Abstract
Studi terapeutici e meccanicistici delle neurotossine clostridi presinapticamente mirati (CNT) sono stati limitati dalla necessità di un modello scalabile a base di cellule che produce sinapsi funzionanti e subisce risposte fisiologiche di intossicazione. Qui si descrive un metodo semplice e affidabile per differenziare efficacemente cellule murine embrionali staminali (ESC) in linee definite, neuroni in rete sinapticamente attivi. A seguito di un protocollo di differenziazione 8 giorni, i neuroni derivati da cellule staminali embrionali di topo (ESN) rapidamente esprimere e compartimenti stagni proteine neurotypic, formano morfologie neuronali e sviluppare risposte elettriche intrinseche. Con 18 giorni dopo la differenziazione (DIV 18), ESN mostrano glutamatergico attivo e γ-aminobutirrico (GABA) sinapsi Ergic e comportamenti di rete emergenti caratterizzati da un eccitatoria: equilibrio inibitorio. Per determinare se l'intossicazione con CNTs antagonizza funzionalmente sinaptica neurotrasmissione, replicando così the in vivo fisiopatologia che è responsabile di manifestazioni cliniche di botulismo o tetano, whole-cell patch clamp elettrofisiologia è stato utilizzato per quantificare in miniatura correnti spontanee eccitatorie post-sinaptiche (mEPSCs) in ESN esposti a tetano neurotossina (tenda) o neurotossina botulinica (BoNT) sierotipi / A- / G. In tutti i casi, ESN esposto quasi completa perdita di attività sinaptica all'interno di 20 ore. Neuroni rimasti intossicati vitale, come dimostrano invariato potenziali di membrana a riposo e le risposte elettriche intrinseche. Per caratterizzare ulteriormente la sensibilità di questo approccio, effetti dose-dipendente di intossicazione sull'attività sinaptica state misurate 20 ore dopo l'aggiunta di BoNT / A. Intossicazione con 0.005 pM BoNT / A determinato un decremento significativo mEPSCs, con una concentrazione inibitoria mediana (IC 50) di 0,013 pM. I confronti di dosi mediane indicano che le misurazioni funzionali di inibizione sinaptica sono più veloci, più specifico e più sensibile di SNAREsaggi scissione o il test del mouse letalità. Questi dati convalidano l'uso di sinapticamente accoppiati, staminali neuroni derivati dalle cellule per il rilevamento altamente specifico e sensibile del CNT.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare funzionalmente l'attività sinaptica in culture di rete di neuroni derivati dalle cellule staminali esposti a neurotossine clostridi. Questa è la prima dimostrazione di un modello in vitro derivato che replica funzionalmente le pathophysiologies responsabili di manifestazioni cliniche di botulismo e convalida ESN come un modello adeguato per il rilevamento di CNT, lo screening terapeutico e studi meccanicistici.
BoNT sono neurotossine batteriche altamente letali prodotti dai membri della specie Clostridium. Compresa la recente proposta di BoNT / H, otto sierotipi BoNT antigenicamente distinti sono stati descritti (/ A- / H) 1,2. Tutti i sierotipi sono espressi in 150 peptidi kDa che sono post-traduzionali intaccate per produrre un dichain composto da 100 kDa catena pesante (HC) e 50 kDa catena leggera (LC) collegati da un legame disolfuro 3. L'HC media legandosi ai recettori presinaptici e entry della tossina nel neurone tramite endocitosi sinaptica. Durante l'elaborazione endosomal, HC subisce riorganizzazione strutturale per formare un poro nella membrana delle vescicole, facilitando la traslocazione della LC nel citosol presinaptica. La LC poi rivolge in modo specifico e si unirà solubile N attaccamento fusione -ethylmaleimide sensibili recettori della proteina (militare) proteine nel vano presinaptico: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), Vamp2 (BoNT / B, / D, / F, / G) o sintaxina (BoNT / C) 1. Cleavage di qualsiasi di queste proteine SNARE impedisce l'assemblaggio della macchina esocitosi sinaptica, bloccando così il rilascio dei neurotrasmettitori. Questa combinazione di mirati ed efficaci neuronale e localizzazione presinaptica rende BoNT i veleni più potenti conosciuti, stimati con dosi letali umani a partire da 0,1-1 ng / kg 1.
Saggi biochimici possono essere utilizzati per rilevare la presenza o l'attività di CNT LC con elevata sensibilità. Tuttavia, questi metodi non riescono a interrogate la capacità della tossina di impegnare, immettere, attivare e funzione all'interno neuroni, e quindi sono misure indirette e possibilmente fuorvianti della presenza della tossina attiva. Al contrario, test funzionali di intossicazione, come il test del mouse letalità (MLA) globalmente valutare la capacità dei nanotubi di carbonio di negoziare con successo tutte le fasi di assorbimento e di attivazione, fornendo valutazioni più rilevanti e specifiche di attività tossina. Mentre la MLA è l'oro standard di rilevazione BoNT, è un metodo in vivo che utilizza la morte come punto finale e quindi ha utilità limitata come piattaforma di ricerca. I tentativi di sviluppare modelli basati su celle di CNT intossicazione adatto per gli studi meccanicistici e lo screening terapeutiche hanno subito significative limitazioni. Mentre colture neuronali primarie offrono un alto grado di rilevanza fisiologica, il loro uso è complicata da una serie di fattori, tra cui costo elevato risorsa, relativamente bassa resa, la presenza di più sub neuronaletipi e ampia sorveglianza regolamentare e amministrativo coinvolto con l'uso degli animali. Come alternativa ai neuroni primari, linee cellulari neurogenici (che possono essere indotti ad adottare simili ai neuroni proprietà di stimolazione chimica) come neuroblastomi e cellule cromaffini surrenale sono stati utilizzati come modelli in vitro di intossicazione. Dal momento che queste cellule sono continuamente coltivate prima dell'induzione, sono altamente scalabile e quindi adatto per approcci moderata di throughput. Tuttavia, la loro importanza è discutibile in quanto fenotipi indotti sono tipicamente eterogenei, sono poco sensibili al CNT e non riescono a mostrare comportamenti neuronali critici, tra cui l'impossibilità di formare compartimenti pre- e post-sinaptici che assemblano in sinapsi funzionanti 4. In assenza di compartimenti presinaptici fisiologicamente intatte, l'intera gamma di tossina: interazioni neurone non può essere replicata determinando quindi una misurazione funzionali di intossicazione non sono possibili 5. Not sorprendentemente, tenta di condurre studi meccanicistici o screening di farmaci per BoNT utilizzando linee cellulari neurogeni indotte hanno portato a risultati che non sono coerenti con studi in vivo e neuroni primari 6.
E 'stato proposto che derivano Sistema Nervoso Centrale (SNC) neuroni derivati dalle cellule possono fornire una piattaforma basata su celle di nuova generazione per la ricerca BoNT che unisce l'importanza di neuroni primari con la flessibilità delle linee di cellule in coltura 7-10. In particolare, i neuroni derivati dalle cellule staminali del mouse (ESN) sono stati trovati per essere molto sensibile alle dosi fisiologiche di BoNT / A- / G e di replicare molti nelle risposte vivo per intossicazione, tra cui persistenze differenziali, attività-enhanced intossicazione, e sierotipo potenze specifico d'5,8,11. Questi comportamenti suggeriscono che nei meccanismi vivo di BoNT captazione, trattamento, il traffico e l'attività si conservano in ESN. Tuttavia, l'inibizione di activit sinapticay è la manifestazione della firma del botulismo, e quindi dimostrando una perdita di attività sinaptica seguente intossicazione da nanotubi di carbonio è indispensabile prima di concludere che ESN sono adatti in vitro modello cellulare derivato per studi CNT.
Per misurare gli effetti di intossicazione con CNTs sulla attività sinaptica, whole-cell patch-clamp elettrofisiologia è stato utilizzato per quantificare le correnti monosinaptici in veicoli-trattati o CNT trattati DIV 21 + ESN. Abbiamo scoperto che l'intossicazione di ESN con BoNT / A- / G o tenda causato la perdita> 95% dell'attività sinaptica all'interno di 20 ore in tutti i casi. Un'ulteriore caratterizzazione condotto 20 ore dopo l'intossicazione con BoNT / A ha rivelato un effetto dose-dipendente dall'attività sinaptica, con un limite di rilevazione di sotto 0.005 PM e un valore di IC 50 di 0,013 pm. Questi risultati indicano che il telaio sensibilità e tempo di rilevazione elettrofisiologica di intossicazione sono considerevolmente migliorate nel corso paragonabile a base immunoblot-analisi di SNAP-25 scissione e in vivo test del mouse letalità, a dimostrazione che le misurazioni funzionali di intossicazione in colture di neuroni sinapticamente attivi possono facilitare metodi più sensibili, specifiche e rapide per caratterizzare la risposta cellulare al BoNT.
Protocol
1. Adeguamento dei CES di Feeder libero-Cell Suspension Cultura
- CES Scongelare a 37 ° C fino a quando una scheggia di ghiaccio rimane.
- Usando una pipetta P1000, delicatamente trasferimento 1 - 2,5 x 10 6 dissociato CES ad un piatto di coltura trattato non-tessuto contenente 10 ml di pre-riscaldato medio ESC. Incubare in un incubatore umidificato coltura tissutale per 20 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Dopo 20 ore, lavare le cellule trasferendo delicatamente la coltura in sospensione di un tubo da 15 ml con un 10 ml pipetta sierologica. Pellet CES per 3 min a 200 x g. Durante rotazione, aggiungere 10 ml di fresco medio ESC ritorna al piatto a bassa aderenza.
- Aspirare il surnatante, avendo cura di evitare di spostare il pellet, e aggiungere 1 ml fresca ESC medio alla cella pellet. Trasferire cellule al piatto batterica usando una pipetta P1000 e tornare al incubatore.
- Osservare le cellule ogni giorno fino aggregati diventano visibili a occhio nudo (in genere 4-8 giorni (d); aggregati saranno 0,2- 0.5 mm). Se aggregati non sono evidenti dopo 4 d, ripetere il punto 1.3. Una volta aggregati sono visibili, dissociarsi e mantenere CES come descritto nella Sezione 2.
2. ESC Passaging e manutenzione
- Trasferimento ESC aggrega ad un tubo da 15 ml con una sterile 10 ml pipetta e lasciare inerti di stabilirsi a un pellet compatta (in genere 3-5 minuti). Aspirare il surnatante, facendo attenzione a evitare interrompere il pellet, e lavare aggregati con 5 ml di PBS. Nonostante la gravità di assestamento si consiglia, in alternativa, le cellule pellet a 100 g per 2,5 minuti, invece di risparmiare tempo.
- Aspirare PBS e aggiungere 500 microlitri tripsina. Incubare aggregati in tripsina per 3 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungere 500 microlitri medio ESC per diluire la tripsina e delicatamente triturare 10 volte con una pipetta P1000 per rompere aggregati. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Pellet dissociato cellule per 3 min a 200 XG e risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 1,0x 10 7 cellule / ml in media ESC. Trasferire 150 ml (1,5 x 10 6 cellule) a 10 ml di fresco medio ESC in un piatto batterica 10 cm ed ritorno al tessuto cultura incubatore per 48 ore. CES in eccesso possono essere differenziati, crioconservati a 1-5 x 10 6 cellule / ml nel 90% medio ESC integrati con il 10% DMSO, o scartato.
- Passage aggrega ogni 48 ore. Aggregati pronti per il passaggio saranno chiaramente visibili, con diametri superiori a 0,5 mm.
NOTA: Scongelamento e la cultura di cellule di sospensione-adattato crioconservati sono compiuti passi per 1,2-1,4. Aggregati saranno pronti per passaging entro 48-72 ore.
3. neuronale Differenziazione
NOTA: Comportamento passaggi 3,1-3,5 prima di mezzogiorno e punto 3.7 dopo mezzogiorno. Una panoramica delle procedure di differenziazione è presentato nella Figura 1A.
- Dissociarsi CES come nei passaggi 2,1-2,5. Trasferire 350 ml (3,5 x 10 6) di dissocianod CES per un piatto a basso attaccamento 10 centimetri contenente 25 ml di mezzo di differenziazione. Inserire in un agitatore orbitale impostato 30 - 45 rpm in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO 2. Questo è il primo giorno di differenziazione, giorno definito in vitro (DIV) -8.
NOTA: L'uso di un piatto ultra-bassa attaccamento aumenta il costo del metodo, ma produce rese leggermente più grandi di piatti Petri batteriche dal aggregati occasionalmente possono aderire a piastre di Petri. Se si preferiscono diverse dimensioni del piatto, i volumi medi e il numero di cellule possono essere scalati di conseguenza. - Dopo 48 hr (DIV -6), utilizzare una pipetta 25 ml di trasferire gli aggregati cellulari differenziati in una provetta conica da 50 ml. Aggiungere immediatamente un fresco 25 ml di terreno di differenziazione alla piastra di Petri.
- Consentire aggregati di stabilirsi oltre 2 - 5 minuti, producendo un pellet visibile che è 1 - 2 mm di profondità. Ignora celle singole o piccoli aggregati che rimangono in sospensione. Aspirare accuratamente il supporto e trasferire il cell pellet torna alla capsula di Petri con un P1000. Posto su rotativo in un tessuto culturale incubatore.
- A DIV -4 ripetere il punto 3.2. Il pellet sarà 2-4 mm di profondità. Sostituire 30 ml di media differenziazione integrato con 6 micron tutto-trans retinoico (RA) al di Petri. Ritorno a rotativo nel tessuto culturale incubatore per un supplemento di 48 ore.
- A DIV -2 ripetere il punto 3.3. Il pellet sarà 4 - 8 mm di profondità a questo punto.
- A DIV -1, preparare le superfici placcatura come nella sezione 4.
- A DIV 0, scongelare 5 ml di mezzo tripsinizzazione NPC pre-aliquotati e congelati a 37 ° C per 5 - 10 minuti e posto in una cappa coltura tissutale. Utilizzando una pipetta 25 ml, trasferimento differenziando aggregati ad un tubo conico da 50 ml. Consentire aggregati di stabilirsi e medie attenzione aspirare. Lavare pellet due volte con 10 ml di PBS, permettendo gli aggregati di stabilirsi tra un lavaggio.
- Dopo il secondo lavaggio PBS, aggiungere 5 ml di NPC medio tripsinizzazione al pellet e incubare a 376; C per 5 min. Flick delicatamente il tubo dopo 2.5 min.
- Aggiungere 5 ml di 0,1% inibitore soia tripsina (STI) per inattivare tripsina e mescolare invertendo. Triturare delicatamente 10 - 15 volte con una pipetta 10 ml sierologico fino ad una sospensione cellulare relativamente omogenea viene prodotto.
- Lentamente trasferire la sospensione cellulare a un filtro cella 40 pm o 70 micron posto in cima ad una provetta conica da 50 ml. Una volta che tutti la sospensione è stata filtrata, aggiungere 1 ml di N2 mezzo per lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e sedimentare la sospensione cellulare dissociato per 6 min a 200 x g.
- Aspirare il terreno senza disturbare il pellet. Lavare le cellule due volte con 10 ml di mezzo N2, pellet cellule per 5 minuti a 200 xg e triturazione tra un lavaggio con un P1000. Prima del secondo lavaggio, contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Risospendere le cellule in mezzo N2 a 1 x 10 7 cellule per ml ESN e la piastra ad una densità cellulare di 150.000 - 200.000 cellule / cm 2.
- Trasferimento di recente plated ESN di un umidificata coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 e di mantenere, come nella sezione 5.
4. Preparazione Cultura Superfici placcatura Neural precursori a DIV 0
- Preparare Tissue Culture trattati piatti con almeno 1 giorno prima della placcatura. Aggiungi polietilenimina sufficiente (PEI; 25 mg / ml di H 2 O sterile) o poli-D-lisina (PDL; 100 mg / ml in H 2 O sterile) per coprire il tessuto-cultura-trattati piatti di plastica e incubare O / N a 37 ° C.
- La mattina di placcatura, lavare i piatti due volte con bidistillata H 2 O e una volta con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere sufficiente medio N2 per coprire il piatto (ad esempio, 1 ml per pozzetto di un piatto 12-bene o 4 ml per 6 centimetri piatto).
- Preparare 18 coprioggetto mm di vetro con almeno un giorno prima della placcatura neurone. Coprioggetto pulito per 4 min-pulizia al plasma.
- Trasferire immediatamente coprioggetto ripuliti in modo parafilm etanolo lavato sul fondo di ungrande piatto sterile e aggiungere 400 ml di soluzione di PEI o PDL, preparati come al punto 4.1. Incubare O / N a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale.
- Al mattino, lavare coprioggetto tre volte con acqua e aggiungere 5 mg / ml di laminina in PBS per 1-3 ore a 37 ° C. Prima di dissociare i neuroni, aspirare il laminina e trasferire immediatamente il vetrino di un pozzo di un piatto da 12 pozzetti contenenti 1 ml di NPC medio, avendo cura di mantenere il lato trattato rivolto verso l'alto.
- Piatti Conservare e vetrini a 37 ° C fino a quando gli NPC sono pronti alla piastra.
5. Manutenzione di neuroni
- A DIV 1, media aspirare e sostituirlo con terreno di coltura N2.
- A DIV 2 e 4, media aspirare e sostituirlo con terreno di coltura B27.
- A DIV 8, media aspirare e sostituirlo con terreno di coltura B27 contenenti inibitori mitotici per eliminare contaminanti cellule non neuronali.
- A DIV 12, sostituirlo con terreno di coltura B27.
- Non rimuovere DIV12 + ESN dal 5% di CO 2 fino al momento dell'uso.
6. L'inibizione Misurato di Synaptic Transmission (MIST) Assay per quantificare miniatura Correnti Excitatory post-sinaptici
ATTENZIONE: Le neurotossine clostridi sono le sostanze più tossiche conosciute, con presumibile LD umano 50 valori a partire da 0,1-1 ng / kg. Ottenere le autorizzazioni necessarie prima di utilizzare queste tossine e usare le opportune precauzioni.
- Diluire con attenzione BoNT / A a 100 volte la concentrazione finale desiderata in ESN terreno di coltura e calda a 37 ° C. Aggiungere il volume appropriato di tossina DIV 21 + ESN culture, agitare il piatto cultura, e tornare a incubatore.
- Se le cellule saranno analizzati più di 4 ore dopo l'intossicazione, aggiungere la tossina al piatto e turbolenza senza rimuovere dal 5% di CO 2, ad esempio direttamente in incubatore o in una costante camera di CO 2.
- A adeguato punto di tempo, aspirate ESN terreno di coltura e lavare due volte con buffer di registrazione extracellulare (ERB). Aggiungere 4 ml di ERB integrate con 5.0 mM tetrodotossina e 10 micron bicucullina, bloccando potenziali d'azione e inimicarsi GABA A l'attività del recettore, rispettivamente.
- Trasferimento piatto di elettrofisiologia rig. Né è necessario perfusione né il controllo della temperatura per il saggio MIST.
- Tirare in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta per produrre una pipetta di registrazione con 5-10 MW di resistenza e di riempire con buffer di registrazione intracellulare. Immergere delicatamente riempito pipetta registrazione in siliconatura reagente prima della registrazione.
- Utilizzando una siringa piena d'aria, fornire una pressione positiva come la pipetta registrazione viene abbassato nel ERB. Dopo l'atterraggio delicatamente la pipetta registrazione sul soma del neurone da registrare, rimuovere pressione positiva e formare un gigaseal. Ridurre la tensione di mantenimento di -70 mV. Applicare con cura pressione negativa di penetrare configurazione whole-cell.
- Passa alla corrente-clamp per monitorare e registrare potenziale di membrana. Senza aggiustamento per potenziali giunzione liquidi, il potenziale di membrana a riposo sarà tra -67 a -82 mV.
- Eseguire una registrazione di tensione-clamp -70 mV continua per 4-5 minuti per rilevare miniatura eccitatori correnti post-sinaptiche (mEPSCs).
- Analizzare 4 min di dati registrati per il rilevamento mEPSC utilizzando software di rilevamento picco con le seguenti impostazioni: Threshold, 5; Periodo di ricercare un massimo locale, 10.000 msec; Tempo prima di un picco per la linea di base, 5.000 msec; Periodo per cercare un tempo di decadimento, 20.000 msec; Frazione di picco di trovare un tempo di decadimento, 0.37; Periodo di media, una linea di base, 1.000 msec; Soglia Area, 20; Numero di punti di picco media, 1; Direzione del picco, negativo.
- Raccogliere e salvare le informazioni sugli eventi rilevati. Dividere il numero di eventi rilevati in 4 min per 240 per determinare la frequenza mEPSC in Hz.
- Raccogliere frequenze mEPSC per 8-12 contRols e 8 - 12 campioni BoNT-trattati per ogni condizione di esposizione. Analizzare frequenza contro età e controlli lotto corrispondenza. Determinare la significatività statistica del% inibizione dell'attività sinaptica utilizzando ANOVA test e test post-hoc di Dunnett.
Representative Results
Abbiamo sviluppato un protocollo differenziazione, che consente la produzione economica di grandi quantità di neuroni derivati dalle cellule staminali altamente puro da CES topo (descritto in Figura 1A) 8,11. Questo metodo è stato utilizzato per un periodo di anni per differenziare riproducibile generate privatamente e disponibili in commercio linee CES in neuroni di lignaggi definiti 12-14. Elementi critici di questo protocollo includono (1) l'adeguamento dei CES su Alimentazione cell-free coltura in sospensione; (2) una corretta manutenzione delle colture in sospensione; e (3) la differenziazione in condizioni rotanti. Transizione alla cultura sospensione riduce drasticamente i tempi ei costi di manutenzione ESC, e elimina la necessità di rimuovere le cellule di alimentazione prima di differenziazione. Dopo l'adattamento della sospensione, Oct3 / 4 espressione è coerente con almeno 30 passaggi, che indica che l'adattamento di sospensione non alterare l'espressione di marcatori pluripotenza (Figura 1B-D 7 cellule per il passaggio. Questo si verifica in genere nel giro di dieci passaggi successivi adattamento sospensione o cinque passaggi dopo lo scongelamento dei CES che erano precedentemente sospensioni adattate. Rotazione meccanica di differenziare aggregati è stata trovata anche a essere fondamentale per una maggiore resa neuronale. L'aggiunta di un agitatore rotante eliminato formazione super-aggregati, aumentando la redditività aggregata e producendo un aumento ~ 300% nella resa di cellule progenitrici neurali (NPC) a 0 DIV (Figura 1E).
Una differenziazione tipica inizia con 3,5 x 10 6 CES a DIV -8 e produce 115 x 10 6 NPC a DIV 0, circa il 60% dei quali sarà sopravvivere e diventare neuroni. Il restante 40% comprendono cellule non-neuronali e sono sostanzialmente eliminato deprivazione di siero tra DIV 0 - 1. Il numero ridotto di persistenza glia può essere rimosso mediante aggiunta di inh mitoticheibitors da DIV 2-4 o DIV 8 - 12. densità di placcatura è critica a DIV 0; neuroni placcato troppo poco non sopravviverà oltre 2 settimane. Pochi giorni dopo la placcatura, neuroni differenziati mostrano morfologie neuronali e compartimenti stagni proteine neurotypic, come il MAP2 marcatore Somatodendritic e il marcatore assonale Tau (Figura 2A). Con DIV 14 synapsin-1 + puncta consenta di identificare in interfacce axodendritic, suggestivi di formazione di sinapsi. Ciò è coerente con l'espressione di proteine marker sinaptiche prima di div 7 8,11. Morfologie neuronali continuano a maturare attraverso DIV 21, in cui le culture tempo presentano elaborati pergole axodendritic e grandi puncta sinaptica (Figura 2A). Se mantenuto in modo appropriato, ESN rimangono vitali e attivi per almeno 4 settimane dopo la placcatura.
Profili di espressione longitudinale utilizzando RNA-sequencing corroborata prove morfologiche e proteomica di neuronale specifica und frollatura 11,15. Marcatori rappresentativi di progressione evolutiva esposti profili di espressione specifici stadio incluse Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN e KCC2 (Figura 2B). Con DIV 0, ESN espresso copie abbondanti di proteine strutturali specifici neuroni, compresi MAP2 e Tau. Coerentemente con i risultati precedenti, sono stati osservati i marcatori per solo due sottotipi neuronali: mesencefalo / hindbrain neuroni glutamatergici-VGlut2 esprimono e GABAergici interneuroni 8. Corrispondentemente, una vasta gamma di glutamatergici e GABAergici marcatori esposto un forte aumento di espressione tra DIV 0 e DIV 7, tra cui proteine SNARE pre-sinaptici richieste per il rilascio dei neurotrasmettitori; recettori per i neurotrasmettitori necessari per le risposte post-sinaptiche; e le proteine ponteggi necessari per legare questi recettori sulla membrana post-sinaptica. I neuroni maturi presentano caratteristiche elettriche intrinseche da DIV 14 e spontanei in miniatura eccitatori correnti post-sinaptiche da DIV16 16.
L'inibizione di misura di Synaptic Transmission (MIST) test è stato utilizzato per valutare l'effetto di intossicazione sull'attività sinaptica. Confrontando le frequenze mEPSC tra DIV ebbrezza e il veicolo trattati 24 + ESN, MIST fornisce una misurazione quantitativa e specifico di intossicazione in base inibizione funzionale dell'attività sinaptica (Figura 3A). MIST è stato utilizzato per misurare gli effetti di BoNT / A- / G o tenda sulla attività sinaptica in ESN a 20 ore dopo il bagno aggiunta di ogni tossina. Tossine sono stati aggiunti ad una concentrazione equivalente a 10 volte il valore EC 50, come precedentemente determinata mediante analisi immunoblot di SNARE proteine scissione 11. Tutti tossine ridotti frequenze mEPSC a meno del 5% dei controlli trattati con veicolo. Riduzioni di aliquote sinaptiche non sono attribuibili alla morte cellulare o risposte intrinseche alterati, poiché ESN intossicati sono stati in grado di essere patch, licenziato potenziali d'azione ripetutein risposta ad iniezione di corrente ed esposto nessuna alterazione significativa potenziale di membrana (Figura 3B, C).
Per confrontare la sensibilità di MIST di metodi esistenti per rilevare CNT, il limite di rilevazione e di concentrazione di inibizione mediana (IC 50) sono stati determinati 20 ore dopo l'aggiunta di BoNT / A a ESN. Intossicazione da un minimo di 0.005 pM BoNT / A ha prodotto una riduzione statisticamente significativa della frequenza mEPSC, con un valore di IC 50 di 0.013 PM e completa tacitazione di attività sinaptica sopra 12:05 (Figura 4A). Questo valore IC 50 corrisponde a circa 0,5 topo unità letali / ml, suggerendo che MIST è due volte più sensibile e da 2 a 4 volte più veloce della MLA nel rilevare la presenza di BoNT / A. Misure immunoblot di SNAP-25 scissione ha prodotto un valore EC 50 di 12:38 e una dose minima rilevabile di 12:05, indicando che MIST è di circa 30 volte più sensibiledi rilevazione basata immunoblot-di proteine SNARE spaccati (Figura 4B).
Figura 1. ESN sospensione adattato rimangono mitoticamente stabili ed esprimono marcatori di pluripotenza. (A) Schema di ESC manutenzione e differenziazione. La presenza o l'assenza di acido retinoico (RA) o fattore inibitorio della leucemia (LIF) è contrassegnato da un + oppure -. Un confronto tra i giorni in vitro (DIV) e fasi di sviluppo classici (DS) per le culture neuronali primarie è disponibile 17. Tariffe (B) proliferazione di R1, D3 e linee cellulari C57BL / 6J ES stabilizzano da cinque passaggi dopo il passaggio alla coltura in sospensione. (C) di citometria a flusso dati dimostrano alcun cambiamento sostanziale in Oct3 / 4 espressione nella R1, D3 e linee cellulari C57BL / 6J ES misurato oltre 25 passaggi in coltura in sospensione (n = 6 per ciascuno). (D) le rese di cellule effettivi durante passaging di routine per una linea R1 ESC sospensione adattato misurata tra i passaggi 5 e 30 (linea nera). I rendimenti cumulativi teoriche se non le cellule vengono eliminati durante passaging sono anche presentati (linea rossa). (E) le immagini in campo chiaro di DIV 0 aggregati realizzati sotto statico (a sinistra) o le condizioni di rotazione (a destra). Condizioni Rotary prodotti aggregati sferici senza agglomerazione e aumentate NPC produce 3 volte (p <0.001, determinate con test t di Student) 11. * Indica un P <0,05. Questa cifra è stata modificata da Hubbard et al. 11 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. morfologica, prprove oteomic e trascrittomica di specificazione neuronale e maturazione (A) Immunocytochemistry da DIV 7 -. DIV 49 dimostra arborizzazione neuronale e la comparsa di puncta sinaptica alle interfacce axodendritic. Gli assoni sono etichettati con Tau (verde), dendriti sono etichettati con MAP2 (rosso), comparti pre-sinaptici sono etichettati con sinapsina (bianco), e nuclei sono colorati con DAPI (blu). (B) l'espressione longitudinale profiling di geni rappresentativi che dimostrano l'espressione dello sviluppo specifici stadi e specificando sottotipi neuronali. Tutti i trascritti del gene sono espressi come numero approssimativo di trascrizioni per cella. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. ESN sotto. andare inibizione dell'attività sinaptica quando esposti a BoNT / AG e la tenda (A) tracce Rappresentante di ESN raccolti 20 ore dopo il bagno aggiunta di ~ 10 x 50 CE valori di BoNT / A - / G, tenda o del veicolo. Ogni neurotossina ridotto l'attività sinaptica di oltre il 95% rispetto ai controlli. (B) i neuroni rimasti intossicati in grado di sparare AP ripetuti in risposta a depolarizzanti iniezione di corrente (come dimostrato per BoNT / A, ma ha osservato in tutte le culture intossicati) e (C) espone cambiamenti nella membrana a riposo potenziale negativo (C; n> 18 per ogni trattamento). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Determinazione della sensibilità del MIST in BoNT / A-trattatiESN. (A) misure nebbia sinaptica attività 20 ore dopo il bagno aggiunta di BoNT / A. Rappresentante segmenti traccia di tensione-clamp hanno mostrato una diminuzione della frequenza mEPSC seguente BoNT / A esposizione (lato sinistro). La quantificazione di frequenza mEPSC (grafico a barre, a destra, n = 20 per i controlli; n = 11-22 per ogni dose) conferma una riduzione dose-dipendente della frequenza mEPSC. La concentrazione inibitoria mediana è stata determinata con il metodo dei minimi quadrati di una regressione non lineare con una pendenza variabile a quattro parametri (R 2> 0.91). Notare il limite di rilevamento da MIST in ESN è di almeno 0.005 pM. (B) BoNT / A intossicazione dei risultati ESN in scissione di SNAP-25, come visualizzato mediante turni di mobilità gel (una macchia rappresentante occidentale sul lato sinistro con un grafico a barre che mostra la quantificazione della SNAP-25 scissione a destra; n = 4) . Si noti la sensibilità ridotta utilizzando SNARE proteine scissione (SNAP-25) come endpoint (CE 50 del 12:36) vs. 50 di 0.013 pm). * Indica un P <0,05; *** Indica un P <0,001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il gold standard attuale per il rilevamento CNT, determinazione sierotipo e quantificazione è la MLA. La MLA interroga l'intera gamma d'ospite: clivaggio interazioni tossina necessari per l'intossicazione a verificarsi in vivo (ad esempio, la tossina legandosi ad un recettore sulla superficie cellulare, internalizzazione del complesso recettore-tossina, LC traslocazione nel citoplasma, LC-mediata del substrato e inibizione della neurotrasmissione sinaptica) 18. Tuttavia, anche se la MLA offre un modello fisiologicamente rilevanti di intossicazione, è molte risorse, possono essere confusi da contaminanti e coinvolge un gran numero di topi con la morte come un endpoint. In alternativa, saggi cellulari per il rilevamento e la quantificazione BoNT si sono limitati a colture di neuroni primari, che richiedono anche l'uso degli animali, o di linee cellulari di neuroblastoma, che non riescono a formare sinapsi e in genere mostrano scarsa sensibilità a neurotossine 8. Ad oggi, la maggior parte delle misure di intossicazione in thpiattaforme basate sulle cellule ESE hanno fatto affidamento sulla rilevazione del taglio proteolitico di SNAP-25, VAMP1 / 2 o sintaxina-1 11. Questo è problematico perché la proteina SNARE scissione ha dimostrato di essere non lineare associato inibizione sinaptica in vivo e quindi non possono rappresentare accuratamente intossicazione o recupero da intossicazione 19,20.
Un sistema modello cellulare ideale per il rilevamento CNT avrebbe (i) essere basata neurone-; (Ii) essere sinapticamente accoppiato con risposte elettriche neurotypic; (Iii) altamente sensibile a tutti i sierotipi CNT o sottotipi; e (iv) offerta di scalabilità, di throughput e di analisi volte che sono equivalenti o migliorata nel corso del MLA, a costi inferiori, e senza richiedere l'uso di animali. Per soddisfare queste esigenze, abbiamo sviluppato un metodo per produrre grandi quantità di altamente arricchito, culture rete di glutammatergico e neuroni GABAergici dalle linee del mouse CES disponibili in commercio. Abbiamo poi sviluppato il test MIST da quantificarel'inibizione sinaptica in risposta a intossicazione con tenda e BoNT / A- / G. Mentre il test MIST può essere condotta su una popolazione di neuroni sinapticamente attiva (ad esempio, i neuroni primari o fettine di cervello), attualmente ESN sono vitro derivata modello di neurone solo che sviluppa riproducibile comportamenti di rete emergenti ed è quindi opportuno che il test MIST.
Produrre una quantità sufficiente di neuroni di stirpe definita per studi CNT richiesto diverse innovazioni nella cultura e differenziazione ESC. In primo luogo, selezionando e coltura CES che possono sopravvivere sospensione-adattamento, abbiamo eliminato il rischio di contaminazione da cellule di alimentazione e la necessità di purificare cellule di alimentazione dalla CES all'inizio di differenziazione. Anche se i meccanismi molecolari alla base della sospensione-adattamento sono sconosciuti, CES sospensioni adattate rimangono mitoticamente attivi, mantenere Oct3 / 4 di espressione e continuano ad essere neurogena. Utilizzando questo metodo, ~ 1,5 x 10 7 ESC sono in genere recuperati ogni passaggio. In secondo luogo, la produzione di NPC è aumentata ~ 300% incorporando agitazione meccanica per evitare l'agglomerazione durante la differenziazione, apparentemente migliorare l'accessibilità nutrienti agli interni di aggregati. Durante il processo, abbiamo scoperto che il siero utilizzato per la cultura ESC e differenziazione neuronale è il componente più critico nel mantenere CES neurogena. Per una migliore riuscita, si consiglia la sospensione adattandosi cellule ES per ogni lotto di siero e stoccaggio del siero a -20 ° C per sostenere la cultura ESC e la differenziazione neuronale attraverso la data di scadenza.
Come con la maggior parte delle culture sinapticamente attivi, DIV 14 + ESN sono altamente sensibili alle brusche variazioni di pH, e anche una breve esposizione al CO 2 atmosferica concentrazioni possono causare neurotossicità entro 24 ore. Per gli esperimenti che richiedono un trattamento di culture seguita da incubazione della durata di O / N o più, i neuroni devono essere trattati direttamente in l'incubatore o trasferiti ad una costante camera di CO 2 prima sperimentazione.
Una varietà di tecniche confermato neurogenesi e maturazione neuronale, tra cui ICC, profilo trascrizionale e whole-cell patch-clamp elettrofisiologia. Variazioni temporali di espressione genica e la morfologia dei neuroni sono stati coerenti con una rapida progressione attraverso le fasi di sviluppo di neurogenesi, e DIV 16, ESN esposti eccitatori e inibitori miniatura correnti post-sinaptiche con rete emergente comportamenti 16. La prova dell'attività sinaptica suggerito che ESN può replicare i pathophysiologies responsabili delle manifestazioni cliniche di botulismo e tetano. Ciò è stato confermato da utilizzando MIST per dimostrare che l'intossicazione con BoNT / A- / G o tenda alterata frequenze mEPSC di> 95% rispetto ai neuroni di veicoli trattati o non trattati.
Misure della sensibilità del MIST per BoNT / A indicavano una mediana inibitorioconcentrazione (IC 50) di 0,013 pM (equivalente a 0,5 topo letale unità / ml) e un limite-di-rilevamento inferiore 0,005 pM, misurata a 20 ore dopo il bagno aggiunta. Sulla base di questi valori, MIST è circa due volte più sensibile come e 2-4 volte più veloce di MLA e 30 volte più sensibile di rilevamento basato immunoblot-di spaccati SNAP-25.
Collettivamente, questi dati suggeriscono che le popolazioni in rete di neuroni derivati dalle cellule staminali offrono un modello fisiologicamente rilevanti base cellulare di intossicazione. In combinazione con i metodi migliorati per ricavare culture ESN in rete dal CES sospensioni adattata, l'uso di MIST dovrebbe ridurre la necessità di sperimentazione sugli animali e gli svantaggi associati, i costi e le preoccupazioni etiche del MLA, fornendo una misura più rapida, sensibile e specifico di intossicazione. Sebbene whole-cell patch-clamp elettrofisiologia è un metodo a basso rendimento per individuare la presenza di neurotossine attivi, offre una risoluzione e speed che è irraggiungibile con metodi molecolari. Questi risultati dimostrano che anche l'applicazione di metodi attività-dipendenti per valutare l'attività sinaptica e il comportamento della rete può consentire il rilevamento rapido e specifico di neurotossine. Tali approcci più alto throughput renderebbe studi meccanicistici, lo screening terapeutico o saggi diagnostici fattibili per una vasta gamma di agenti neuromodulatori, inclusi i nanotubi di carbonio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health National Institute of Allergy e Malattie infettive (numero IAA AOD12058-0001-0000) e Defense Threat Reduction Agency - Joint Scienza e Tecnologia Ufficio, Medical S & T Division (numeri di sovvenzione CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 e CBM.THRTOX.01.RC.014). Questa ricerca è stata effettuata mentre PB tenuto una Threat Defense Reduction Research Associateship Award Agency-Consiglio Nazionale delle Ricerche e KH tenuto una ricerca Associateship Award Consiglio Nazionale delle Ricerche. Ringraziamo Angela Adkins e Kaylie Tuznik (USAMRICD) per l'assistenza tecnica; e Cindy Kronman (USAMRICD) per l'assistenza editoriale. Le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale del Dipartimento dell'Esercito, Dipartimento della Difesa, o il governo degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
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