Abstract
シナプス前の標的クロストリジウム神経毒（CNTが）の治療及び機構研究が機能シナプスを生成し、中毒に生理的反応を起こし、スケーラブル、細胞ベースのモデルの必要性によって制限されていた。ここでは、効率的にシナプスアクティブ、ネットワーク接続された神経細胞の定義された系統にマウス胚性幹細胞（ESC）を区別するためのシンプルかつ堅牢な方法を記載する。 8日間分化プロトコールに従って、マウス胚性幹細胞由来のニューロン（のESN）急速に発現し、区分するneurotypicタンパク質は、ニューロンの形態を形成し、内因性の電気的応答を発症する。抑制性のバランス：分化後18日間（DIV 18）で、のESNはアクティブグルタミン酸とγアミノ酪酸（GABA）作動性シナプスおよび興奮によって特徴付け緊急ネットワークの動作を示す。 CNTを持つ中毒は、機能的に、それによって目を複製し、シナプスの神経伝達に拮抗するかどうかを判断するにはE 中のボツリヌス中毒や破傷風の臨床症状の原因である病態生理学は、全細胞パッチクランプ電気生理学、破傷風神経毒（TeNTの）またはボツリヌス神経毒にさらされるのESNにおける自発的なミニチュア興奮性シナプス後電流（mEPSCs）（のBoNT）を定量化するために使用した生体血清型/ A- / G。全ての場合において、のESNは20時間以内にシナプス活性のほぼ完全な消失を示した。酔っニューロンは、不変の静止膜電位と本質的な電気的応答によって示されるように、実行可能なままであった。さらに、この方法の感度を特徴づけるために、シナプスの活性に対する中毒の用量依存的な効果は、BoNT / Aを添加した後20時間後に測定した。 0.005 pMでのBoNT / Aとの中毒は0.013 PMの中央値阻害濃度（IC 50）で、mEPSCsの大幅な減少をもたらした。中央値用量の比較は、シナプス抑制の機能的な測定はより速く、より具体的なスネアよりも高感度であることを示している切断アッセイまたはマウス致死性検定。これらのデータは、CNTの高度に特異的かつ高感度検出のためのシナプス結合された、幹細胞由来の神経細胞の使用を検証する。
Introduction
この方法の全体的な目標は、機能的にクロストリジウム神経毒にさらされる幹細胞由来のニューロンのネットワーク化された培養物中のシナプス活性を評価することである。これは機能的ボツリヌス中毒の臨床症状の原因と病態生理を複製し、CNTの検出に適したモデル、治療スクリーニングと機構研究としてのESNを検証インビトロ派生モデルの最初の実証である。
BoNTはクロストリジウム属のメンバーによって生産性の高い致死細菌神経毒である。最近提案のBoNT / Hを含め、8抗原的に異なるのBoNT血清型が記載されている（/ A- / H）1,2。すべての血清型は、翻訳後に100 kDaの重鎖（HC）およびジスルフィド結合3によって連結された50 kDaの軽鎖（LC）からなる二本鎖を生成するためにニックを入れされた150 kDaのペプチドとして発現される。 HCは、シナプス前受容体とENTへの結合を媒介するシナプスエンドサイトーシスを介して神経細胞への毒素のRY。エンドソームプロセシング中、HCは、シナプス前細胞質ゾルへのLCの移動を容易にする、小胞膜の孔を形成するために、構造の再編成を受ける。 LCはその後、具体的目標とし、シナプス前の区画に切断するの可溶性N -ethylmaleimideに敏感な融合付着タンパク質受容体（SNARE）タンパク質：SNAP-25（のBoNT / A、/ C、/ E）、VAMP2（のBoNT / B、/ D、 / F、/ G）またはシンタキシン（のBoNT / C）1。これらのSNAREタンパク質のいずれかの切断は、それによって神経伝達物質の放出を遮断する、シナプスエキソサイトーシス機械の組立を防ぐことができます。 1 NG / kgを1 -効率的な神経細胞のターゲティングとシナプス前ローカライゼーションの組み合わせは、BoNTは0.1と低く推定人間致死量で、知られている最も強力な毒をレンダリングします。
生化学的アッセイは、高感度でCNT LCの存在または活性を検出するために用いることができる。しかし、これらの方法は私のために失敗、バインド入力する毒素の能力をnterrogate、活性化し、神経細胞内の関数、したがって、アクティブな毒素の存在を間接的に、おそらく誤解を招く措置である。対照的に、マウス致死性アッセイ（MLA）のような中毒の機能的アッセイは、包括的に毒素活性のより関連性の高い具体的な評価を提供し、正常に取り込みおよび活性化のすべての段階をネゴシエートするCNTの能力を評価する。 MLAがBoNT検出のゴールドスタンダードであるが、エンドポイントとして死亡を使用するインビボ法であるため、研究プラットフォームなどの限られた有用性を有する。機構研究および治療的スクリーニングに適したCNT中毒の細胞ベースのモデルを開発する試みも大きな制限を受けている。一次ニューロン培養物は、生理的関連性の高い程度を提供するが、それらの使用は、高い資源コストは比較的低い収率、複数のニューロンのサブの存在を含む、多くの要因によって複雑になる種類と動物使用に関わる広範囲の規制と管理監督。一次ニューロンの代替として、そのような神経芽細胞腫および副腎クロム親和細胞など（化学的刺激により神経細胞様の特性を採用するように誘導することができる）、神経原性細胞株は、中毒のin vitroモデルとして使用されている。これらの細胞は誘導の前に連続的に培養されるので、それらは非常にスケーラブルであり、したがって、適度なスループットアプローチに適してい。誘導された表現型が、一般的に不均一であり、CNTのにはあまり敏感であり、機能してシナプス4に集合シナプス前および後の区画を形成することができないことなどの重要な神経細胞の挙動を、示すことができないので、彼らの妥当性は疑問である。生理的に無傷のシナプス前コンパートメントがない場合には、毒素のフルレンジ：ニューロン相互作用は複製できないと中毒のしたがって機能測定は5不可能である。ノーtは意外にも、機構研究または誘導された神経性の細胞株を用いてのBoNTための薬剤スクリーニングの生体内および一次ニューロンの研究6と矛盾している調査結果をもたらしたを実施しようとします。
これは、細胞由来の中枢神経系（CNS）のニューロンは、培養細胞株7-10の柔軟性を一次ニューロンの関連性を兼ね備えたBoNT研究のための次世代の細胞ベースのプラットフォームを提供することができる幹細胞が提案されている。具体的には、マウス幹細胞由来のニューロン（のESN）はのBoNT / A- / Gの生理学的用量に非常に敏感であるため、差動persistences、活性向上中毒、及び血清型を含む、中毒インビボ応答の多くを複製することが見出されている固有の効力5,8,11-。これらの動作は、BoNTの取り込み、処理、人身売買や活動の生体内メカニズムでのESNに保存されていることを示唆している。シナプスactivitのが、阻害yはボツリヌス中毒の署名症状であるため、CNTのことで中毒以下のシナプス活性の損失を実証してのESNは、CNT研究のための体外由来細胞ベースのモデルに適していると結論する前に不可欠です。
シナプス活性にカーボンナノチューブと中毒の効果を測定するために、全細胞パッチクランプ電気生理学は、ビヒクル処置またはCNT処理DIVにおける単シナプス電流は21 +のESNを定量した。私たちは、BoNT / A- / GとのESNの中毒やテント、全ての場合において20時間以内にシナプス活性の> 95％の損失を引き起こしたことがわかった。さらなる特徴は、BoNT / Aで中毒した後20時間後に実施し0.005 pMの下の検出限界と0.013 PMのIC 50値は、シナプス活性に用量依存性の効果を明らかにした。これらの知見は、酩酊の電気生理学的検出感度および時間枠が大幅に匹敵する免疫ブロットベースのアナよりも改善されていることを示すシナプス活性なニューロン培養物における中毒の機能的測定値がBoNTに対する細胞応答を特徴付けるために、より感度が高く、特異的かつ迅速な方法を容易にすることができることを実証するSNAP-25切断およびインビボのマウス致死性アッセイにおける溶菌。
Protocol
ESCの1。適応は、無細胞浮遊培養をフィーダ
- 37℃で融解したESC氷のスライバーが残るまで。
- 10 6は、予め温めESC培地10mlを含有する非組織培養処理皿にESCの解離×2.5 - P1000ピペットを用いて、穏やかに1を転送する。 37℃で20時間、5％CO 2加湿組織培養インキュベーター中でインキュベートする。
- 20時間後、静かに10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに懸濁培養を転送することによって細胞を洗浄。 200×gで3分間ペレットのESC。スピン中、低接着性ディッシュに戻って新鮮なESC培地10mlを追加します。
- 上清を吸引し、細胞ペレットを追い出し回避し、細胞ペレットに1ミリリットル新鮮なESC培地を追加するように注意しながら。 P1000ピペットを用いて細菌の皿に細胞を移し、インキュベーターに戻す。
- 凝集体が肉眼で（通常は4に見えるようになるまで毎日細胞を守って - 8日間（d）前記凝集体は0.2になります- 0.5ミリメートル）。凝集体が4日後に明らかでない場合は、ステップ1.3を繰り返します。凝集体が見えたら第2節で説明したように、ESCのを解離し、維持する。
2. ESC継代とメンテナンス
- ESCは、滅菌10ミリリットルピペットを用いて、15ミリリットルコニカルチューブに集約し転送し、凝集体がコンパクトなペレットにセトリングさせる（通常は3から5分）。 、上清を吸引し、細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、そして5ミリリットルのPBSで凝集体を洗う。重力沈降が2.5分間100×gで、代わりにペレット細胞を推奨しますが代わりに時間を節約する。
- 吸引しPBSおよび500μlのトリプシンを追加します。 37℃の水浴中で3分間、トリプシン中で凝集体をインキュベートする。トリプシンを希釈し、ゆっくりと凝集体を破壊するためにP1000ピペットで10回粉砕するために500μlのESC培地を追加します。血球計数器を用いて細胞を数える。
- ペレットを、1.0の最終濃度で200×gで再懸濁した細胞で3分間、細胞を解離ESC培地中×10 7細胞/ ml。 10センチメートル細菌皿に新鮮なESC培地10mlに150μlの（1.5×10 6細胞）を移し、48時間組織培養インキュベーターに戻す。過剰のESCを区別することができる、1で凍結保存- 90％のESC培地中の5×10 6細胞/ mlの10％DMSOを補充し、または廃棄した。
- 通路は48時間ごとに集約します。通過させるための準備ができて凝集体は、直径が0.5mmを超えると、はっきりと見えるようになります。
注： - 1.4凍結保存し、サスペンション適応細胞の解凍と文化はステップ1.2あたりに達成される。 72時間 - 凝集体は、48内に継代するための準備が整います。
3.神経分化
注： - 正午後に事前の正午とステップ3.7に3.5行動は3.1を繰り返します。分化手順の概要は、 図1Aに示されている。
- 2.5 - 手順2.1のようにESCのを解離。解離の譲渡を350μl（3.5×10 6）25ミリリットル分化培地を含む10センチメートル低接着ディッシュにdのESCは。 5％のCO 2で37℃で組織培養インキュベーター内部の45回転- 30に設定オービタルシェーカー上に置きます。これは、分化の最初の日、 体外 （DIV） で呼ばれる日です-8。
注：超低付着性皿の使用は、方法のコストを増加させるが、凝集体が時折ペトリ皿に付着することができるので、細菌のペトリ皿よりも僅かに大きな収量を生じる。別の皿のサイズが好ましい場合、培地容積および細胞数はそれに応じてスケーリングすることができる。 - 48時間（DIV -6）した後、50ミリリットルコニカルチューブに分化細胞集合体を転送するために25ミリリットルピペットを使用しています。すぐにペトリ皿に分化培地の新鮮な25ミリリットルを追加します。
- 深さ2mm - 1で目に見えるペレットを生産、5分 - 凝集体は2オーバーを解決できるようにします。単一細胞または懸濁液中に残っている小さな凝集を無視します。慎重に培地を吸引し、CEを転送LLバックP1000を使用してペトリ皿にペレット。組織培養インキュベーター中でロータリーシェーカー上に置きます。
- DIV -4繰り返しステップ3.2で。 4mmの深い - ペレットは2になります。ペトリ皿に6μMオールトランスレチノイン酸（RA）を補充した30ミリリットルの分化培地を交換してください。さらに48時間、組織培養インキュベーター中でロータリーシェーカーに戻る。
- DIV -2繰り返しステップ3.3で。この時点で、深さ8mm - ペレットは4になります。
- DIV -1で、第4節のように、めっき表面を準備する。
- 組織培養フード中で10分間置き - DIV 0、5、37℃で等分し、事前および凍結NPCのトリプシン処理培地5mlを解凍する。 50ミリリットルコニカルチューブに凝集体を区別する25ミリリットルピペット、転送を使用して。凝集体が沈降し、慎重に培地を吸引できるようにします。ウォッシュは、凝集体が洗浄の間に沈降させ、10ミリリットルPBSで2回ペレット。
- 第二PBS洗浄した後、ペレットにNPCのトリプシン処理培地5mlを追加し、37でインキュベート6; 5分間C。静かに2.5分後にチューブをフリック。
- トリプシンを不活性化し、反転させて混合する0.1％ダイズトリプシンインヒビター（STI）の5ミリリットルを追加します。比較的均質な細胞懸濁液が生成されるまで10ミリリットルの血清学的ピペットで15回 - 優しく10を粉砕する。
- ゆっくりと50ミリリットルコニカルチューブの上部に配置された40μm以上70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を移す。すべての懸濁液を濾過された後、フィルタを介して、残りの細胞を洗浄し、200×gで6分間の解離細胞懸濁液をペレット化するN2培地の1ミリリットルを追加します。
- ペレットを乱すことなく、培地を吸引。 200×gで5分間、細胞をペレット化し、P1000と洗浄の間に粉砕する、10ミリリットル、N2培地で2回細胞を洗浄。第二の洗浄に先立ち、血球計数器を用いて細胞を数える。
- 200,000細胞/ cm 2を - 150,000細胞密度でミリリットルとプレートのESNあたり1×10 7細胞でのN2培地中で細胞を再懸濁。
- PLAT新たに転送加湿した37℃の組織培養インキュベーターと5％のCO 2へのEDのESNと第5節のように維持する。
4. DIV 0でメッキ神経前駆細胞の培養表面の準備
- メッキに少なくとも1日の前に、組織培養処理した料理を準備します。でN /組織培養処理プラスチック皿をカバーし、Oをインキュベートするか、またはポリ-D-リジン（滅菌H 2 O中の100μg/ mlのPDL）;十分なポリエチレンイミン（滅菌H 2 O中の25μgの/ mlのPEI）を追加37℃。
- メッキの朝は、二重蒸留H 2 Oで二回皿を洗うと一回PBSで。最終洗浄後、ディッシュ（ 例えば、12ウェル皿のウェル当たり1mlまたは6 cmディッシュあたり4 mL）をカバーするのに十分なN2培地を加える。
- 少なくとも一日前ニューロンメッキに18ミリメートルのカバーガラスを準備します。 4分間のプラズマクリーニングによるクリーンカバースリップ。
- すぐに底部にエタノール洗浄パラフィルムに清掃カバースリップを転送大型無菌皿に、ステップ4.1のように調製PEIまたはPDL溶液400μLを、追加します。組織培養インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートする。
- 午前中に、洗浄水で3回カバースリップ1 PBS中5μg/ mlのラミニンを追加 - 37°Cで3時間。ニューロンを解離する前に、上に向けて処理面を維持することを確認され、NPC培地1mlを含む12ウェル皿のウェルにカバースリップを転送し、すぐにラミニンを吸引して。
- 37℃での店舗の料理とカバーガラスのNPCをプレートに準備ができるまで。
ニューロンの5.メンテナンス
- とDIV 1、吸引媒体では、N2培地と交換してください。
- DIV 2時と4、吸引媒体及びB27培地と交換してください。
- DIV 8、吸引中でと非神経細胞を汚染除去するために有糸分裂阻害剤を含有するB27培地と交換してください。
- DIV 12で、B27培地と交換してください。
- DIVを削除しないでください直前まで、5％のCO 2から12 +のESNに使用する。
ミニチュア興奮ポストシナプス電流を定量化するためのシナプス伝達（MIST）アッセイの6の測定阻害
注意 ： - 1 NG / kgのクロストリジウム神経毒は、0.1と低く、推定人間LD 50値で、知られている最も有毒物質である。これらの毒素を使用して、適切な予防策を使用する前に必要な承認を取得します。
- 慎重のBoNT / AがESN培地と37ºCに暖かいで所望の最終濃度を100倍に希釈する。 、DIV 21 + ESN培養物に毒素の適切なボリュームを追加し、培養皿を旋回し、インキュベーターに戻す。
- 細胞は中毒後に4つ以上の時間を解析する場合には、そのような直接インキュベーターのように、または一定のCO 2チャンバー内で、5％のCO 2から取り外すことなく、料理やスワールに毒素を追加します。
- 適切な時点で、ASPIRAテESN培養培地および細胞外の記録液（ERB）で2回洗浄する。 ERBの4ミリリットルを追加します。それぞれ、活動電位を遮断し、GABA A受容体の活性に拮抗する、5.0μMテトロドトキシン及び10μMのビククリンを補った。
- 電気生理学リグに料理を転送します。どちら灌流も温度制御はMISTアッセイに必要とされる。
- 抵抗の5-10mΩの持つ記録ピペットを生成し、細胞内記録用緩衝液で埋めるためにマイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスを引き出します。静かに記録前に試薬をシリコン処理で満たされた記録ピペットを浸し。
- 記録ピペットがERBに低下するように空気で満たされた注射器を用いて、正の圧力を提供する。優しく記録するニューロンの細胞体上の記録ピペットを着陸した後、正の圧力を削除し、ギガシールを形成する。 mVの-70に保持電圧を下げる。全細胞構成に侵入する負圧を慎重に適用する。
- 監視し、静止膜電位記録するために、電流クランプに切り替えます。液体ジャンクション電位の調整がなければ、静止膜電位は-67 -82 mVの間であろう。
- ミニチュア興奮性シナプス後電流（mEPSCs）を検出するために5分 - 4連続-70 mVの電圧クランプ記録を行います。
- 次の設定でスパイク検出ソフトウェアを使用してmEPSC検出のための記録されたデータの4分の分析：しきい値、5;期間が極大を検索するには、万秒。ベースラインのピークまでの時間、5000マイクロ秒。減衰時間を検索する期間は20,000秒。ピークの割合は、0.37の減衰時間を見つけるために。ベースライン、千秒を平均化する時代。面積閾値、20;平均ピークにポイント数、1。ピークの方向、負。
- 収集し、検出されたイベントについての情報を保存します。 HzでmEPSC周波数を決定するために240によって4分で検出されたイベントの数を割ります。
- 12 CONT - 8 mEPSC周波数を収集rolsと8 - 各露光条件のための12のBoNT処理サンプル。年齢および多くをマッチさせた対照に対して周波数を分析します。一方向ANOVA試験及びDunnettの事後試験を用いてシナプス活性の阻害％の統計的有意性を決定します。
Representative Results
我々は、（ 図1Aに詳述する）マウスのESC 8,11から高純度の幹細胞由来のニューロンの大量の経済的な製造を可能に分化プロトコルを開発した。この方法は、再現性よく定義された系統12-14のニューロンへの私的に生成され、商業的に入手可能なESC株を区別するために長年にわたって使用されてきた。このプロトコルの重要な要素は、無細胞の懸濁培養フィーダするESCの（1）の適応を含む。懸濁培養の（2）適切なメンテナンス。回転条件下で、（3）分化。懸濁培養への移行は劇的にESCのメンテナンスの時間とコストを削減し、分化前にフィーダー細胞を除去する必要がなくなる。サスペンション適応以下、のOct3 / 4の発現は、（ 図1B-D多能性マーカーの発現を変化させないことサスペンション適応を示し、少なくとも30継代を通して一貫している7個の細胞を超えるとESCの神経分化のために適している。これは通常、サスペンションの適応後、または5継代以前にサスペンション適応したESCの解凍後10継代以内に起こる。凝集体を分化させる機械的な回転はまた、増加した神経細胞の歩留まりに重要であることが見出された。ロータリーシェーカーの添加は、凝集体の生存率を増加させ、DIV 0（ 図1E）における神経前駆細胞（NPCの）の収率~300％の増加を生成する、超凝集体形成を排除した。
典型的な分化はDIVで3.5×10 6のESCで始まる-8とDIV 0、生き残るためには、神経細胞になるそのうちの約60％の115×10 6のNPCを生成します。残りの40％は非神経細胞を含み、大部分はDIV 0の間で血清枯渇によって除去される - グリア持続少数の有糸分裂inhは添加することによって除去することができる1。DIVからibitors 2から4またはDIV 8 - 12メッキ密度がDIV 0で非常に重要です。あまりにもまばらにメッキニューロンは、2週間を超えて生き残ることはありません。メッキの日以内に、分化したニューロンは、ニューロンの形態を示し、そのような細胞体樹状突起マーカーMAP2および軸索マーカータウ（ 図2A）としてneurotypicタンパク質を、区分する。 DIVでは14シナプシン1 +涙点は、シナプス形成を示唆する、軸索樹状突起間の界面で識別することができます。これは7 8,11を DIVの前シナプスマーカータンパク質の発現と一致している。ニューロン形態は、DIV 21を介して成熟する時間培養は精巧な軸索 樹状突起間のアーバーと大きなシナプス点（ 図2A）を示し続ける。適切に維持された場合、のESNは、めっき後少なくとも4週間、生存可能でアクティブなまま。
RNA-シークエンシングを使用した縦発現プロファイリングは、神経仕様ANの形態学的およびプロテオミクス証拠を裏付けD成熟11,15。発達進行の代表的マーカーはあるOct3 / 4、ネスチン、DCX、NeuNのとKCC2（ 図2B）を含む、段階特異的発現プロファイルを示した。 DIV 0では、のESNはMAP2とタウなどのニューロン特異的構造タンパク質の豊富なコピーを、表明した。以前の知見と一致して、唯一の2ニューロンのサブタイプのためのマーカーが観察された：VGLUT2発現後脳/中脳グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性介在ニューロン8。それに対応して、グルタミン酸とGABA作動性マーカーの広い配列は、神経伝達物質の放出に必要なシナプス前SNAREタンパク質を含む、DIV 0とDIV 7の間の発現の急激な増加を示した。後シナプス応答のために必要な神経伝達物質受容体;と足場タンパク質は、シナプス後膜にこれらの受容体をつなぐために必要。ニューロンは、DIVによってDIV 14と自発的なミニチュア興奮性シナプス後電流によって成熟した固有の電気特性を示す16 16。
シナプス伝達（MIST）アッセイの測定された阻害は、シナプス活性に対する中毒の効果を評価するために使用された。酔っ及びビヒクル処理DIV 24 +のESNの間mEPSC周波数を比較することにより、ミストがシナプス活性（ 図3A）の機能阻害に基づく中毒の定量的·具体的な測定を提供する。 MISTは、各毒素の浴添加後20時間でのESNにおけるシナプス活性にするBoNT / A- / GまたはTeNTの効果を測定した。毒素は、以前にSNAREタンパク質切断11のイムノブロット分析により決定されるように、EC 50値を10倍に等しい濃度で添加した。すべての毒素は、ビヒクル処置対照の5％未満にmEPSC周波数を減少させた。シナプス率の減少は酔ってのESNは、パッチが適用されることが可能であったため、細胞死または改変された内因性の応答に起因していなかった繰り返し活動電位を発射電流注入に応答して膜電位（ 図3B、C）を安静に有意な変化を示さなかった。
CNTは、検出およびメジアン阻害濃度の限界（IC 50）を検出する既存の方法にMISTの感度を比較するためのESNへのBoNT / Aを添加した後、20時間後に測定した。わずか0.005としてpMでのBoNT / Aによる中毒は、IC 50 0.013 PMの値と0.5 PM（ 図4A）上記のシナプス活性の完全なサイレンシングで、mEPSC頻度の統計学的に有意な減少をもたらした。このIC 50値は、MISTの2倍の感受性であり、2-へのBoNT / Aの存在を検出することで高速にMLAよりも4倍高いことを示唆し、約0.5マウス致死単位/ mlに相当する。 SNAP-25切断の免疫ブロット測定はMISTは、約30倍より感受性であることを示し、0.38 pMでのEC 50値および0.05 pMでの最小検出可能量を産切断されたSNAREタンパク質（ 図4B）のイムノブロットベースの検出より。
図1.サスペンション適応のESNは、有糸分裂安定したままであり、多能性のマーカーを発現する。ESCの維持および分化の（A）は概略。 - レチノイン酸（RA）または白血病阻害因子（LIF）の存在または非存在は、+またはでマークされている。一次ニューロン培養のためのインビトロ （DIV）および古典的発達段階（DS） の日数の間の比較は、17が設けられている。 R1、D3およびC57BL / 6JのES細胞株（B）の増殖速度は、懸濁培養への移行後5継代によって安定させる。 （C）データは、懸濁培養において25継代にわたって測定R1、D3およびC57BL / 6J ES細胞株であるOct3 / 4の発現の実質的な変化を示さなかっサイトメトリー（フローN =各6）。 （D）の通路5と30の間で測定されたサスペンション適応R1 ESCライン用のルーチンの継代中の実際の細胞収量（黒線）。全く細胞が継代中に廃棄されていない場合、理論的累積収量はまた、（赤線）を提示されている。 （E）静的（左）または回転条件（右）の下で生産DIV 0凝集体の明視野像。凝集することなく、球状凝集体を作製し、NPC収量3倍に増加し、回転条件11に（p <0.001は、スチューデントのt検定を用いて決定）。 * P <0.05を示している。この図は、ハバードら 11から変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.形態的、PRニューロンの仕様と成熟のoteomicとトランスクリプトーム証拠DIV 7からの（A）免疫細胞化学- 。DIV 49は、ニューロンの樹枝状分岐と軸索樹状突起間の界面におけるシナプス点の外観を示しています。軸索は、タウ（緑色）で標識され、樹状突起は、MAP2（赤色）で標識される、シナプス前コンパートメントはシナプシン（白）で標識され、そして核をDAPI（青色）で染色する。 （B）発達段階特異的な発現を実証し、ニューロンのサブタイプを指定する代表的な遺伝子の縦発現プロファイリング。すべての遺伝子転写物は、細胞あたりの転写産物の概数として表現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.のESNの下で。/ G、またはTeNTの車両-のESNからのBoNT / AGおよびTeNTのにさらされたとき、シナプス活性の阻害に行く（A）代表的なトレースは、BoNT / Aの〜10×EC 50値の浴添加後20時間後に収集した。各神経毒は、対照と比較して95％以上のシナプス活性を減少させた。 （B）中毒ニューロンは電流注入を脱分極に応答して、繰り返しのAPを起動することができるままであった（のBoNT / Aのために示したが、すべての中毒の培養物において観察されるような）および（C）負の静止膜電位（Cに変化を示さなかった;> nでそれぞれの治療のための18）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
のBoNT / A-治療におけるMISTの感度の図4.決定ESNの（A）のBoNT / Aの浴添加後シナプス活性、20時間のMIST測定。代表的な電圧クランプトレース·セグメントは、BoNT /露出（左側）以下mEPSC周波数の減少を示した。 mEPSC周波数の定量（棒グラフ、右側はn =コントロールの20であり; n = 11 - 各用量について22）mEPSC周波数の用量依存性の減少を確認する。メジアン阻害濃度は、4パラメータ可変勾配（R 2> 0.91）を用いて非線形回帰の最小二乗フィットを用いて決定した。のESNでMISTによる検出限界が少なくとも0.005 pMであることに注意してください。 （B）のBoNT / SNAP-25の切断のESN結果中毒ゲル移動度シフトによって可視化されるように（右にSNAP-25切断の定量化を示す棒グラフと左側の代表的なウェスタンブロットであり; n = 4） 。エンドポイント（0.36 PMのEC 50） 対としてのSNAREタンパク質切断（SNAP-25）を使用して、感受性の低下に注意してください50）。 *はP <0.05を示す。 *** P <0.001を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
CNTの検出、血清型の決定および定量のための現在のゴールドスタンダードは、MLAです。 MLAは、ホストの全範囲問い合わせる：基質の細胞質、LC-媒介切断への毒素の細胞表面受容体への結合をインビボで （ 例えば、毒素を発生することが中毒に必要な相互作用は、毒素受容体複合体のインターナリゼーション、LC転およびシナプスの神経伝達の阻害）18。 MLAは、中毒の生理学的に関連するモデルを提供していますが、しかし、それは、汚染物質によって混乱することができ、リソースを大量に消費され、エンドポイントとして死をマウスに大量のを伴う。代替的には、BoNTの検出および定量のための細胞ベースのアッセイはまた、動物の使用を必要とする一次ニューロン培養物に、またはシナプスを形成し、典型的には、神経毒8に感受性が乏しいことができない神経芽細胞腫細胞株が挙げられるが、これらに限定されている。目で中毒の今日まで、ほとんどの測定ESE細胞ベースのプラットフォームは、SNAP-25のタンパク質分解切断の検出、VAMP1 / 2またはシンタキシン-1 11に依存してきた。 SNAREタンパク質の切断は、非直線的に生体内でシナプス阻害に関連するので、正確に中毒19,20から中毒または回復を表していない可能性が示されたので、これは問題である。
CNTの検出のための理想的な細胞ベースのモデル系は、（i）ニューロン系であろう。 （二）は、シナプスneurotypic電気的応答と結合させること; （ⅲ）すべてのCNTの血清型またはサブタイプに非常に敏感である。及び（iv）MLA上、低コストで、かつ動物使用を必要とせずに同等または改良されたオファーのスケーラビリティ、スループットアッセイ回。これらの要件を満たすために、我々は、市販のマウスESC株からグルタミン酸作動性及びGABA作動性ニューロンの高度に濃縮された、ネットワーク化された培養物を大量生産する方法を開発した。次に、定量化するためにMISTアッセイを開発したテントのBoNT / A- / Gと中毒に応答してシナプス抑制。 MISTアッセイは、任意のシナプスアクティブなニューロン集団（ 例えば、一次ニューロンまたは脳スライス）で実施することができますが、現在のESNを再現緊急ネットワークの挙動を開発し、そのためMISTアッセイに適しているだけで、in vitroで誘導されたニューロンモデルである。
ESCの文化や分化にいくつかの革新を必要とCNT研究のために定義された系譜のニューロンの十分な量を生産する。まず、を選択すると、懸濁液適応を生き残ることができるのESCを培養することにより、我々は、フィーダー細胞および分化の開始時のESCからのフィーダー細胞を精製する必要性による汚染の可能性を排除した。サスペンション適応の基礎となる分子メカニズムは不明であるが、サスペンション適応のESCは、有糸分裂アクティブのまま、のOct3 / 4の発現を保持し、神経原性であり続ける。この方法を使用して、〜1.5×10 7 EのSCは、典型的には、各通過を回収する。第二に、NPCの産生は、表向きは凝集体の内部への栄養素のアクセシビリティを増大させる、分化の間に凝集を防止する機械的攪拌を組み込むことによって、〜300％増加した。プロセスの間、私たちは、ESCの文化と神経分化のために使用される血清は神経性のESCを維持する上で最も重要な要素であることがわかった。最高の成功のために、我々はサスペンション血清のロット毎にES細胞を適応と有効期限日までのESC文化や神経分化をサポートするために、-20℃で血清を備蓄することをお勧めします。
ほとんどのシナプスアクティブの文化と同様に、DIV 14 +のESNは、pHの急激な変化、および2濃度が24時間以内に神経毒性をもたらすことができる大気中のCOへでも短時間の曝露に晒されています。 O / Nまたはより長い持続インキュベーションに続いて培養物の処理を必要とする実験のために、神経細胞を直接扱われるべきであるInはインキュベーターまたは実験前に一定のCO 2室に移した。
種々の技術がICC、転写プロファイリングおよび全細胞パッチクランプ電気生理学を含む、神経発生および神経成熟を確認した。遺伝子発現と神経細胞の形態の時間的な変化は、神経新生の発達段階を経て急速な進行と一致していた、とDIV 16で、のESNは、興奮性と創発ネットワークと抑制性ミニチュアシナプス後電流が16ビヘイビア示した。シナプス活性の証拠はのESNは、ボツリヌス中毒と破傷風の臨床症状の原因と病態生理を複製し得ることを示唆した。これは、ビヒクル処置または未処置ニューロンと比較して> 95％のmEPSC周波数を損なわのBoNT / A- / GまたはTeNTのとその中毒を示すためにMISTを用いて確認した。
のBoNT / AのMISTの感度の測定は、中央値の抑制を示した（0.5マウス致死単位/ mlに相当）0.013 pMの濃度（IC 50）及び限界の検出0.005 pMの下、浴添加後20時間で測定した。これらの値に基づいて、MISTは約2倍の敏感さであると2から4倍高速MLAよりと、切断されたSNAP-25のイムノブロットベースの検出よりも感度30倍。
まとめると、これらのデータは、幹細胞由来のニューロンのネットワーク化された集団は、中毒の生理学的に関連する、細胞ベースのモデルを提供することを示唆している。より、迅速、高感度かつ特異的な尺度を提供しながら、懸濁液適応のESCからネットワーク化ESN培養を導出するための改良された方法と組み合わせて、MISTの使用は、動物実験の必要性および関連する欠点、費用およびMLAの倫理的な問題を減少させるはずである中毒。全細胞パッチクランプ電気生理学は、活性神経毒の存在を同定するための低スループット法であるが、解像度とのSPEを提供分子的方法を使用して達成不可能であるエド。これらの知見はまた、活性依存性の方法の適用は、シナプス活性を評価するための、ネットワークの動作が神経毒の迅速かつ特異的な検出を可能にすることができるという証拠を提供する。このような高スループットのアプローチはCNTを含む神経調節薬、幅広いための実現可能な機構研究、治療スクリーニングまたは診断アッセイになるだろう。
Acknowledgments
合同科学技術局、医療S＆T部門（助成金番号CBM.THRTOX.01.10 - この作品は、衛生国立アレルギー感染症研究所（IAA番号AOD12058-0001-0000）とアメリカ国防脅威削減局の国民の協会によって資金を供給された.RC.023とCBM.THRTOX.01.RC.014）。 PBはアメリカ国防脅威削減局·国立研究評議会研究Associateship賞を開催し、KHが国家研究評議会研究Associateship賞を開催しながら、この研究を行った。私たちは、アンジェラ·アドキンスと技術支援のためのKaylie Tuznik（USAMRICD）を感謝。と編集の援助のためのシンディKronman（USAMRICD）。この記事で意見は、執筆者個人のものであり、陸軍省、国防総省、または米国政府の公式の方針を反映していない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
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