutes les 48 heures. Granulats prêts pour le passage seront clairement visibles, avec des diamètres supérieurs à 0,5 mm.
NOTE: Le dégel et la culture de cellules congelées, suspension adaptée sont accomplies par étapes 1.2 à 1.4. Agrégats seront prêts pour repiquage dans les 48 à 72 heures.
3. Différenciation Neuronale
REMARQUE: conduite étapes 3.1 à 3.5 avant midi et après l'étape 3.7 midi. Une vue d'ensemble des procédures de différenciation est présentée à la figure 1A.
- Dissocier CES comme dans les étapes 02.01 à 02.05. Transfert 350 pi (3,5 x 10 6) de dissocierCES D à un plat de 10 cm à faible attachement contenant 25 ml de milieu de différenciation. Placer sur un agitateur orbital réglé à 30-45 min dans un incubateur de culture de tissus à 37 ° C avec 5% de CO 2. Il se agit du premier jour de différenciation, dite jours in vitro (DIV) -8.
NOTE: L'utilisation d'un plat de fixation ultra-faible augmente le coût de la méthode, mais légèrement plus gros rendements que des plats de Pétri bactériennes depuis agrégats peuvent parfois adhérer à des boîtes de Pétri. Si différentes tailles de vaisselle sont préférés, les volumes moyens et le nombre de cellules peuvent être mises à l'échelle en conséquence. - Après 48 h (-6 DIV), en utilisant une pipette 25 ml de transférer les agrégats de cellules de différenciation dans un tube conique de 50 ml. Ajouter immédiatement un nouveau 25 ml de milieu de différenciation de la boîte de Pétri.
- Permettre aux agrégats de se installer sur 2-5 min, produisant une pastille visible qui est de 1 à 2 mm de profondeur. Ignorer cellules individuelles ou de petits agrégats restant en suspension. Aspirer soigneusement le moyen et transférer la CEll culot revenir à la boîte de Pétri en utilisant un P1000. Placer sur un agitateur rotatif dans un incubateur de culture de tissu.
- Au répétez l'étape de DIV 3.2. Le culot sera 2-4 mm de profondeur. Remplacer 30 ml de milieu de différenciation complété avec 6 uM all trans-acide rétinoïque (RA) à la boîte de Pétri. Retour à agitateur rotatif dans l'incubateur de culture tissulaire pendant une heure 48 supplémentaire.
- Au répétez le pas de 3,3 DIV. Le culot sera 4-8 mm de profondeur à ce stade.
- A DIV -1, préparer les surfaces placage comme dans la section 4.
- A DIV 0, décongeler 5 ml de milieu de pré-aliquotés et congelés trypsinisation PNJ à 37 ° C pendant 5 à 10 min et le lieu dans une hotte de culture de tissus. L'utilisation d'une pipette de 25 ml, le transfert de différenciation des agrégats dans un tube conique de 50 ml. Permettre aux agrégats de se installer et à moyen attentivement aspiration. Laver culot deux fois avec 10 ml de PBS, permettant aux agrégats de se installer entre les lavages.
- Après le second lavage PBS, ajouter 5 ml de milieu de trypsinisation PNJ au culot et incuber à 376; C pendant 5 min. Tapotez doucement le tube après 2,5 min.
- Ajouter 5 ml d'inhibiteur de trypsine de soja 0,1% (STI) pour inactiver la trypsine et mélanger en inversant. Triturer doucement de 10 à 15 fois avec une pipette sérologique de 10 ml jusqu'à ce qu'une suspension de cellules relativement homogène est produit.
- Lentement transférer la suspension cellulaire à un tamis cellulaire de 40 pm ou 70 pm placée dans la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml. Une fois que tous la suspension a été filtrée, ajouter 1 ml de milieu N2 à laver les cellules restantes à travers le filtre et sédimenter la suspension cellulaire dissociée pendant 6 minutes à 200 x g.
- Aspirer le milieu sans perturber le culot. Laver les cellules deux fois avec 10 ml de milieu N2, la granulation des cellules pendant 5 minutes à 200 xg et trituration avec un lavage entre P1000. Avant le second lavage, compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Resuspendre les cellules dans du milieu N2 à 1 x 10 7 cellules par ml et ESN plaque à une densité cellulaire de 150 000 - 200 000 cellules / cm 2.
- Transfert nouvellement Plated ESN à un incubateur humidifié de culture de tissu à 37 ° C et 5% de CO 2 et de maintenir comme dans la section 5.
4. Préparation Culture Surfaces Placage Neural précurseurs au DIV 0
- Préparer des boîtes de culture de tissus traités au moins un jour avant le placage. Ajouter polyéthylèneimine suffisante (PEI; 25 pg / ml dans H stérile 2 O) ou poly-D-lysine (PDL; 100 pg / ml dans H stérile 2 O) pour couvrir culture tissulaire traitée plats en plastique et incuber O / N à 37 ° C.
- Le matin de placage, laver deux fois avec des plats bidistillée H 2 O et une fois avec du PBS. Après le lavage final, ajouter du milieu N2 suffisant pour couvrir le plat (par exemple, 1 ml par puits d'un plat de 12 puits ou 4 ml par 6 cm plat).
- Préparer 18 mm lamelles de verre au moins un jour avant neurone placage. Nettoyer les lamelles plasma nettoyage pendant 4 min.
- Transférer immédiatement lamelles nettoyées à un parafilm lavé à l'éthanol dans le fond d'ungrand plat stérile et ajouter 400 ul de solution de PEI ou PDL, préparés comme dans l'étape 4.1. Incuber O / N à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissu.
- Dans la matinée, lamelles de lavage trois fois à l'eau et ajoutez 5 ug / ml de laminine dans du PBS pendant 1-3 heures à 37 ° C. Avant de dissocier les neurones, aspirer le laminine et transférer immédiatement la lamelle à un puits d'une plaque à 12 puits contenant 1 ml de milieu PNJ, en étant sûr de garder la face traitée vers le haut.
- plats de magasins et des lamelles à 37 ° C jusqu'à ce que les PNJ sont prêts à l'assiette.
5. Maintien de neurones
- A DIV 1, moyen d'aspiration et le remplacer par un milieu de culture N2.
- A DIV 2 et 4, moyen d'aspiration et le remplacer par un milieu de culture B27.
- A huit DIV, moyen d'aspiration et le remplacer par un milieu de culture contenant des inhibiteurs mitotiques B27 à éliminer le contaminant des cellules non neuronales.
- A DIV 12, remplacer par un milieu de culture B27.
- Ne retirez pas DIV12 + ESN de 5% de CO 2 jusqu'au moment de servir.
6. Inhibition mesurée de la transmission synaptique (MIST) Assay pour quantifier miniatures courants excitateurs post-synaptiques
ATTENTION: Les neurotoxines clostridiennes sont les substances les plus toxiques connus, avec une estimation de LD humaine 50 valeurs aussi basses que 0,1 à 1 ng / kg. Obtenir les approbations nécessaires avant d'utiliser ces toxines et les précautions appropriées.
- Diluer avec précaution BoNT / A à 100x la concentration finale souhaitée en milieu de culture ESN et chaleureux à 37 ºC. Ajouter le volume approprié de toxine pour DIV 21 + ESN cultures, agiter la boîte de culture, et revenir à l'incubateur.
- Si les cellules sont analysées plus de 4 heures après l'intoxication, l'ajouter à la toxine plat et sans enlever tourbillon de 5% de CO 2, par exemple directement dans l'incubateur ou dans une chambre constant CO 2.
- Au point de temps approprié, aspirationste ESN milieu de culture et laver deux fois avec le tampon d'enregistrement extracellulaire (ERB). Ajouter 4 ml d'ERB complétés avec 5,0 uM de tétrodotoxine et 10 uM bicuculline, le blocage des potentiels d'action et d'antagoniser les GABA A l'activité du récepteur, respectivement.
- Transfert plat à électrophysiologie gréement. Ni perfusion ni contrôle de la température est nécessaire pour le dosage de MIST.
- Tirer verre de borosilicate en utilisant un étirage de micropipettes pour produire une pipette d'enregistrement avec 10.5 mW de résistance et remplir avec du tampon d'enregistrement intracellulaire. Tremper délicatement la pipette d'enregistrement rempli siliconisation réactif avant l'enregistrement.
- L'utilisation d'une seringue remplie d'air, de fournir une pression positive que la pipette d'enregistrement est abaissée dans la ERB. Après l'atterrissage en douceur de la pipette d'enregistrement sur le soma du neurone à être enregistrée, retirer une pression positive et former un gigaseal. Diminuer la tension de maintien à -70 mV. Appliquer soigneusement pression négative de percer dans la configuration cellule entière.
- Passez à courant pince pour surveiller et enregistrer potentiel de repos de la membrane. Sans ajustement de potentiels de jonction de liquide, le potentiel de membrane de repos sera comprise entre -67 à -82 mV.
- Effectuer un -70 mV enregistrement continu voltage-clamp pour 4-5 min à détecter décoratifs courants excitateurs post-synaptiques (mEPSCs).
- Analyser 4 min de données enregistrées pour la détection mEPSC en utilisant un logiciel de détection de pic avec les paramètres suivants: Seuil, 5; Période à rechercher un maximum local, 10 000 ps; Temps avant un pic pour référence, 5000 ps; Période à rechercher un temps de décroissance, 20000 ps; Fraction du pic de trouver un temps de décroissance, 0,37; Période de moyenner une base de référence, 1000 ps; seuil de salon, 20; Nombre de points à crête moyenne, 1; Direction du pic, négative.
- Recueillir et enregistrer des informations sur les événements détectés. Diviser le nombre d'événements détectés à 4 min par 240 pour déterminer la fréquence en Hz mEPSC.
- Recueillir fréquences mEPSC pour 8-12 suiterols et 8-12 échantillons BoNT-traités pour chaque condition d'exposition. Analyser la fréquence contre l'âge et les contrôles de lots appariés. Déterminer la signification statistique de% d'inhibition de l'activité synaptique en utilisant une voie tests ANOVA et le test post-hoc de Dunnett.
Representative Results
Nous avons mis au point un protocole de différenciation qui permet la production économique de grandes quantités de neurones dérivés de cellules souches de haute pureté à partir de souris CES (détaillée à la figure 1A) 8,11. Cette méthode a été utilisée sur une période de plusieurs années de différencier reproductible générés privé et disponibles dans le commerce lignées de CSE dans les neurones de lignées définies 12-14. Les éléments essentiels de ce protocole comprennent (1) l'adaptation des CES sur Chargeur culture en suspension acellulaire; (2) un bon entretien des cultures de suspension; et (3) la différenciation dans des conditions rotatifs. Transition à la culture de suspension réduit considérablement le temps et le coût de l'entretien ESC, et évite la nécessité de supprimer des cellules nourricières avant différenciation. Après la suspension adaptation, Oct3 / 4 expression est conforme à travers au moins 30 passages, indiquant que la suspension adaptation ne modifie pas l'expression des marqueurs de pluripotence (figure 1B-D 7 cellules par passage. Cela se produit généralement dans les dix passages après la suspension adaptation ou cinq passages après décongélation des CES qui étaient auparavant suspension adaptés. Rotation mécanique de différencier les agrégats se est également avérée être critique pour le rendement neuronale accrue. L'addition d'un agitateur rotatif éliminé formation super-ensemble, ce qui augmente la viabilité et la production d'un agrégat ~ augmentation de 300% du rendement en cellules progénitrices neurales (CNP) à 0 DIV (figure 1E).
Une différenciation typique commence avec 3,5 x 10 6 CES au DIV -8 et produit 115 x 10 6 PNJ à 0 DIV, environ 60% de ce qui survivront jusqu'à devenir des neurones. Les 40% restants comprennent des cellules non-neuronales et sont en grande partie éliminé par la privation de sérum entre DIV 0 - 1. Le petit nombre de cellules gliales persistant peut être éliminé par addition d'hab mitotiquesibitors de DIV 2-4 ou DIV 8 - 12. densité de placage est critique à DIV 0; neurones plaqués trop faiblement ne seront pas survivre au-delà de 2 semaines. Quelques jours après le placage, les neurones différenciés présentent des morphologies neuronales et compartimentent protéines neurotypic, comme le MAP2 marqueur somatodendritique et le marqueur axonale Tau (figure 2A). Par DIV 14 synapsine-1 + puncta peuvent être identifiés au niveau des interfaces axodendritiques, évocateurs de la formation des synapses. Ceci est cohérent avec l'expression de protéines marqueurs synaptiques avant DIV 7 8,11. Morphologies neuronales continuent de se développer à travers DIV 21, au cours de laquelle les cultures de temps présenter tonnelles de axodendritiques élaborés et grande puncta synaptique (figure 2A). Si elle est maintenue de manière appropriée, ESN restent viables et actif pendant au moins 4 semaines après placage.
Profilage d'expression longitudinale utilisant l'ARN-séquençage de preuves corroborant morphologique et protéomique de la spécification neuronale uneD maturation 11,15. Marqueurs représentatifs de progression du développement présentaient des profils d'expression spécifiques au stade, y compris Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN et KCC2 (figure 2B). Par DIV 0, ESN exprimé copies abondantes de protéines structurales spécifiques des neurones, y compris MAP2 et Tau. Conformément aux résultats précédents, marqueurs pour seulement deux sous-types de neurones ont été observés: les neurones glutamatergiques mésencéphale / cerveau postérieur VGLUT2 exprimant et des interneurones GABAergiques 8. En conséquence, un large éventail de glutamatergiques et GABAergiques marqueurs présentait de fortes hausses d'expression entre 0 et DIV DIV 7, y compris les protéines SNARE pré-synaptiques nécessaires à la libération de neurotransmetteurs; récepteurs de neurotransmetteurs nécessaires pour les réponses post-synaptiques; et les protéines d'échafaudage nécessaires pour attacher ces récepteurs à la membrane post-synaptique. Les neurones présentent des caractéristiques électriques intrinsèques matures par DIV 14 et les courants post-synaptiques excitateurs miniatures spontanés par DIV16 16.
L'inhibition mesurée de la transmission synaptique (MIST) test a été utilisé pour évaluer l'effet de l'intoxication sur l'activité synaptique. En comparant les fréquences mEPSC entre DIV ivre et traité avec le véhicule 24 + ESN, MIST fournit une mesure quantitative et spécifique d'intoxication basée sur l'inhibition de l'activité synaptique fonctionnelle (figure 3A). MIST a été utilisé pour mesurer les effets de BoNT / A / G ou une tente sur l'activité synaptique dans ESN à 20 h après l'addition de bain de chaque toxine. Les toxines ont été ajoutés à une concentration équivalente à 10 fois la valeur de CE 50, déterminée antérieurement par analyse par immunotransfert des protéines SNARE 11 clivage. Tous les toxines fréquences réduites mEPSC à moins de 5% des témoins traités avec le véhicule. Les réductions des taux synaptiques ne étaient pas imputables à la mort cellulaire ou des réponses intrinsèques modifiés, depuis ESN en état d'ébriété étaient susceptibles d'être patché, tiré potentiels répétées d'actionen réponse à l'injection de courant et montré aucun changement significatif dans le potentiel de membrane au repos (figure 3B, C).
Pour comparer la sensibilité de MIST aux méthodes existantes pour détecter NTC, la limite de détection et la concentration inhibitrice médiane (IC 50) ont été déterminées 20 heures après l'addition de la BoNT / A à ESN. L'intoxication par aussi peu que 0,005 pM BoNT / A a produit une réduction statistiquement significative de la fréquence mEPSC, avec une valeur CI50 de 0,013 pM et silencieux complet de l'activité synaptique dessus 24:05 (figure 4A). Cette valeur IC 50 correspond à environ 0,5 unités mortelles de souris / ml, ce qui suggère que MIST est deux fois plus sensible et de 2 à 4 fois plus rapide que le député à détecter la présence de la BoNT / A. Les mesures de immunotransfert de SNAP-25 clivage produit une valeur CE 50 de 24:38 et une dose minimale détectable de 12:05, ce qui indique que MIST est environ 30 fois plus sensiblede détection à base de protéines immuno-SNARE fendues (figure 4B).
Figure 1. ESN de suspension adaptés restent mitotiquement stable et expriment des marqueurs de pluripotence. (A) Schéma de l'ESC entretien et la différenciation. La présence ou l'absence de l'acide rétinoïque (RA) ou le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) est marqué par un + ou -. Une comparaison entre les jours in vitro (DIV) et les stades de développement classiques (DS) pour des cultures de neurones primaires est prévu 17. Taux (B) Prolifération des R1, D3 et des lignées cellulaires de souris C57BL / 6J ES stabilisent par cinq passages après passage à une culture en suspension. (C) La cytométrie en flux données démontrent aucun changement de fond dans Oct3 / 4 expression dans le R1, D3 et des lignées cellulaires C57BL / 6J ES mesurée sur 25 passages en culture de suspension (n = 6 pour chaque). (D) des rendements cellulaires réels au cours des passages de routine pour une ligne R1 ESC suspension adaptée mesurée entre les passages 5 et 30 (ligne noire). Rendements cumulatifs théoriques si aucun cellules sont éliminés lors de passages sont également présentés (ligne rouge). (E) images Bright-terrain de DIV 0 granulats produites dans des conditions statiques (à gauche) ou les conditions de rotation (droite). Conditions Rotary produits agrégats sphériques sans agglomération et augmenté NPC donne trois fois (p <0,001, déterminées en utilisant le test t de Student) 11. * Indique un p <0,05. Ce chiffre a été modifié depuis Hubbard et al. 11 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. morphologique, proteomic preuves et transcriptomique de la spécification et de la maturation neuronale (A) Immunocytochimie de DIV 7 -. DIV 49 démontre arborisation neuronale et l'apparition de points lacrymaux synaptique au niveau des interfaces axodendritiques. Les axones sont étiquetés avec Tau (vert), les dendrites sont étiquetés avec MAP2 (rouge), compartiments pré-synaptiques sont étiquetés avec synapsine (blanc), et les noyaux sont colorés avec du DAPI (bleu). (B) l'expression longitudinale profilage des gènes représentatifs démontrant l'expression spécifique du stade de développement et précisant les sous-types de neurones. Toutes les transcriptions de gènes sont exprimés en nombre approximatif de transcriptions par cellule. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. ESN sous. rendre inhibition de l'activité synaptique lorsqu'il est exposé à BoNT / AG et tente (A) traces représentatifs de ESN recueillies 20 h après l'addition de bain de ~ 10 x 50 CE valeurs de BoNT / A - / G, tente ou véhicule. Chaque neurotoxine activité synaptique réduite de plus de 95% par rapport aux témoins. (B) neurones en état d'ébriété sont restés capable de tirer les points d'accès répétées en réponse à la dépolarisation injection de courant (comme démontré pour BoNT / A, mais observé dans toutes les cultures en état d'ébriété) et (C) présentait aucun changement dans la membrane de repos négatif potentiel (C; n> 18 pour chaque traitement). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Détermination de la sensibilité de brume dans BoNT / A-traitéESN. (A) Les mesures de brouillard de l'activité synaptique 20 heures après l'addition de bain de BoNT / A. Représentant de potentiel imposé segments de traces présentaient une diminution de la fréquence mEPSC suivante BoNT / A exposition (côté gauche). La quantification de la fréquence mEPSC (graphique à barres, côté droit, n = 20 pour les contrôles; n = 11 à 22 pour chaque dose) confirme une diminution dose-dépendante de la fréquence mEPSC. La concentration inhibitrice médiane a été déterminée par un ajustement par moindres carrés d'une régression non linéaire en utilisant une pente variable à quatre paramètres (R 2> 0,91). Notez la limite de détection par MIST en ESN est au moins 0,005 pM. (B) BoNT / A l'intoxication des résultats ESNS clivage de SNAP-25 visualisé par des changements de mobilité de gel (un western blot représentant sur le côté gauche avec une quantification barre graphique montrant de SNAP-25 clivage sur le droit; n = 4) . Notez la diminution de sensibilité en utilisant la protéine SNARE clivage (SNAP-25) comme critère d'évaluation (CE 50 de 12h36) vs. 50 de 0,013 pM). * Indique un p <0,05; *** Indique un P <0,001. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
La norme de référence actuelle pour la détection CNT, la détermination et la quantification de sérotype est le député. Le MLA interroge l'ensemble de la gamme de l'hôte: clivage interactions de toxine nécessaires pour intoxication à se produire in vivo (par exemple, liaison de la toxine à un récepteur de surface cellulaire, l'internalisation du complexe toxine-récepteur, LC translocation dans le cytoplasme, LC-médiée de substrat et inhibition de la neurotransmission synaptique) 18. Cependant, bien que le député propose un modèle physiologiquement pertinente de l'intoxication, il est gourmand en ressources, peut être confondu par des contaminants et implique un grand nombre de souris avec la mort comme point final. En variante, des dosages à base de cellules pour la détection et la quantification de la BoNT ont été limitées à des cultures de neurones primaires, qui nécessitent également l'utilisation des animaux ou à des lignées de cellules de neuroblastome qui ne parviennent pas à former des synapses et présentent généralement une faible sensibilité à des neurotoxines 8. À ce jour, la plupart des mesures d'intoxication dans edes plates-formes à base de cellules ESE sont appuyés sur la détection du clivage protéolytique de la SNAP-25, VAMP1 / 2 ou la syntaxine-1 11. Cette situation est problématique parce que la protéine SNARE de clivage a été démontré que de façon non linéaire associée à l'inhibition synaptique in vivo et par conséquent peut ne pas représenter exactement intoxication ou la récupération à partir de 19,20 intoxication.
Un système de modèle idéal à base de cellules pour la détection CNT serait (i) être basée neurone; (Ii) être couplé avec synaptique réponses électriques neurotypic; (Iii) être très sensibles à tous les sérotypes CNT ou sous-types; et (iv) l'offre évolutivité, débit et d'analyse des moments qui sont équivalentes ou améliorées au cours de la MLA, à moindre coût, et sans nécessiter l'utilisation d'animaux. Pour répondre à ces exigences, nous avons développé une méthode pour produire de grandes quantités de cultures hautement enrichi, réseau de neurones GABAergiques glutamatergique et disponibles dans le commerce à partir de lignes ESC de la souris. Nous avons ensuite développé le test MIST à quantifierinhibition synaptique en réponse à l'intoxication avec tente et BoNT / A / G. Bien que l'essai MIST peut être réalisée sur une population de neurones des synapses actives (par exemple, les neurones primaires ou des tranches de cerveau), actuellement ESN sont vitro dérivée modèle de neurone que dans cet développe reproductible comportements de réseau émergentes et est donc approprié pour le dosage de MIST.
Produire des quantités suffisantes de neurones de la lignée défini pour les études CNT a nécessité plusieurs innovations dans la culture et la différenciation ESC. Tout d'abord, en sélectionnant pour la culture et les CES qui peuvent survivre suspension adaptation, nous avons éliminé le risque de contamination par des cellules nourricières et la nécessité de purifier les cellules nourricières du CES au début de la différenciation. Bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents suspension adaptation sont inconnues, les CES de suspension adaptés restent mitotiquement actif, conserver Oct3 / 4 expression et continuent d'être neurogène. En utilisant cette méthode, 1,5 x 10 ~ 7 ESC sont généralement récupérés chaque passage. Deuxièmement, la production de NPC a été augmentée de 300% ~ en incorporant une agitation mécanique pour empêcher l'agglomération pendant la différenciation, ce qui augmente l'accessibilité ostensiblement nutriments à l'intérieur des agrégats. Pendant le processus, nous avons constaté que le sérum utilisé pour la culture ESC et la différenciation neuronale est l'élément le plus crucial dans le maintien CES neurogène. Pour un meilleur succès, nous recommandons la suspension adapter cellules ES à chaque lot de sérum et le stockage du sérum à -20 ° C pour soutenir la culture et la différenciation neuronale ESC jusqu'à la date d'expiration.
Comme avec la plupart des cultures synapses actives, DIV 14 + ESN sont très sensibles aux changements brusques de pH, et même une brève exposition à des concentrations atmosphériques de CO 2 peuvent entraîner la neurotoxicité dans les 24 heures. Pour les expériences nécessitant un traitement des cultures suivie par des incubations durables O / N ou plus, les neurones doit être traité directement in l'incubateur ou transférés à une chambre constante CO 2 avant l'expérimentation.
Une variété de techniques confirmé la neurogenèse et la maturation neuronale, y compris CPI, le profilage de la transcription et de cellules entières de patch-clamp électrophysiologie. Les changements temporels dans l'expression génique et la morphologie des neurones étaient compatibles avec une progression rapide à travers les stades de développement de la neurogenèse, et en DIV 16, ESN exposées excitateurs et courants post-synaptiques inhibitrices miniatures avec le réseau émergent de comportements particuliers 16. Preuve de l'activité synaptique suggéré que ESN peut reproduire les pathophysiologies responsables des manifestations cliniques de botulisme et le tétanos. Cela a été confirmé en utilisant MIST pour montrer que l'intoxication BoNT / A / G ou une tente avec facultés affaiblies mEPSC fréquences par> 95% par rapport aux neurones de véhicules-traitée ou non.
Les mesures de la sensibilité du MIST pour BoNT / A indiqué une inhibitrice médianeconcentration (CI50) de 0,013 pM (équivalent à 0,5 souris létale unités / ml) et une limite de détection-dessous 0,005 pM, mesurée à 20 h après l'addition du bain. Sur la base de ces valeurs, MIST est environ deux fois plus sensible au fur et à 2-4 fois plus rapide que le MLA et 30 fois plus sensible que la détection basée sur des immuno-SNAP-25 clivé.
Collectivement, ces données suggèrent que les populations réseau de neurones dérivés de cellules souches offrent un modèle physiologiquement pertinente, à base de cellules d'intoxication. En combinaison avec des méthodes améliorées pour tirer cultures ESN réseau de CES de suspension adaptée, l'utilisation de MIST devrait réduire la nécessité de l'expérimentation animale et les inconvénients associés, les coûts et les préoccupations éthiques de la MLA tout en fournissant une mesure plus rapide, sensible et spécifique de intoxication. L'ensemble de cellules de patch-clamp électrophysiologie est une méthode à faible débit pour identifier la présence de neurotoxines actifs, il offre une résolution et SPEed qui est irréalisable en utilisant des méthodes moléculaires. Ces résultats fournissent également des preuves que l'application des méthodes dépendants de l'activité d'évaluer l'activité synaptique et le comportement du réseau peut permettre la détection rapide et spécifique des neurotoxines. Ces approches plus-débit feraient des études mécanistes, ciblage thérapeutique ou tests de diagnostic possibles pour un large éventail d'agents neuromodulateurs, y compris les NTC.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les National Institutes of Health Institute national des allergies et des maladies infectieuses (nombre AAI AOD12058-0001-0000) et la Defense Threat Reduction Agency - Bureau technologique conjointe des sciences et de médecine Division S & T (numéros de subvention CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 et CBM.THRTOX.01.RC.014). Cette recherche a été effectuée alors que PB a tenu une réduction Defense Threat Research Associateship prix du Conseil de recherches Agence nationale et KH a tenu une recherche Associateship Prix du Conseil national de recherches. Nous remercions Angela Adkins et Kaylie Tuznik (USAMRICD) pour l'assistance technique; et Cindy Kronman (USAMRICD) pour l'assistance éditoriale. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique officielle du Département de l'Armée, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
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