Abstract
Estudios terapéuticos y mecanicistas de las neurotoxinas clostridiales presinápticamente específicas (CNTs) han sido limitados por la necesidad de un modelo escalable, basado en la célula que produce sinapsis funcionales y experimenta respuestas fisiológicas a la intoxicación. Aquí se describe un método simple y robusto para diferenciar eficazmente células madre embrionarias murinas (CES) en linajes definidos de neuronas, conectadas en red sinápticamente activos. A raíz de un protocolo de diferenciación 8 días, las neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón (SNE) rápidamente expresar y compartimentar proteínas neurotypic, forman morfologías neuronales y desarrollar respuestas eléctricas intrínsecas. A los 18 días después de la diferenciación (DIV 18), SNE exhiben glutamatérgica activa y γ-aminobutírico (GABA) sinapsis adrenérgicos y comportamientos de la red emergente que se caracterizan por un excitador: equilibrio inhibitorio. Para determinar si la intoxicación con CNT antagoniza funcionalmente neurotransmisión sináptica, replicando de este modo ªe in vivo fisiopatología que es responsable de las manifestaciones clínicas de botulismo o tétanos, se usó la electrofisiología de células enteras patch clamp para cuantificar las corrientes espontáneas en miniatura excitatorios postsinápticos (mEPSCs) en SNE expuestas a la neurotoxina del tétanos (TeNT que) o la neurotoxina botulínica (BoNT) serotipos / A- / G. En todos los casos, SNE exhibió la pérdida casi completa de la actividad sináptica dentro de 20 hr. Neuronas intoxicados permanecieron viables, como lo demuestra sin cambios potenciales de membrana en reposo y respuestas eléctricas intrínsecas. Para caracterizar aún más la sensibilidad de este enfoque, se midieron los efectos dependientes de la dosis de la intoxicación sobre la actividad sináptica 20 hr después de la adición de BoNT / A. La intoxicación con 0.005 pM BoNT / A dio como resultado una disminución significativa de la mEPSCs, con una concentración inhibitoria media (IC 50) de 0.013 pM. Las comparaciones de dosis mediana indican que las mediciones funcionales de inhibición sináptica son más rápidos, más específica y más sensible que SNAREdivisión ensayos o el ensayo de letalidad en ratones. Estos datos validan el uso de sinápticamente acoplados, frenar las neuronas derivadas de células para la detección altamente específica y sensible de la CNT.
Introduction
El objetivo general de este método es evaluar funcionalmente la actividad sináptica en cultivos en red de neuronas derivadas de células madre expuestos a neurotoxinas clostridiales. Esta es la primera demostración de un modelo derivado in vitro que se replica funcionalmente las fisiopatologías responsables de las manifestaciones clínicas de botulismo y valida SNE como un modelo adecuado para la detección de los CNT, el cribado terapéutica y estudios mecanísticos.
BoNTs son neurotoxinas bacterianas altamente letales producidos por miembros de las especies de Clostridium. Incluyendo el recientemente propuesto BoNT / H, ocho serotipos de BoNT antigénicamente diferentes se han descrito (/ A- / H) 1,2. Todos los serotipos se expresan como 150 kDa que son péptidos después de la traducción muescas para producir una doble cadena compuesta de un 100 kDa de la cadena pesada (HC) y un 50 kDa de la cadena ligera (LC) unidos por un enlace disulfuro 3. El HC media la unión a los receptores presinápticos y entry de la toxina en la neurona a través de endocitosis sináptica. Durante el procesamiento endosomal, el HC se somete a re-organización estructural para formar un poro en la membrana de la vesícula, lo que facilita la translocación de la LC en el citosol presináptica. La LC entonces se dirige específicamente a, y se unirá soluble del receptor de N-proteína de fijación de fusión -ethylmaleimide sensible (SNARE) las proteínas en el compartimiento presináptica: SNAP-25 (BoNT / A, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) o sintaxina (Bont / C) 1. La escisión de cualquiera de estas proteínas SNARE impide el montaje de la maquinaria exocitosis sináptica, bloqueando de este modo la liberación de neurotransmisores. Esta combinación de focalización neuronal eficiente y localización presináptica hace BoNTs los venenos más potentes que se conocen, con dosis letales humanos estimados tan bajas como 0.1 - 1 ng / kg 1.
Ensayos bioquímicos se pueden utilizar para detectar la presencia o actividad de CNT CL con alta sensibilidad. Sin embargo, estos métodos no logran interrogate la capacidad de la toxina para unirse, entrar, activar y función dentro de las neuronas, y por lo tanto son medidas indirectas y posiblemente engañosas de la presencia de la toxina activa. Por el contrario, los ensayos funcionales de intoxicación, tales como el ensayo de letalidad en ratones (MLA) evaluar exhaustivamente la capacidad del CNT para negociar con éxito todas las fases de captación y activación, proporcionando evaluaciones más relevantes y específicos de la actividad de la toxina. Mientras que el diputado es el estándar de oro de la detección BoNT, es un método in vivo que utiliza la muerte como un punto final y por lo tanto tiene una utilidad limitada como una plataforma de investigación. Los intentos de desarrollar modelos basados en células de CNT intoxicación adecuado para estudios de mecánica y detección terapéutico también han sufrido importantes limitaciones. Mientras que cultivos de neuronas primarias ofrecen un alto grado de relevancia fisiológica, su uso se complica por una serie de factores, incluyendo el coste de alta de recursos, rendimiento relativamente bajo, la presencia de múltiples sub neuronaltipos y extensa supervisión regulatoria y administrativa involucrado con el uso de animales. Como una alternativa a las neuronas primarias, líneas celulares neurogénicos (que pueden ser inducidos a adoptar propiedades similares a neuronas por la estimulación química), tales como neuroblastomas y las células cromafines adrenales se han utilizado como modelos in vitro de la intoxicación. Puesto que estas células son cultivadas de forma continua antes de la inducción, son altamente escalable y por lo tanto muy adecuado para enfoques moderado rendimiento. Sin embargo, su relevancia es cuestionable ya que los fenotipos inducidos son típicamente heterogéneo, son poco sensibles a la CNT y dejan de exhibir comportamientos neuronales críticos, incluyendo la incapacidad para formar compartimentos pre y post-sinápticas que se ensamblan en las sinapsis funcionales 4. En ausencia de compartimentos presinápticos fisiológicamente intactas, la gama completa de la toxina: interacciones neurona no puede ser replicado y por lo tanto las mediciones funcionales de intoxicación no son posibles 5. Not sorprendentemente, los intentos de llevar a cabo estudios sobre el mecanismo o la detección de drogas para BoNTs utilizando líneas celulares neurogénica inducida han dado lugar a resultados que no son consistentes con estudios in vivo y de neuronas primarias 6.
Se ha propuesto que se derivan del sistema nervioso (CNS), las neuronas centrales derivados de células pueden proporcionar una plataforma basada en células de próxima generación para la investigación BoNT que combina la relevancia de las neuronas primarias con la flexibilidad de las líneas celulares cultivadas 7-10. En particular, las neuronas derivadas de células madre de ratón (SNE) se han encontrado para ser altamente sensibles a dosis fisiológicas de BoNT / A- / G y para replicar muchos en las respuestas in vivo a la intoxicación, incluyendo persistencias diferenciales, actividad mejorada intoxicación, y serotipo potencias específico de 5,8,11. Estos comportamientos indican que en los mecanismos in vivo de la captación de BoNT, el procesamiento, el tráfico y la actividad se conservan en SNE. Sin embargo, la inhibición de activit sinápticay es la firma manifestación de botulismo, y por lo tanto demostrar una pérdida de actividad sináptica tras la intoxicación por CNTs es esencial antes de concluir que SNE son un adecuado en el modelo basado en células derivadas vitro para los estudios de la CNT.
Para medir los efectos de la intoxicación con nanotubos de carbono en la actividad sináptica, se utilizó de células enteras electrofisiología patch-clamp para cuantificar las corrientes monosynaptic en 21 + SNE tratados con vehículo o DIV tratado-CNT. Encontramos que la intoxicación del SNE con BoNT / A- / G o TeNT que causó la pérdida de> 95% de la actividad sináptica dentro de 20 horas en todos los casos. Además de la caracterización realizada 20 horas después de la intoxicación con BoNT / A reveló un efecto dependiente de la dosis en la actividad sináptica, con un límite de detección inferior al 0,005 pM y un valor de IC50 de 0,013 pM. Estos hallazgos indican que el marco de la sensibilidad y el tiempo de detección electrofisiológica de intoxicación se mejoran considerablemente en comparable a base de inmunoblot analisis de SNAP-25 de escisión y en ensayos de letalidad en ratón in vivo, lo que demuestra que las mediciones funcionales de intoxicación en cultivos de neuronas sinápticamente activos pueden facilitar métodos más sensibles, específicos y rápidos para caracterizar la respuesta celular a BoNT.
Protocol
1. Adaptación de los CES de alimentador libre de células Suspensión Cultura
- CES descongelar a 37 ° C hasta que una astilla de hielo permanece.
- Usando una pipeta P1000, transferir suavemente 1-2,5 x 10 6 disociado CES a una placa de cultivo tratados con no tejido que contiene 10 ml de medio de ESC pre-calentado. Incubar en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado durante 20 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Después de 20 h, lavar las células mediante la transferencia suavemente el cultivo en suspensión a un tubo cónico de 15 ml usando una pipeta de 10 ml serológica. Pellet CES durante 3 min a 200 x g. Durante la vuelta, añadir 10 ml de medio fresco ESC de nuevo a plato de baja adherencia.
- Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de evitar que se desprenda el sedimento celular, y añadir 1 ml de medio fresco ESC a la celda de pellets. Transferir las células a la placa bacteriana usando una pipeta P1000 y volver a la incubadora.
- Observar las células diariamente hasta que los agregados se hacen visibles a simple vista (típicamente 4 - 8 días (d); agregados serán 0,2- 0,5 mm). Si los agregados no son evidentes después de 4 días, repita el paso 1.3. Una vez agregados son visibles, disociar y mantener los CES como se describe en la Sección 2.
2. ESC pases y Mantenimiento
- Transferencia ESC agrega a un tubo cónico de 15 ml usando una pipeta de 10 ml estéril y permitir que los agregados se asienten a un sedimento compacto (típicamente de 3 - 5 min). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento de células, y lavar los agregados con 5 ml de PBS. Aunque la sedimentación por gravedad se recomienda, células alternativamente pellets a 100 xg durante 2,5 minutos en lugar de ahorrar tiempo.
- Aspirar PBS y añadir 500 l de tripsina. Incubar agregados en tripsina durante 3 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 500 l medio ESC para diluir la tripsina y suavemente triturar 10 veces con una pipeta P1000 para romper los agregados. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
- Pellet disociarse células durante 3 min a 200 xg y resuspender las células a una concentración final de 1,0x 10 7 células / ml en medio de ESC. Transferencia de 150 l (1,5 x 10 6 células) a 10 ml de medio fresco ESC en un plato de 10 cm bacteriana y volver al cultivo de tejidos incubadora durante 48 hr. El exceso de los CES se pueden diferenciar, criopreservado en 1 - 5 x 10 6 células / ml en 90% de medio ESC suplementado con 10% de DMSO, o descartados.
- Passage agregados cada 48 hr. Agregados listos para el paso será claramente visible, con diámetros superiores a 0,5 mm.
NOTA: La descongelación y cultivo de células criopreservadas, suspensión adaptada se llevan a cabo por pasos 1.2 a 1.4. Los áridos estarán listos para pases dentro de 48 a 72 h.
3. Diferenciación Neuronal
NOTA: Realizar los pasos 3.1 a 3.5 antes de mediodía y paso 3.7 después de mediodía. Una visión general de los procedimientos de diferenciación se presenta en la Figura 1A.
- Disociar CES como en los pasos 2/1 a 2/5. Transferencia de 350 l (3,5 x 10 6) de disociand CES a una placa de 10 cm bajo el apego que contiene 25 ml de medio de diferenciación. Colocar en un agitador orbital ajustado a 30 - 45 rpm dentro de un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de CO 2. Este es el primer día de diferenciación, denominado días in vitro (DIV) -8.
Nota: el uso de un plato de ultra-bajo de fijación aumenta el costo del método, pero produce rendimientos ligeramente más grandes que los platos de Petri bacterianas dado que los agregados de vez en cuando pueden adherirse a placas de Petri. Si se prefieren diferentes tamaños de plato, los volúmenes de medio y el número de células se pueden escalar en consecuencia. - Después de 48 hr (-6 DIV), utilizar una pipeta de 25 ml para transferir los agregados de células diferenciadoras a un tubo cónico de 50 ml. Añadir de inmediato un frescas 25 ml de medio de diferenciación a la placa de Petri.
- Permitir que los agregados se asienten más de 2 - 5 min, producción de un gránulo visible que es 1 - 2 mm de profundidad. Ignorar células individuales o pequeños agregados que permanecen en suspensión. Aspirar con cuidado el medio y transferir la cell sedimentar de nuevo a la placa de Petri utilizando un P1000. Colocar en un agitador rotatorio en una incubadora de cultivo de tejidos.
- En DIV -4 repita el paso 3.2. El sedimento será 2 - 4 mm de profundidad. Reemplace 30 ml de medio de diferenciación suplementado con 6 mM ácido trans-retinoico (RA) a la placa de Petri. Regreso al agitador rotatorio en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas más.
- En DIV -2 repita el paso 3.3. El sedimento será 4 - 8 mm de profundidad en este punto.
- En DIV -1, preparar las superficies de placas como en la Sección 4.
- En DIV 0, descongelar 5 ml de medio tripsinación previamente en alícuotas y congelado NPC a 37 ° C durante 5 a 10 minutos y el lugar en una campana de cultivo de tejidos. Usando una pipeta de 25 ml, la transferencia de la diferenciación de los agregados a un tubo cónico de 50 ml. Permitir que los agregados se asienten y medio cuidadosamente aspirado. Lavar el precipitado dos veces con 10 ml de PBS, permitiendo que los agregados se asienten entre lavados.
- Después del segundo lavado PBS, añadir 5 ml de medio de tripsinización NPC al sedimento y se incuba a 376; C durante 5 min. Golpee suavemente el tubo después de 2,5 min.
- Añadir 5 ml de inhibidor de tripsina de soja 0,1% (STI) para inactivar la tripsina y mezclar por inversión. Tritura suavemente 10 - 15 veces con una pipeta de 10 ml serológica hasta que se produce una suspensión de células relativamente homogénea.
- Transferir lentamente la suspensión celular a un filtro de células de 40 micras o 70 micras colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Una vez que toda la suspensión se ha filtrado, añadir 1 ml de medio de N2 para lavar las células restantes a través del filtro y sedimentar la suspensión celular disociada durante 6 min a 200 x g.
- Aspirar medio sin perturbar el sedimento. Lavar las células dos veces con 10 ml de medio N2, sedimentar células durante 5 min a 200 xg y triturando entre los lavados con un P1000. Antes de la segunda lavado, contar las células utilizando un hemocitómetro.
- Resuspender las células en medio N2 a 1 x 10 7 células por ml SNE y de la placa a una densidad celular de 150.000 - 200.000 células / cm2.
- Traslado recién plated SNE a una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C y 5% de CO2 y mantener como en la Sección 5.
4. Preparación de Superficies Cultura para Chapado Neural Precursores en DIV 0
- Preparar placas de cultivo de tejidos tratados con al menos 1 día antes de chapado. Añadir suficiente polietilenimina (PEI; 25 mg / ml en H2O estéril) o poli-D-lisina (PDL; 100 g / ml en H2O estéril) para cubrir de cultivo de tejidos tratados con platos de plástico y se incuba O / N en 37 ° C.
- La mañana del enchapado, lavar los platos dos veces con doble destilada H 2 O y una vez con PBS. Después del lavado final, añadir suficiente medio N2 para cubrir el plato (por ejemplo, 1 ml por pocillo de una placa de 12 pocillos o 4 ml por placa de 6 cm).
- Preparar 18 mm cubreobjetos de vidrio al menos un día antes de chapado neurona. Cubreobjetos limpios por plasma-limpieza durante 4 min.
- Inmediatamente transferir cubreobjetos limpiados de Parafilm etanol-lavado en la parte inferior de unaplato grande estéril y añadir 400 l de solución de PEI o PDL, preparadas como en el paso 4.1. Incubar O / N a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.
- Por la mañana, lavado cubreobjetos tres veces con agua y añadir 5 mg / ml de laminina en PBS durante 1-3 horas a 37 ° C. Antes de disociar las neuronas, aspirar el laminina y transferir inmediatamente el portaobjetos a un pocillo de una placa de 12 pocillos que contenía 1 ml de medio de la APN, asegurándose de mantener la cara tratada hacia arriba.
- Platos de la tienda y cubreobjetos a 37 ° C hasta NPCs están listos a la placa.
5. mantenimiento de las neuronas
- En DIV 1, medio aspirado y reemplazar con medio de cultivo N2.
- En DIV 2 y 4, medio aspirado y reemplazar con medio de cultivo B27.
- A DIV 8, medio aspirado y reemplazar con inhibidores de la mitosis medio de cultivo que contienen B27 para eliminar la contaminación de las células no neuronales.
- En DIV 12, reemplazar con medio de cultivo B27.
- No quite DIV12 + SNE de 5% de CO 2 hasta que esté listo para su uso.
6. La inhibición medido de transmisión sináptica (MIST) Ensayo para la cuantificación de miniatura Corrientes Excitatory post-sinápticas
PRECAUCIÓN: Las neurotoxinas clostridiales son las sustancias más tóxicas conocidas, estimando LD 50 humana valores tan bajos como 0.1 - 1 ng / kg. Obtener las aprobaciones necesarias antes de utilizar estas toxinas y tomando las precauciones adecuadas.
- Cuidadosamente diluir BoNT / A 100 veces la concentración final deseada en medio de cultivo ESN y cálido a 37 ºC. Añadir el volumen adecuado de la toxina a DIV 21 + ESN culturas, agitar la placa de cultivo, y retorno a la incubadora.
- Si se analizarán las células más de 4 horas después de la intoxicación, añadir la toxina al plato y remolino sin la eliminación del 5% de CO 2, tal como directamente en la incubadora o en una cámara de CO 2 constante.
- En el punto de tiempo apropiado, aspiracioneste ESN medio de cultivo y se lava dos veces con tampón de registro extracelular (ERB). Añadir 4 ml de ERB suplementados con 5,0 mM tetrodotoxina y 10 mM bicuculina, bloqueando los potenciales de acción y antagonizar la actividad del receptor GABA A, respectivamente.
- Llevar la cápsula de amañar electrofisiología. No es necesario ni el control ni la perfusión de temperatura para el ensayo de niebla.
- Tire de vidrio de borosilicato con un extractor micropipeta para producir una pipeta de grabación con 5-10 mΩ de resistencia y llenar con tampón de registro intracelular. Sumergir suavemente pipeta grabación rellenado siliconado reactivo antes de la grabación.
- Utilizando una jeringa llena de aire, proporcionar una presión positiva como la pipeta de grabación se baja en el ERB. Después de aterrizar suavemente la pipeta de grabación en el soma de la neurona a ser grabada, eliminar la presión positiva y formar una gigaseal. Disminuya la tensión de retención de -70 mV. Cuidado aplique presión negativa a entrar en configuración de célula completa.
- Cambiar a la actual-clamp para controlar y registrar en reposo potencial de membrana. Sin ajuste para potenciales de unión de líquidos, el potencial de membrana en reposo será de entre -67 a -82 mV.
- Realice una grabación de fijación de voltaje -70 mV continua durante 4 - 5 min para detectar miniatura excitatorios corrientes postsinápticas (mEPSCs).
- Analizar 4 min de los datos registrados para la detección mEPSC utilizando software de detección de pico con los siguientes valores: Umbral, 5; Período para buscar un máximo local, 10000 microsegundos; Tiempo antes de un pico de la línea de base, 5.000 microsegundos; Período para buscar un tiempo de decaimiento, 20000 microsegundos; Fracción de pico para encontrar un tiempo de decaimiento, 0,37; Periodo promedie una línea de base, 1.000 microsegundos; Umbral de área, 20; Número de puntos a pico promedio, 1; Dirección de pico, negativo.
- Recoger y guardar información sobre eventos detectados. Se divide el número de eventos detectados en 4 min por 240 para determinar la frecuencia mEPSC en Hz.
- Recoger frecuencias mEPSC para 8-12 controls y 8-12 muestras tratadas con BoNT para cada condición de exposición. Analizar la frecuencia contra la edad y controles emparejados por lote. Determinar la significación estadística de% de inhibición de la actividad sináptica usando uno-manera de la prueba ANOVA y la prueba post-hoc de Dunnett.
Representative Results
Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación que permite la producción económica de grandes cantidades de neuronas derivadas de células madre de alta pureza de los CES de ratón (que se detallan en la Figura 1A) 8,11. Este método ha sido utilizado durante un período de años para diferenciar reproducible generados privada y disponibles comercialmente líneas ESC en neuronas de los linajes definidos 12-14. Elementos críticos de este protocolo incluyen (1) la adaptación de los CES en Alimentador de cultivo en suspensión de células libres; (2) el mantenimiento adecuado de los cultivos en suspensión; y (3) la diferenciación en condiciones rotativos. Transición a cultivo en suspensión reduce drásticamente el tiempo y el costo de mantenimiento ESC, y evita la necesidad de eliminar las células alimentadoras antes de la diferenciación. Tras la adaptación de suspensión, Oct3 / 4 expresión es consistente a través de al menos 30 pasajes, lo que indica que la adaptación suspensión no altera la expresión de marcadores de pluripotencia (Figura 1B-D 7 células por pasaje. Esto suele ocurrir dentro de los diez pasos después de la adaptación de suspensión o cinco pasajes después de la descongelación de los CES que antes eran suspensión adaptada. Rotación mecánica de diferenciar los agregados también se encontró que era crítica para un mayor rendimiento neuronal. La adición de un agitador rotatorio elimina la formación de super-agregado, el aumento de la viabilidad agregada y la producción de un aumento de ~ 300% en el rendimiento de células progenitoras neurales (CPN) en DIV 0 (Figura 1E).
Una diferenciación típico comienza con 3.5 x 10 6 CES en DIV -8 y produce 115 x 10 6 NPCs en DIV 0, aproximadamente el 60% de los que sobrevivirán y se convierten en neuronas. El 40% restante comprende células no neuronales y se eliminan en gran medida por la privación de suero entre DIV 0 - 1. El pequeño número de persistir glía puede eliminarse mediante la adición de inh mitóticoibitors de DIV 2-4 o DIV 8 - 12. densidad de placas es crítica en DIV 0; neuronas chapados demasiado poco no sobrevivirán más allá de 2 semanas. Pocos días después de galvanoplastia, neuronas diferenciadas presentan morfologías neuronales y compartimentan proteínas neurotypic, como la MAP2 marcador somatodendrítico y el marcador axonal Tau (Figura 2). Por DIV 14 sinapsina 1 + puntos lagrimales se pueden identificar en las interfaces axodendritic, sugestivos de la formación de sinapsis. Esto es consistente con la expresión de proteínas marcadoras sinápticas anteriores a DIV 7 8,11. Morfologías neuronales siguen madurando a través DIV 21, en el que las culturas tiempo exhibir pérgolas axodendritic elaborados y grandes puntos lagrimales sináptica (Figura 2). Si se mantiene adecuadamente, SNE permanecen viables y activo durante al menos 4 semanas después de la siembra.
Longitudinal de perfiles de expresión usando ARN-secuenciación corroborada evidencia morfológica y proteómico de una especificación neuronald maduración 11,15. Marcadores representativos de progresión en el desarrollo exhiben perfiles de expresión de una etapa específica, incluyendo Oct3 / 4, Nestin, DCX, NeuN y KCC2 (Figura 2B). Por DIV 0, SNE expresó abundantes ejemplares de proteínas estructurales específicos de neuronas, incluyendo MAP2 y Tau. En consonancia con los resultados anteriores, se observaron marcadores para sólo dos subtipos neuronales: mesencéfalo / hindbrain neuronas glutamatérgicas VGLUT2 expresan y las interneuronas GABAérgicas 8. Correspondientemente, una amplia gama de marcadores glutamatérgicas y GABAérgicas exhibió un fuerte aumento en la expresión entre DIV 0 y 7 DIV, incluyendo proteínas SNARE pre-sinápticos necesarios para la liberación de neurotransmisores; receptores de neurotransmisores necesarios para las respuestas postsinápticas; y proteínas de andamiaje obligados a atar estos receptores en la membrana post-sináptica. Las neuronas exhiben características eléctricas intrínsecas maduros por DIV 14 y corrientes excitatorias miniatura espontáneas post-sinápticas por DIV16 16.
Se utilizó la inhibición de medición de Synaptic Transmisión (MIST) de ensayo para evaluar el efecto de la intoxicación sobre la actividad sináptica. Mediante la comparación de las frecuencias mEPSC entre DIV intoxicado y tratado con vehículo + 24 SNE, niebla proporciona una medición cuantitativa y específica de la intoxicación sobre la base de la inhibición funcional de la actividad sináptica (Figura 3A). MIST se utilizó para medir los efectos de la BoNT / A- / G o la tienda en la actividad sináptica en SNE en 20 horas después de la adición de baño de cada toxina. Las toxinas se añadieron a una concentración equivalente a 10 veces el valor de EC 50, tal como se determina previamente mediante análisis de inmunotransferencia de proteínas SNARE de escisión 11. Todas las toxinas reducen frecuencias mEPSC a menos del 5% de los controles tratados con vehículo. Las reducciones en las tasas sinápticas no eran atribuibles a la muerte celular o respuestas intrínsecas alterados, ya SNE intoxicados fueron capaces de ser parcheado, dispararon potenciales de acción repetidasen respuesta a la inyección de corriente y exhibió ninguna alteración significativa en el potencial de reposo de membrana (Figura 3B, C).
Para comparar la sensibilidad de MIST a los métodos existentes para detectar los CNT, el límite de detección y la concentración inhibitoria media (IC 50) se determinaron 20 horas después de la adición de BoNT / A a SNE. Intoxicación por tan poco como 0,005 pM BoNT / A produjo una reducción estadísticamente significativa en la frecuencia mEPSC, con un valor de IC 50 de 0.013 pM y el silenciamiento completo de la actividad sináptica por encima de 24:05 (Figura 4A). Este valor IC 50 corresponde a aproximadamente 0,5 unidades de ratón letales / ml, lo que sugiere que MIST es dos veces más sensible y de 2 a 4 veces más rápido que la MLA en la detección de la presencia de BoNT / A. Mediciones inmunotransferencia de SNAP-25 escisión producen un valor de EC50 de 24:38 y una dosis mínima detectable de 24:05, lo que indica que MIST es aproximadamente 30 veces más sensibleque la detección basada en inmunotransferencia de proteínas SNARE escindidas (Figura 4B).
Figura 1. Suspensión SNE-adaptado permanecen mitóticamente estables y expresan marcadores de pluripotencia. (A) Esquema de mantenimiento y la diferenciación de ESC. La presencia o ausencia de ácido retinoico (RA) o el factor inhibidor de la leucemia (LIF) está marcada por un + o -. Una comparación entre los días in vitro (DIV) y las etapas clásicas del desarrollo (DS) de los cultivos primarios de neuronas se proporciona 17. Tasas (B) Proliferación de R1, D3 y líneas de células C57BL / 6J ES estabilizan por cinco pasajes después de la transición al cultivo en suspensión. (C) La citometría de flujo de datos no demuestran ningún cambio sustantivo en Oct3 / 4 expresión en la R1, D3 y líneas de células C57BL / 6J ES medido más de 25 pases en cultivo de suspensión (n = 6 para cada uno). (D) los rendimientos celulares real durante los pases de rutina para una línea R1 ESC suspensión-adaptado medido entre los pasajes 5 y 30 (línea de color negro). Rendimientos acumulados teóricos si no hay células se desechan durante los pases también se presentan (línea roja). (E) Las imágenes de campo brillante de DIV 0 agregados producidos bajo condiciones estáticas (izquierda) o condiciones rotativos (derecha). Condiciones de Rotary producen agregados esféricos sin aglomeración y aumentaron NPC produce 3 veces (p <0,001, determinaron mediante la prueba t de Student) 11. * Indica una P <0,05. Esta cifra ha sido modificado de Hubbard et al. 11 Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. morfológica, prpruebas oteomic y transcriptómica de la especificación neuronal y la maduración (A) La inmunocitoquímica de DIV 7 -. DIV 49 demuestra la arborización neuronal y la aparición de puntos lagrimales sináptica en las interfaces axodendritic. Los axones se etiquetan con Tau (verde), dendritas se etiquetan con MAP2 (rojo), compartimentos pre-sinápticos están etiquetados con sinapsina (blanco), y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). (B) el perfil de expresión de genes Longitudinal representativos que demuestran el desarrollo expresión etapa específica y que especifican subtipos neuronales. Todas las transcripciones de genes se expresan como número aproximado de transcripciones por célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. SNE bajo. vaya inhibición de la actividad sináptica cuando se expone a la BoNT / AG y tienda de campaña (A) trazas representativas de SNE recogieron 20 horas después de la adición del baño de ~ 10 x CE 50 valores de BoNT / A - / G, tienda o vehículo. Cada neurotoxina reduce la actividad sináptica en más del 95% en comparación con los controles. (B) neuronas intoxicados permanecieron capaz de disparar APs repetidos en respuesta a la despolarización de inyección de corriente (como se demostró por BoNT / A, pero observó en todas las culturas intoxicados) y (C) no exhibió cambios en el potencial de membrana en reposo negativo (C; n> 18 para cada tratamiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Determinación de la sensibilidad de MIST en BoNT / A tratadaSNE. (A) mediciones MIST de actividad sináptica 20 horas después de la adición del baño de BoNT / A. Segmentos de trazas de fijación de voltaje representativos mostraron una disminución en la frecuencia mEPSC siguiente BoNT / A de la exposición (lado izquierdo). La cuantificación de la frecuencia mEPSC (gráfico de barras, lado derecho, n = 20 para los controles; n = 11 a 22 por cada dosis) confirma una disminución dependiente de la dosis en la frecuencia mEPSC. La concentración inhibitoria media se determinó con mínimos cuadrados un ataque de una regresión no lineal utilizando una pendiente variable de cuatro parámetros (R 2> 0,91). Tenga en cuenta el límite de detección de niebla en SNE es de al menos 0.005 pM. (B) BoNT / A intoxicación de los resultados SNE en la escisión de SNAP-25 como se visualiza por los cambios de movilidad en gel (una transferencia de Western representativa en el lado izquierdo con un gráfico de barras que muestra la cuantificación de la SNAP-25 de escisión a la derecha; n = 4) . Tenga en cuenta la disminución de la sensibilidad utilizando SNARE corte de la proteína (SNAP-25) como criterio de valoración (CE 50 de 24:36) vs. 50 de 0.013 horas). * Indica una P <0,05; *** Indica una p <0,001. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El actual estándar de oro para la detección de la CNT, la determinación del serotipo y cuantificación es la MLA. El MLA interroga a toda la gama de host: la escisión de toxina interacciones necesarias para la intoxicación que se produzca in vivo (por ejemplo, la toxina de la unión a un receptor de superficie celular, la internalización del complejo de toxina-receptor, LC translocación en el citoplasma, mediada-LC de sustrato y la inhibición de la neurotransmisión sináptica) 18. Sin embargo, a pesar de la MLA ofrece un modelo fisiológicamente relevantes de la intoxicación, es intensivo en recursos, puede ser confundido por los contaminantes e involucra a un gran número de ratones con la muerte como un punto final. Alternativamente, los ensayos basados en células para la detección y cuantificación de BoNT se han limitado a cultivos de neuronas primarias, que también requieren el uso de animales, o para líneas celulares de neuroblastoma, que no pueden formar sinapsis y típicamente exhiben pobre sensibilidad a neurotoxinas 8. Hasta la fecha, la mayoría de las mediciones de la intoxicación en ªplataformas basadas en células ESE se han basado en la detección de la escisión proteolítica de SNAP-25, VAMP1 / 2 o sintaxina-1 11. Esto es problemático porque corte de la proteína SNARE se ha demostrado ser no lineal asociado con la inhibición sináptica in vivo y por lo tanto pueden no representar con precisión la intoxicación o la recuperación de intoxicación 19,20.
Un modelo de sistema basado en células ideal para la detección CNT sería (i) ser a base de neurona; (Ii) ser acoplado sinápticamente con respuestas eléctricas neurotypic; (Iii) ser altamente sensible a todos los serotipos de la CNT o subtipos; y (iv) la oferta de escalabilidad, rendimiento y ensayo de tiempos que son equivalentes o mejorado en el eje de acción, a menor costo, y sin que sea necesario el uso de animales. Para cumplir estos requisitos, hemos desarrollado un método para producir grandes cantidades de altamente enriquecido, culturas red de neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas de líneas ESC ratón comercialmente disponibles. Desarrollamos entonces el ensayo MIST cuantificarinhibición sináptica en respuesta a la intoxicación con tienda de campaña y BoNT / A- / G. Mientras que el ensayo MIST puede llevarse a cabo en cualquier población sinápticamente activa neurona (por ejemplo, neuronas primarias o cortes de cerebro), actualmente SNE son el modelo de neurona sólo in vitro derivada que se desarrolla de forma reproducible comportamientos de la red emergentes y por lo tanto es apropiado para el ensayo de niebla.
La producción de una cantidad suficiente de neuronas del linaje definido para los estudios de la CNT requieren varias innovaciones en la cultura ESC y la diferenciación. En primer lugar, mediante la selección para el cultivo de los CES y que pueden sobrevivir suspensión de adaptación, eliminamos la posibilidad de contaminación por las células alimentadoras y la necesidad de purificar las células de alimentación de los CES en el inicio de la diferenciación. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a suspensión de adaptación son desconocidos, los CES de suspensión adaptada permanecen activas mitóticamente, retener Oct3 / 4 de expresión y siguen siendo neurogénica. Usando este método, ~ 1,5 x 10 7 ESC se recuperaron normalmente cada pasaje. En segundo lugar, la producción de NPC se aumentó ~ 300% mediante la incorporación de agitación mecánica para evitar la aglomeración durante la diferenciación, aparentemente aumentar la accesibilidad de nutrientes a los interiores de los agregados. Durante el proceso, se encontró que el suero utilizado para el cultivo ESC y la diferenciación neuronal es el componente más crítico en el mantenimiento de los CES neurogénica. Para un mejor éxito, se recomienda la suspensión adaptar células madre embrionarias para cada lote de suero y el almacenamiento de suero a -20 ° C para apoyar la cultura ESC y la diferenciación neuronal a través de la fecha de caducidad.
Al igual que con la mayoría de las culturas sinápticamente activos, DIV 14 + SNE son muy susceptibles a los cambios bruscos en el pH, e incluso una breve exposición a concentraciones de CO2 atmosférico pueden provocar neurotoxicidad dentro de las 24 horas. Para los experimentos que requieren tratamiento de los cultivos seguido de incubaciones O / N o más, las neuronas se debe tratar directamente duraderas in la incubadora o transferido a una cámara antes de la experimentación constante CO 2.
Una variedad de técnicas confirmó la neurogénesis y la maduración neuronal, incluyendo ICC, perfiles de transcripción y de células enteras de electrofisiología patch-clamp. Los cambios temporales en la expresión génica y la morfología de las neuronas fueron consistentes con una progresión rápida a través de las etapas de desarrollo de la neurogénesis, y por DIV 16, SNE exhibieron excitatorio y corrientes postsinápticas inhibitorias en miniatura con la red emergente los comportamientos que 16. La evidencia de la actividad sináptica sugirió que SNE puede replicar los fisiopatologías responsables de las manifestaciones clínicas del botulismo y el tétanos. Esto fue confirmado por el uso de MIST para mostrar que la intoxicación con BoNT / A- / G o TeNT deteriorado frecuencias mEPSC de> 95% en comparación con las neuronas tratadas con vehículo o no tratados.
Las mediciones de la sensibilidad de la NIEBLA de BoNT / A indicaron un inhibidor medianaconcentración (IC 50) de 0,013 pM (equivalente a 0,5 ratón letal unidades / ml) y un límite de detección por debajo de 0.005 pM, medido a 20 hr después de la adición del baño. Sobre la base de estos valores, MIST es aproximadamente dos veces tan sensible como y 2 - 4 veces más rápido que la MLA y 30 veces más sensible que la detección basada en inmunoblot de escinde SNAP-25.
Colectivamente, estos datos sugieren que las poblaciones en red de neuronas derivadas de células madre ofrecen un modelo fisiológicamente relevante, basada en células de la intoxicación. En combinación con la mejora de los métodos para derivar culturas ESN en red de los CES de suspensión adaptada, el uso de MIST debería reducir la necesidad de experimentar con animales y las desventajas asociadas, los costos y las preocupaciones éticas de la MLA mientras que proporciona una medida más rápida, sensible y específica de intoxicación. Aunque la electrofisiología de células enteras patch-clamp es un método de bajo rendimiento para identificar la presencia de neurotoxinas activas, que ofrece una resolución y speed que es inalcanzable utilizando métodos moleculares. Estos resultados también proporcionan pruebas de que la aplicación de métodos dependientes de la actividad para evaluar la actividad sináptica y comportamiento de la red puede permitir la detección rápida y específica de neurotoxinas. Tales enfoques de mayor rendimiento harían estudios mecánicos, detección terapéutico o ensayos diagnósticos factibles para una amplia gama de agentes neuromoduladores, incluidos los NTC.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (IAA número AOD12058-0001-0000) y la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa - Conjunto de Ciencia y Tecnología Oficina, Médico S & T División (los números de subvención CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 y CBM.THRTOX.01.RC.014). Esta investigación fue realizada mientras PB celebró una Defense Threat Reducción Premio Associateship Investigación Agencia-Consejo Nacional de Investigación y KH celebró un Premio Associateship Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Damos las gracias a Angela Adkins y Kaylie Tuznik (USAMRICD) para la asistencia técnica; y Cindy Kronman (USAMRICD) por su asistencia editorial. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del Ejército, el Departamento de Defensa, o el Gobierno de Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. ESC and ESN | |||
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC culture medium Formulation and notes: 500 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 6 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 6 mL |
| ES qualified FBS | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 90 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 3 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 1.1 mL |
| 107 Units/mL LIF | Millipore | ESG1107 | 60 μL |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | Media: ESC differentiation medium Formulation and notes: 436.6 mL |
| 100x MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| ESC-qualified serum | Applied Stem Cell | ASM-5007 | 50 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 0.9 mL |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Media: NPC trypsinization medium Formulation and notes: 100 mL |
| 0.5 M EDTA (18.3%) | Sigma-Aldrich | 3690 | Media: freeze in 5 mL aliquote Formulation and notes: 0.266 mL |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | 50 mg |
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Media: Surface coating solutions Formulation and notes: 2.5 µg/mL in H20 |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P7280 | Media: use within 1 wk Formulation and notes: 100 µg/mL in H20 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 5 µg/mL in H20 |
| DMEM/F12 + GlutaMAX | Life Technologies | 10565-018 | Media: NPC culture medium Formulation and notes: 492.5 mL |
| 100x N2 vitamins | Life Technologies | 17502-048 | Media: store at 4 °C for up to 1 month Formulation and notes: 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | Media: ESN culture medium Formulation and notes: 482.5 mL |
| 50x B27 vitamins | Life Technologies | 17504-044 | Media: store at 4 °C for up 1 month Formulation and notes: 10 mL |
| 200 mM L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | 30-2115 | 5 mL |
| 100x antibiotics | Sigma-Aldrich | A5955 | 2.5 mL |
| 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 °C Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium. |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| TrypLE Express Trypsin | Life Technologies | 12605-010 | Media: Miscellaneous Formulation and notes: store at RT |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | store at RT |
| soybean trypsin inhibitor (STI) | Sigma-Aldrich | T6414 | store at -20 °C |
| ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | store at RT |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix. |
| retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 °C. Stable for 6 mos. |
| Table 2. MIST | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: Extracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 58.44 MW: 140 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60135 | Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) Final Concentration (mM): 74.56 MW: 3.5 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 119.98 MW: 1.25 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Final Concentration (mM): 110.98 MW: 2 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8644 | Final Concentration (mM): 180.16 MW: 10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| K-gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Media: Intracellular Recording Buffer Final Concentration (mM): 234.5 MW: 140 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71386 | Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) Final Concentration (mM): 58.44 MW: 5 |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 507.18 MW: 2 |
| Li-GTP | Sigma-Aldrich | G5884 | Final Concentration (mM): 523.18 MW: 0.5 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 110.98 MW: 0.1 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63069 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 95.21 MW: 1 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 380.35 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Media: Stable at 4 °C for at least 6 mo. Final Concentration (mM): 238.3 MW: 10 |
| bicuculline | Tocris | 131 | Media: Miscellaneous Final Concentration (mM): 0.01 MW: 417.85 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Final Concentration (mM): 0.01 MW: 276.12 |
| Tetrodotoxin | Sigma-Aldrich | A8001 | Final Concentration (mM): 0.005 MW: 645.74 |
| BoNT/A-/G | Metabiologics | N/A | Media: Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Tetanus toxin | Sigma-Aldrich | T3194 | Final Concentration (mM): TBD MW: 150,000 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL-2 | Final Concentration (mM): N/A MW: N/A |
| Table 3. Equipment and Software | |||
| MiniAnalysis (version 6.0.7) | Synaptosoft, Inc. | N/A | Event detection software |
| Igor Pro (version 6.22A) | WaveMetrics | N/A | Software for visualization of recordings |
| Patchmaster | Heka | N/A | Data acquisition software |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | N/A | |
| micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-365 | |
| patch-clamp amplifier | Heka | ECB10USB | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| borosilicate capillary tubes | Sutter Instrument | B150-86-10 | Corning 7740 |
| 18 mm glass coverslips | Fisher | 12-545-84 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| cell strainer (40 µm) | Fisher | 08-771-1 | |
| Stovall Belly Dancer Shaker | Fisher | 15-453-211 | |
| low adhesion dishes | Fisher | 05-539-101 | Corning 3262 |
| bacterial dishes | VWR | 25384-302 | 100 x 15 mm |
References
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