Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах

Published: March 15, 2015 doi: 10.3791/52368
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Institute for Regenerative Medicine at Scott & White Hospital, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Texas Medical Branch, 3Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M Health Science Center

Introduction

Считается, что половина населения США испытывают на разрыв в возрасте 65 1. Для тех пациентов с переломами хирургическое лечение, 500000 процедуры предусматривают использование костного трансплантата 2, и это число будет расти с более стареющего населения 3 , Хотя кости является одним из немногих органов, который имеет потенциал, чтобы полностью исцелить без рубцов, бывают случаи, когда процесс не 3,4. В зависимости от обстоятельств и качество лечения, 2-30% от переломов длинных костей неудачу, в результате чего не состоящих в профсоюзе 3,5. Хотя остаются некоторые дебаты по определению, ложных, критических размеров или не состоящих в профсоюзе повреждений костей, как правило, относится к травме, которая не заживает в течение естественного жизни субъекта 6. Для экспериментальных целей, эта продолжительность сокращается в среднем время, необходимое для полного заживления среднего размера травмы костей. Номера для профсоюзов повреждения кости происходят на питгими причинами, но основные факторы включают в себя тяжелейшие психологические травмы в результате критически размера зазора, инфекции, плохое ангиогенеза, употребление табака, или заторможенной мощностью osteoregenerative из-за болезни или возраста 7. Даже если она не профсоюзы успешно лечить, она может стоить более $ 60000 в порядке, в зависимости от типа травмы и подходов, используемых 8.

В умеренных случаях используется аутологичных костная пластика. Эта стратегия включает в себя восстановление кости с сайта донора и имплантации на месте травмы. Хотя такой подход является весьма эффективным, объем доступной доноров, полученных кости ограничен, и процедура включает в себя дополнительную операцию, что приводит к постоянной боли у многих пациентов 9,10. Кроме того, эффективность в аутологичного костного трансплантата зависит от состояния здоровья пациента. Костные заменители, изготовленные из синтетических материалов или обработанные трупной кости в изобилии доступны 11-13, но они гаве существенные ограничения, в том числе бедных адгезионных свойств клетки-хозяина, снижение Остеокондуктивность и потенциал для иммунного отторжения 14. Существует поэтому острая необходимость в регенерации кости технологий, которые являются безопасными, эффективными и широко доступны.

Наша способность улучшить регенеративные стратегии кости в значительной степени зависит от способности имитировать серьезную кости травмы в подопытных животных, но поколение и стабилизация больших костных поражений технически сложной задачей. В большинстве случаев, серьезные травмы длинную кость имитируется экспериментально путем создания дефект, который не будет, естественно, лечить. Хотя это может изменяться в зависимости от вида 15, это достигается за счет полного удаления сегмента кости, который больше, чем в 1,5 раза диаметр кости поперечным сечением 16. Затем кости, стабилизированного металлического имплантата, чтобы сохранить правильную ориентацию краев трещин и позволяют мобильности. Из-за их небольшого размера и хрупкостиих длинные кости, создание таких поражений у мышей находятся за пределами возможностей большинства научно-исследовательских групп. Таким образом, модели длинную кость дефект ограничены крыс и более крупных животных. Тем не менее, у мышей себе значительные исследовательские преимущества в том, что они могут быть генетически модифицированные и разводили в ослабленным иммунитетом штаммов, которые не отвергают человека клетки и ткани.

Для приложений, основанных на человеческих клетках мышей иммунитетом являются привлекательными для работы, потому что они являются физиологически хорошо характеризуется, легко дома, экономически эффективным и легко проанализировать рентгенологически и гистологически. Первостепенное значение в том, что у мышей иммунитетом не отвергают клетки от различных видов, включая человека. Их небольшой размер позволяет также тестировать очень небольшого числа клеток или объемов экспериментальных лесов в ортопедической практике. Несколько мышиных ортопедические модели сообщалось, что позволить себе различные степени стабильности костной 17,18. Те, страховочныеMS, которые приводят к очень высоким уровнем устойчивости, таких как внешние фиксаторы и стопорных пластин преимущественно лечить путем Intramembranous оссификации хотя эндохондральной заживления сообщалось 19. В отличие от этого, те, которые допускают определенную микро- и / или макро-движение, например те, которые используют нефиксированных или частично фиксированной мозговидной контактов, как правило, заживают с преобладанием эндохондральной окостенения 20,21. Задержка союз или не союз дефектов длинных костей, особенно трудно достичь в мышах в связи с повышенным уровнем стабилизации требуется. Тем не менее, были зарегистрированы несколько подходов, в том числе мозгового штифтов с блокировкой ногтей, фиксирующих пластин и внешних фиксаторов 22. Эти системы обычно работают хорошо, но, учитывая их сложную конструкцию, они могут быть технически сложными в установке. Например, Гарсиа и др. 23 разработали элегантную блокировки системы контактный для использования в мышах, но процедура включает разрезы на двух отдельном местес и обширной модификацией бедренной кости, чтобы приспособить штифты. Эти процедуры были выполнены при вскрытии микроскопом.

Здесь мы опишем простой бедренной мозгового штифт с центральной воротником, предназначенную для предотвращения закрытия 3 мм дефицита костной, а также очертить оригинальные края дефекта. В то время как вывод не был установлен на самой кости, точное определение размеров диаметра шпильки и развёртывания медуллярного результатов полость, в достаточной вмешательства к минимуму торсионного движения (рисунок 1). При тщательном выборе инбредной возраста, пола и деформации соответствием мышей, результат хорошо воспроизводим гипертрофическая без uniondefect 22, которые могут быть легко оценены рентгенологически. Кроме того регионах, представляющих интерес может быть воспроизводимо определяется после микро-компьютерной томографии (μCT) для измерения De Novo формирования костной ткани и Гистоморфологические параметров. Выводы были прототипы в нашей лаборатории с помощью легко доступных инструментов.

Рисунок 1
Рисунок 1: Экспериментальная принцип Схематическое резюме сегментной модели дефекта.. Центральный сегмент 3 мм из 9-10 мм мышиного бедра вырезали хирургическим (слева). Длиной 3 мм, 19 калибра хирургической стали трубки пропускают через 9 мм длиной, 22 г трубку из нержавеющей стали и фиксируется с помощью клея точно в центре (справа). Полученный штифт вставлен в мозговых каналов остальных проксимальных и дистальных отделов бедренной кости с 19 г воротник с заменой 3 мм сегмент кости (ниже, в центре).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для женской обнаженной (Nu / J) мышей (18-25 г, 6 недель), полученной из Jackson Laboratories. Так штаммы мышей незначительно отличаться с точки зрения анатомии и темпы роста, мы советуем изготовление булавок оптимизирован для штамма, пола и возраста получателей перед имплантацией в живых субъектов. Если штаммы тщательно подобраны, посадки с натягом между стержнем и полости костного мозга является высокой воспроизводимостью. Процедуры для жилья, питания и общего животноводства выходят за рамки этого протокола, но все мыши были размещены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание) и институциональной политики, установленной Уходу за животными и Использование комитет (IACUC) и кафедрой сравнительной медицины (DCM) на Скотта и Белого больницы.

1. Изготовление Пен

Рисунок 2: сборка PIN-код. () Фотографии хирургического стальных труб на различных стадиях сборки и 4 мм, вырезанные Диаметр цилиндра от 5 мм толщиной Gelfoam лист. (Б) после полировки собранный штифт (выше), Gelfoam цилиндр подстрижены, расположен над стали Воротник (средний), а затем выдерживают в автоклаве, в результате чего стерильного штифта с покрытием сушили Gelfoam. Это улучшает прикрепление клеток в месте повреждения и сохраняет направление исцеления (ниже). (С) Иссеченную бедра оснащены костномозгового штифта. (D) Примеры штифта на различных толщин и длин демонстрируя гибкость этого подхода. (Е) μCT реконструкция контактный стабилизированного бедренной дефекта, иллюстрирующий взаимодействие мозгового штифта с губчатой ​​кости в проксимальных и дистальных концах бедренной кости.

  1. Сокращение длины 9 мм 22 г нержавеющей подкожной трубки, и длину 3 мм, 19 г трубопроводов при использовании армированного стекловолокна диаметром 23,8 мм сверхмощный отсечки колесо, установленное на роторном инструмента. Использование малых плоскогубцы остроконечного для иммобилизации трубки (фиг.2а, выше). Носите соответствующую защиту для глаз и обрабатывать ротационный инструмент с осторожностью.
  2. Нанесите небольшое количество (приблизительно 10 мкл) цианакрилатного кле к середине 9 мм вала. не Пропустите 3 мм воротник над 9 мм вал, пока в центре и крутить, чтобы равномерно распределить клей между воротником и вала. Измерение размеров с парой цифровых суппорты и сравнить с фиг.1. Разрешить, чтобы установить, по крайней мере, 15 ч (фиг 2А, в центре).
  3. Используйте 220 грит наждачной пропитанный диск с для удаления заусенцев и чрезмерных клей.
  4. Использование ротационный инструмент, шлифовать штифт с помощью войлочных полировальных диска.
  5. Промойте дистиллированной водой и насухо Compressed воздуха.
  6. Целостность испытаний, помещая 19 г подкожного тупую иглу на вал вновь из пальца и нажатием против воротника. Убедитесь, что воротник может противостоять приблизительно 25 г веса.
  7. Промыть штифт в стерилизованного фильтрацией фосфатным буферным раствором (фиг.2В, сверху). Убедитесь, что вал штифт плотно в бедренную медуллярной полости с воротником вплотную к краям разреза кости (рис 2С). Прототип различные конфигурации для конкретных целей исследования и получателя (Рисунок 2D). Убедитесь, что концы штифта проникать в трабекулярной кости диафиза так, чтобы максимизировать фиксацию и улучшить посадку с натягом (рис 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы посадка испытания на образцах костного перед имплантацией в живом мышей (например, рис 2С).
  8. Используйте диаметром 4 мм Punch-биопсия резак для резки цилиндрот 5 мм толщиной листа хирургического желатиновой губки. Использование скальпель, чтобы обрезать цилиндр на 3 мм длины и передать 20 G иглу по длине цилиндра, чтобы сформировать отверстие (фиг.2а, ниже).
    Примечание: Мы обнаружили, что расположение желатиновой или коллагеновой матрицей в месте дефекта улучшает удерживание клеток и индуцирует рост в длину вдоль оси кости.
  9. Пропускают цилиндр желатин пены над штифтом и выровнять с воротником (фиг.2В, в центре) и автоклав на сухой цикла при 120 ° С в 15 фунтов на квадратный дюйм. Желатин пены будет высыхать и темным цветом (фиг.2В, ниже).

2. Хирургическая техника

ПРИМЕЧАНИЕ: следующая процедура написана с соблюдением всех принципов, установленных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание). Пожалуйста, соблюдайте все дополнительные политикиустанавливается местным IACUC и обеспечить IACUC-утвержденного протокола для животных (или эквивалент) на месте, прежде чем приступить следующих разделах.

Рисунок 3
Рисунок 3: Хирургические инструменты. () Хирургический набор. Micro сверло (1), резки колесо (2), рассасывающийся шовный (3), наружная шовные (4), скальпель лезвия (5), скальпель ручки (6), стерильные мозговые контакты, завернутые в фольгу (7), медуллярный глубиномер сделал форма для подкожных трубы (8), декоративные носом щипцы (9), крысы зубы щипцы (10), тупые Калибрующие расширители иглы (11), водители иглы (12), маленькие кровоостанавливающих (13), декоративные ножницы (14), распатором (15), модифицированный Kern щипцы (16) (B):. Изменения, которые необходимо произвести Керн стиле костяные ручки для мышей.

  1. Выберите хирургическую комнату процедура или чистую лабораторию с закрывающимся двери и не через-трафика. Санируйте подходящую работу Surfacе с клинической степени четвертичного основе дезинфицирующим моющим средством.
  2. Во время ношения одноразовых стерильных перчаток и одежду, создать стерильную поле около 60 х 90 см 2 на облагороженная рабочей поверхности с автоклавированна ткани шторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы иметь помощника удалить внешнюю упаковку и представить стерильные материалы для следователя, установив в поле.
  3. Поставьте продезинфицировать грелку установленное на теплой воды повторного циркуляционного насоса на салфетке и залить стерильных одноразовых шторы. Теплый шарик стерилизатор до рабочей температуры (250-265 ° C, на это уходит до 30 минут).
  4. На стерильной зоне, организовать хирургический набор (рис 3а), чтобы обеспечить удобный доступ ко всем компонентам. Кроме того, обеспечить стерильную хлопковую марлю (2 х 2 дюйма 2), стерильные Q-подсказки, стерильный стальной шар (500 мл), содержащий стерильного физиологического раствора (0,9% вес / об), и хлоргексидин / изопропиловый спирт хирургическое дезинфицирующих аппликаторов.
  5. Соберите небольшойживотное анестезия блок рядом с стерильной поле с индукцией камеры и носового конуса собраний в соответствии с ветеринарными руководства и инструкции по эксплуатации. Используйте кислород клиническое класса, как на поставку газа и ИФ, USP.

Рисунок 4
Рисунок 4: Хирургическая процедура. (AC) подход и воздействие на бедренной кости. (DE) Высота и порезы. (FK) Развертывание и размера, мозгового каналов.

Рисунок 5
Рисунок 5: Хирургическая процедура. (AB) Установка штифта. (CD) Закрытие. (E) Типичный образ в правильном положении штифт 24 ч после операции.

  1. Поместите мышь в индукции камеры системы анестезии и себет выход на 2 л мин -1 O 2 и изофлуран концентрации до 3% (об / об).
    1. Убедитесь, что мышь находится в бессознательном состоянии в течение 1 мин; повысить концентрацию до 4% (объем / объем), если это необходимо. Снимите мыши, место на стерильной поле с грелку, закрепленной и применять носовой обтекатель. Передача поступать в конуса, и уменьшить изофлуран до 2,5%, ждать в течение еще 20 сек, и испытания для адекватного хирургического плоскости, в соответствии с институциональной политики. Как правило, отсутствие задних конечностей рефлекса при легком сжал является достаточным для определения адекватной анестезии.
    2. В течение всего процесса, попросите помощника монитор для сильной регулярной дыхания и розовой окраски конечностей и рта региона для обеспечения надлежащего уровня оксигенации в бессознательном состоянии. Отрегулируйте анестезии в соответствии с ветеринарными руководством и институциональной политики, если это необходимо. Применение стерильной искусственной слезы смазки мазь (15% (об / об) минеральное масло, 83% (об / об) WHITE вазелин) для глаз.
  2. Переверните мышь на одной стороне с задних конечностей вверх на новом одноразовой салфетке. Если необходимо, удалите мех с электрической бритвой или кремом для удаления волос. Протрите сайт стерильным физиологическим раствором и удалить дополнительную драпировку с избытком меха. Поместите новый Фенестрированные драпировка над мыши так, чтобы покрыть все части, но весь задних конечностей (фиг.4А), но сохранить вид на лице и лапы для мониторинга окраску и дыхание.
  3. Местонахождение и второй концы бедренной и надрезать кожу в течение 5-10 мм вдоль продольной оси (фиг.4В). Отделите слой кожи от фасции с # 15 скальпель, подвергая боковой подход к бедренной кости с помощью двуглавой мышцы бедра и латеральной широкой мышце бедра. Найдите, где перегородки обоих мышц удовлетворения (это линия белого ткани против розового окрашивания мышцы). С помощью скальпеля, тщательно препарировать по межмышечной границы добедренная кость видна (рис 4В).
  4. Разработка разрез с тупым распатором таким образом, чтобы подвергнуть весь диафизе (фиг.4С). Используйте лифт, чтобы дополнительно обнажить центральные две трети бедренной кости, заботясь, чтобы сохранить задняя сосудисто-нервный пучок на внутренней стороне (рис 4D). Аккуратно очистить мягкую ткань прочь кости с помощью скальпеля и насухо стерильной ватной палочкой или эквивалент.
  5. Найдите центр бедренной кости с суппортами если необходимо, и знак с стерильным скальпелем или маркером, затем отметьте 1,5 мм проксимально и дистально от центра города. Аккуратно возьмитесь за бедра с помощью пары тонких носом щипцы ранее, сделанными в стиле Керна, чтобы предотвратить чрезмерное давление на кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точные размеры для модификаций приведены в 3В. Желательно, чтобы проверить щипцы от А эвтаназии образца перед применением, чтобы обеспечить кость не сломается под давлением требуетd для иммобилизации во время резки.
  6. Использование тонкой дрели с тонкой алмазной зернистостью Режущий колеса (диаметр 8 мм х 0,1 мм ширина), сделайте первый разрез с лифтом, в месте, чтобы защитить ткань ниже (рис 4E). Повышение вырезать бедра до 45 °, а крепко держит оконечность диафиза, сделать второй разрез, удаление сегмента 3 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: защита лица рекомендуется на данном этапе.
  7. С костью иммобилизованным щипцов, тщательно полосный костномозговой полости каждом конце с тупой 23 G иглы для подкожных инъекций. Использование предварительно сделал глубиномер, сделанный из длины 22 G трубки, помещенной в 19 г трубы (3А, я Tem 8), оценить глубину рассверленной медуллярной полости и убедиться, что он составляет 3 мм (рис 4F-K) , Если медуллярный полость сопротивляется глубиномер 22 г, полосный снова с тупым 22 G иглы для подкожных инъекций.
  8. Осторожно вставьте мозгового штифт в проксимальных затем дистальный медуллярный грavities довести бедра обратно в его первоначальной длины, и создать стабильную 3 мм зазор (фиг.5А, В). При необходимости, нанесите небольшое количество ручного напряжения для достижения хорошего посадку с натягом стержня с кортикальной кости бедра. Убедитесь, что штифт плотно входит мозговых полостей обеих сторон и края разреза кости находятся на одном уровне с воротником. Если имеется зазор, полосный снова с 22 г тупой иглы.
  9. Повторно мышцы и периферических тканей над штифтом и закрыть с непрерывным рассасывающиеся 5-0 шва (рис 5в). Закрыть кожи разрез с 5-7 квадратный узел нейлона 5-0 швов и печатью с хирургическим клеем (рис 5D).

3. Послеоперационные процедуры

  1. После закрытия разрез кожи, снять анестезии, но позволяют O 2 остаться течет до тех пор, мышь не начинает двигаться; это должно занять меньше чем 1 мин. Если мышь остается неподвижной после 5 минO 2 управления, обратитесь к институциональной политики по ветеринарному вмешательства.
  2. Когда мышь начинает двигаться осторожно перенести его в клетку, содержащую предпочтительно сухой, автоклавного постельные принадлежности.
    1. Разместить иглу типа гнездо в каждой клетке и мыши отступить в него, уменьшая движение. Убедитесь, что мышь восстанавливает задних конечностей мобильности 5-10 мин после восстановления сознания.
    2. Выполнять ежедневную послеоперационный мониторинг в соответствии с институциональной политики. Обеспечить желатинизированного увлажнение и питание на полу клетки в течение первых 5-7 дней, а управлять обезболивания и послеоперационного мониторинга в соответствии с институционально утвержденной политики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы управляем 0,05-0,1 мг кг -1 бупренорфин 24 с 0,25 мл физиологического раствора подкожно дважды в день в течение первых 3 дней, и после этого, если мышь не вернуть нормальную утилиту.
  3. После первого 24 часов восстановления, выполните живой животных рентгеновских изображений недеформированнойR анестезия для визуализации размещение штифта (рис 4д). Если вывод дислоцированных, рассмотреть вопрос о немедленном ревизионных операций.
  4. В 7-й день после операции, удалить швы под наркозом и дом в группах в соответствии с политикой институциональных животноводства.
  5. После 2-5 недель, гуманно усыпить животных в соответствии с Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации одобренных методов эвтаназии 25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: внутрибрюшинное введение коммерчески доступного барбитуратом сочетание эвтаназии коктейль является эффективным и гуманным, но местные институциональные политика по эвтаназии должны быть соблюдены.
  6. Тщательно отсечь задних конечностей, подвергая проксимального отдела бедренной кости и таза от медиальной стороны. Аккуратно нажмите на сустав внутрь от боковой стороне конечности, а отсоединения головки бедренной кости от вертлужной впадины (хип розетка) с помощью скальпеля. Вырезать остальные мышцы и кожу острым скальпелем или микро-ножницы, выпускаявсей конечности образуют таз. При резком пары кусачек или тяжелых ножницами, вырезать нижнюю задних конечностей (голень / фибулы), около 5 мм ниже коленного сустава.
    Примечание: Рекомендуется, чтобы все образцы хранятся в идентичным образом до анализа.
  7. Удалить кожу, но оставить мышцы на месте. Закрепить ткани в 10% забуференном формалине с добавлением 10 мМ CaCl 2 фиксатора в течение 1 недели с последующим хранением в фосфатном буферном солевом растворе с добавлением 10 мМ CaCl 2 в течение 1 месяца до визуализации. Выполнение фиксацию и хранение при 4 ° С. Кроме того, сканирование образцов непосредственно без фиксации.

4. Анализ образцов

Примечание: заживление костной ткани может быть оценена с помощью широкого спектра методик, которые выходят за рамки этого протокола. Ниже метод, который мы успешно используют с использованием образца microCT (μCT) тепловизор. Рекомендуется, чтобы следующие параметры аре проверены на начальном этапе, а затем оптимизированы для конкретных нужд проекта.

  1. Оберните образец в тонкий слой пластика уплотнительной пленкой и поместите его вертикально в приборной камеры. Убедитесь, что бедра перпендикулярно к стадии образца во всей проверки. Установите Сканирование на следующие параметры: напряжение = 29 кВ, ток = 661 мкА, мощность = 19 Вт, размер изображения пиксель (мкм) = 21,00; 360 градусов вращения = да; рамка усреднения = на (5); шаг поворота (град) = 1,00, хаотичное движение = на. Сохранение изображений в качестве JPEG файлов в одной папке назначения на сканирование (например, рис 6а).
    ПРИМЕЧАНИЕ: сканирование должно быть завершено в 57 мин.
  2. Использование программного обеспечения восстановления, чтобы генерировать осевые изображений на основе следующих параметров; сглаживание = на (4), несоосности компенсации = ON сокращения кольцо артефактов = о (5), лучевой закалки коррекции (40%), вращение CS (DEG) = 0,00. Установите вывод 2,000-15,000 Хаунсфилда единиц. Сохранение изображений в качестве JPEG файловв одной папке назначения на сканирование.
  3. Использование осевые изображения и аналитическое программное обеспечение, определить область интереса (ROI), сначала установив проксимального и дистального ребра исходной дефекта. Достижение этого выберите разделы, которые охватывают только воротник. Поскольку втулка толще мозгового штифта, эти участки легко определяются (фиг.6В, слева). Исключить воротник из расчетов, опираясь зону отчуждения вокруг нее (с перевесом в 100 мкм) и передачи зону каждой из секций в ROI (рис 6В, справа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полярные моменты инерции, 3D реконструкции и расчетов, такие как объем новой кости (рис 6C, D) может быть легко достигается с помощью программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мыши обычно выздоравливают сознание и задних конечностей мобильности 5-10 минут после прекращения анестезии. В течение первых 5 дней, желательно, чтобы домовых мышей индивидуально и ввести экологические обогащения для предотвращения избыточного использования конечности. Для этого, гнезда иглу типа снизить потребность в гнезде здания и поощрять отдыхает. Мы также отметили, что предоставление питания и гидрогеля на полу клетки снижает вероятность контактный перемещения. В 5-дневного периода, обезболивания должны быть введены как требуется в соответствии с организационно-утвержденной политики. Потеря веса до приблизительно 15% от первоначальной предоперационного веса можно в течение 5-дневного послеоперационного периода. Двадцать четыре часа после операции, X-лучи пораженной конечности рекомендуется оценивать пин-размещение. Штифты должны быть полностью вставлен в проксимальных и дистальных каналов сердцевинных с краев дефекта вплотную воротник (фиг.2С,2E, рис 5E и 6А). В редких случаях (<5% случаев), булавки могут стать вывих на ранних стадиях заживления и животных используют протоколы должны обеспечивать ревизионной хирургии, если это происходит. В то время как это технически сложно количественно торсионного движения на мышиных бедренных костей, ручной пальпации образцов подтвердили, что торсионная и продольное движение является незначительным после 7 дней соединительной ткани накапливается вокруг пальца. Через 5 дней после оперативного мониторинга, мыши могут быть возвращены в стандартном корпусе коммунальной в соответствии с организационно-утвержденной политики.

Без терапевтического вмешательства, края дефекта, как правило, распространяются 0,5 мм в течение 21 дней, но в редких случаях, новый рост кости может быть до 1 мм (рис 6а). Аресты роста костной ткани после этого периода, как воспалительных и анаболических этапах регенерации прекращения в результате чего не состоящих в профсоюзе дефекта. После 14-21 дней лечения, объем выводаF заново кости может быть легко определено из осевых изображений, полученных при сканировании μCT. Использование сканирования, осевые процедуры реконструкции и отбора ROI, описанные в протоколе, объем новой кости генерируются со временем увеличивается, но обычно не превышает в общей сложности 1 мм 3 в случае отсутствия терапевтического вмешательства (рис 6C) по сравнению с 6 7 мм 3 в анатомически эквивалентной области неповрежденной бедренной кости. В то время как обычные биомеханические испытания технически сложной из-за размера образца и природы метода фиксации, полярного момента инерции (PMI), оценки способности материала сопротивляться кручения на основе площади поперечного сечения и плотности, был Показано, представляют собой подходящую оценку силы в длинных костях 26,27. С помощью этого метода, осевые разрезы на различных расстояниях от повреждения краев может быть выбран для анализа. После 21 дней, PMI де ново кости 0,25 мм FRом поражение края находится в интервале от 0.05-0.35 мм 4 по сравнению с 0,02-0,08 мм 4 в центре поражения дальше, подтверждающего наличие не-союза при отсутствии лечения (рис 6D). PMI неповрежденной бедренной кости в анатомически эквивалентного месте, как правило, составляет от 0,5-0,7 мм 4 с использованием условий, описанных здесь.

Рисунок 6
Рисунок 6: Типичные результаты. (А) Рентгеновские сканирование бедрах на 7-й день, 14 и 21 после операции демонстрируют ограниченную врастание кости Панель B:. Схематическое представление параметров ROI для измерения объемной костной. Представитель осевой разрез с запретной зоны (EX) по сравнению с пин-воротник в том числе с перевесом 100 мкм, чтобы исключить измерение артефактов на границе металл-ткани (слева). Полное сканирование костей (гIGHT, вверху) демонстрирует продольное ROI, определенный секций кости между краями воротника с исходной костной ткани исключены (EX). Исходные поражения ребра расположены в осевых сечений с использованием разницы между диаметром штифта и воротником (справа, внизу). (С) Типичные объемные измерения на 7-й день, 14 и 21 после операции без каких-либо терапевтического вмешательства (с означает стандартные отклонения, п = 3). (D) измерения PMI в осевых сечениях 0,25 мм от проксимального и дистального поражения краев и середины точки (средства со стандартным отклонением, п = 3). (трихромом окрашенных E) Массона парафин Секция (слева) разрезать в продольном направлении, демонстрирующий кости отросток, состоящий из хряща (CA) и губчатой ​​кости (б) (масштаб бар = 0,5 мм). Положение области отображается на рентгеновского сканирования (справа). (F) Номера decalcifiред, метилметакрилата встроенный корональной раздел 1-дневных дефекта, окрашенных гематоксилином и эозином (масштаб бар = 1,0 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Декальцинации тканей обычно занимает 10-14 дней с использованием стандартных условий, и легко контролироваться путем рентгеновского сканирования. Желательно, чтобы сохранить некоторую мускулатуру на образцах при декальцинации, чтобы улучшить устойчивость при обращении. После удаления известкового налета, булавки можно осторожно удалить с помощью острого скальпеля, позволяющего парафин и гистологии. Массона трихромом окрашивание продольных секций позволяет визуализировать эндохондральной костного нароста с передним фронтом хряща (CA) с последующим губчатой ​​кости (СВ) (рис 6е). В то время как некоторые повреждения неизбежно возникают во время вскрытия, гистологическое строение костии соединительной ткани остается ясным, если вывод осторожно удалить. Кроме того, метилметакрилат вложение и секционирование без деминерализованного секций может быть выполнена со штифтом в месте (рис 6F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы опишем простой метод для создания критической величины контактный стабилизированный дефект мышиного бедра с использованием стандартных лабораторных и ветеринарное оборудование. В то время как сборка выводов и самого хирургического вмешательства требует практики, это хорошо в пределах возможностей хорошо подготовленного биомедицинских исследований ученого или ветеринаром.

Контактный позиционируется в костномозговой канал без дополнительной фиксации, что делает процедуру технически более реальным, чем более сложных подходов, которые используют наружные фиксаторы или блокировки винта. Хотя некоторые кручение движение может происходить на ранних стадиях заживления, это свести к минимуму путем тщательного внимания к диаметру выводов и адекватной развёртывания костномозгового канала таким образом, чтобы достичь твердую посадку с натягом между имплантатом и эндосте. При тщательном выборе врожденной деформации и согласования от возраста и пола, соответствуют становится воспроизводимым надежным в течение нескольких дней. Тем не менее, Wiго появлением методов 3D печать, можно ожидать, что при кручении движение может быть дополнительно снижена на более сложных вариантах штифта, которые включают шероховатой поверхности и / или колючей добавленных сайтов. Простота изготовления выводами и наличие широкого спектра подкожных размеров труб также позволяет оптимизировать техники практически любого взрослого инбредной мыши, независимо от фенотипа природного или экспериментальной кости.

Уникальный дизайн пин-воротник служит двум целям: (я), чтобы предотвратить отклоняющийся сужение дефекта и повреждения костей конечностей через продольные проскальзывания, и (II), чтобы обеспечить ориентиры, которые определяют исходные края дефекта. Как измерений, таких, объемные и PMI могут быть легко с использованием образца μCT сканер, такие как SkyScan 1174 Действительно, этот подход допускает уровень количественного который не легко получить с помощью стандартных некритических приемов размера трещин, которые часто демонстрируют переменная или пужелезная дорога определяется травмы. В то время как блок μCT является предпочтительным для количественного исцеления, оценки по объективной оценке ортогональных изображений рентгеновских или методов 2D анализа изображений может представлять возможные альтернативы. Из-за их небольшого размера и относительно низкой минеральной содержания, мышиные конечности могут быть легко получены для гистологического исследования и установлены в виде целых образцов для обычного гистоморфометрии. Это освобождает вопросы выборки часто сталкиваются исследователи, выполняющих Гистоморфометрические анализ больших переломов животных.

В экспериментах, описанных здесь, время заживления было относительно короткий 3 недель, что соответствует быстрому, анаболические фазе заживления костной ткани. После этого, костного ремоделирования является очень медленный процесс 28. Вообще, если мостовое соединение не наблюдается после 4 недель, заживление маловероятно и по согласованию, мы наблюдаем очень мало дополнительный рост костей после 4 недель в этой системе. Кроме того, зазор в 3 мм соответствует критериям Key и дрл. 16 для критического размера дефекта и Garcia и др., показали, что разрыв узкими, как 1,8 мм не достаточно лечить в течение 10 недель, и это может быть отложено до 15 недель с раздели надхрящницей 23.

В то время как размер и хрупкость костей, присутствующие серьезные технические проблемы для ортопедической исследований, использование мышей выгодно во многих отношениях. Например, существует множество штаммов с ослабленным иммунитетом, которые позволяют испытывать человеческих клеток и белков, не опасаясь иммунологического отторжения, и их небольшой размер уменьшает потребность в избыточных количеств ценных материалов, экспериментальных клеток или соединений. Это подтверждается нашей недавней исследования, демонстрирующего эффективность взрослых стволовых клеток человека и их внеклеточных белков для остеорегенерации 29. Относительно короткий срок службы мышей также представить возможность для исследования старения 30 и большое разнообразие инбредных линий реRmit изучение глобального генотипа на исцеление 31. Есть также ряд моделей заболеваний, которые легко устанавливаются на мышах, таких как диабет и остеопороз 32,33. Значительный отметить наличие большого количества трансгенных мышей, которые могут быть использованы с этой техникой, чтобы углубить наше понимание регенеративной физиологии костей в условиях крайней травмы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим сотрудников и ветеринаров на Скотта и Белый больницы кафедры сравнительной медицины, храм, штат Техас, за их неоценимую консультации и помощь при разработке этой методики. Эта работа была частично финансируется за счет Института регенеративной медицины фондов программы, Скотт и Белый РГП грант № 90172, NIH 2P40RR017447-07 и NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Мы благодарим доктора Сьюзан Зейтауни для расстойки рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pin assembly
Dremel rotary tool Dremel 8220 or equivalent
Heavy duty cut off wheel Dremel 420
Surgical tubing 19 G Small Parts (Amazon) B000FMZ8LY OD 1.07 mm, ID 0.889 mm
Surgical tubing 21 G Small Parts (Amazon) B000FMZ8YQ OD 0.82 mm, ID 0.635 mm
Surgical tubing 22 G Small Parts (Amazon) B000FMYLZS OD 0.719 mm, ID 0.502 mm
Surgical tubing 23 G Small Parts (Amazon) B000FN0SY0 OD 0.643 mm, ID 0.444 mm
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882
Emery disc Dremel 413
Rubber polishing point Dremel 462
Felt polishing disc Dremel 414
Gelatin sponge Surgifoam/Ethicon 1974
Punch biopsy cutter Miltex 33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump Stryker/Thermocare TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray Steris 1429-77
Bead sterilizer Germinator/CellPoint Scentific Germinator 500
Anesthesia system VetEquip Inc 901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic VETone/MWI 501017, 502017
Surgical disinfectant Chloraprep/CareFusion 260449
Surgical tools Fine Science Tools various recommend German made
Face protection Splash Shield 4505
Rechargable high speed drill Fine Science Tools 18000-17
Diamond cutting wheel Strauss Diaiond 361.514.080HP
Absorbable sutures  Covidien UM-213
Outer sutures Ethicon 668G or equivalent
Vetbond 3M 1469SB or equivalent
Hydration gel Clear H2O 70-01-1082
Diet gel Clear H2O 72-01-1062
Buprenorphine Reckitt and Benckser 12496-0757-01 controlled substance
Mouse igloos Bio Serv K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail Euthasol/Virbac 710101 controlled substance
Analysis
Live animal imager  Orthoscan FD Pulse or equivalent
Micro-CT unit and software Bruker Skyscan1174 or equivalent
Sealing film/Parafilm M VWR or Fisher 100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
  2. Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
  3. Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
  4. Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
  5. Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
  6. Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
  7. Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
  8. Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
  9. Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
  10. Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
  11. Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
  12. Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
  13. Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
  14. Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
  15. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
  16. Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
  17. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
  18. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
  19. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
  20. Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
  21. Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
  22. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  23. Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
  24. Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
  25. Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
  26. Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  27. Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
  28. Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
  29. Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
  30. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
  31. Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
  32. Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
  33. Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).

Tags

Медицина выпуск 97 модель Bone травмы критический размер дефекта мыши бедра тканевая инженерия сравнительный медицина медуллярный PIN-кода.
Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clough, B. H., McCarley, M. R.,… More

Clough, B. H., McCarley, M. R., Gregory, C. A. A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52368, doi:10.3791/52368 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter