Introduction
Det uppskattas att hälften av den amerikanska befolkningen upplever en fraktur vid en ålder av 65 1. För de patienter med frakturer behandlas kirurgiskt, 500.000 förfaranden innebär användning av en bentransplantation 2 och denna siffra väntas stiga med en alltmer åldrande befolkning 3 . Även ben är en av de få organ som har kapacitet att helt läka utan ärrbildning, det finns fall där processen misslyckas 3,4. Beroende på omständigheterna och behandlingskvalitet, 2-30% av långa benfrakturer misslyckas, vilket resulterar i icke-fackligt 3,5. Medan det fortfarande viss debatt om definition, pseudoartros, kritiska stora eller icke-fackligt benskador generellt hänvisar till en skada som inte läker över naturliga livslängd ämnet 6. I experimentsyfte, detta varaktighet förkortas till den genomsnittliga tid som krävs för fullständig läkning av en medelstor benskada. Icke fackliga benlesioner uppstå av numerous skäl, men viktiga faktorer inkluderar extrem trauma som resulterar i ett kritiskt stort gap, infektion, dålig angiogenes, tobaksbruk, eller hämmade osteoregenerative kapacitet på grund av sjukdom eller 7 års ålder. Även om icke-fackföreningarna framgångsrikt behandlas, kan det kosta över $ 60.000 per förfarande, beroende på typ av skada och de metoder som används 8.
I måttliga fall autolog bentransplantation anställd. Denna strategi innebär återvinning av ben från en donator webbplats och implantation på platsen för skadan. Även om detta tillvägagångssätt är extremt effektiv, är volymen av tillgänglig donator-derived ben begränsad och förfarandet innebär en ytterligare operation, vilket resulterar i ihållande smärta hos många patienter 9,10. Dessutom är effekten av den autologa bentransplantat beroende av patientens hälsa. Benersättningar gjorda av syntetmaterial eller bearbetat avliden ben finns i riklig mängd 11-13, men de HAve betydande begränsningar, inklusive dåliga värdcellsvidhäftningsegenskaper, reducerad osteokonduktivitet och potentialen för avstötning 14. Det finns därför ett akut behov för benuppbyggnad teknik som är säker, effektiv och allmänt tillgängliga.
Vår förmåga att förbättra ben regenerativa strategier är kritiskt beroende av förmågan att härma allvarlig skelettskada i försöksdjur, men generering och stabilisering av stora benlesioner är tekniskt utmanande. I de flesta fall är allvarliga rörben trauma härmas experimentellt genom att upprätta ett fel som inte kommer naturligt läka. Även om det kan variera med arter 15, uppnås detta genom fullständigt avlägsnande av ett ben segment som är större än 1,5 gånger diametern på benet tvärsnittet 16. Benet stabiliseras sedan med ett metallimplantat för att bibehålla korrekt orientering av brottkanter och möjliggöra rörlighet. På grund av sin ringa storlek och bräcklighetsina långa ben, inrättandet av sådana lesioner i möss är bortom kapaciteten hos de flesta forskargrupper. Som sådan är långa ben defekt modeller begränsas till råttor och större djur. Ändå möss ger betydande forskningsfördelar genom att de kan genetiskt modifierade och uppvuxna som immunkomprometterade stammar som inte förkastar mänskliga celler och vävnader.
För humana cellbaserade applikationer, immunkomprometterade möss är attraktivt att arbeta med eftersom de är fysiologiskt väldefinierad, lätt att huset, kostnadseffektivt och enkelt analyseras radiologiskt och histologiskt. Av största vikt är att immunkomprometterade möss inte avvisa celler från olika arter, inklusive människan. Deras ringa storlek tillåter också testning av ett mycket litet antal celler eller volymer experimentella byggnadsställningar i ortopediska applikationer. Flera murina ortopediska modeller har rapporterats att ge olika grader av ben stabilitet 17,18. De systemams som resulterar i mycket höga halter av stabilitet, såsom externa fixators och låsanplattor läka främst genom intramembranös benbildning trots endokondral läkning har rapporterats 19. Däremot de som tillåter vissa mikro- och / eller makro rörelse, till exempel de som använder ofixerade eller delvis fasta medullära stift, vanligen läker med en dominans av endokondral benbildning 20,21. Fördröjd union eller icke fackligt defekter av långa ben är särskilt svårt att uppnå i möss på grund av den extra nivå av stabilisering krävs. Dock har ett antal metoder rapporterats, inklusive märg stift med samverkande spikar, låsbara plattor och externa fixators 22. Dessa system fungerar i allmänhet väl, men med tanke på deras komplicerade konstruktion kan de vara tekniskt utmanande att installera. Till exempel, al. Garcia et 23 utarbetat en elegant samverkande stift för användning i möss, men förfarandet innebär snitt på två separat webbplatss och omfattande modifiering av lårbenet för att rymma stiften. Dessa procedurer utfördes under ett dissektionsmikroskop.
Häri beskriver vi en enkel lårbensmärg stift med en central krage utformats för att förhindra stängning av en 3 mm underskott ben och även beskriva de ursprungliga kanter defekten. Medan stiftet inte var fast till själva benet, att exakt dimensionering av stiftdiameter och brotschning av märghålan resulterar i tillräcklig interferens minimerar torsionsrörelse (Figur 1). Genom ett noggrant urval av inavlade ålder, kön och stam matchade möss, är resultatet en mycket reproducerbar hypertrofisk icke-uniondefect 22 som lätt kan utvärderas radiologiskt. Dessutom regioner av intresse kan reproducerbart definieras efter mikro datortomografi (μCT) för mätning av de novo benbildning och histomorphological parametrar. Stiften var prototyper i vårt laboratorium med hjälp av lättillgängliga verktyg.
Figur 1: Experimentell princip Schematisk sammanfattning av den segmentdefekt modellen.. Det centrala 3 mm segment av en 9-10 mm murin lårben skärs kirurgiskt (vänster). En 3 mm långa, 19 gauge kirurgiskt stål röret bringas att passera över en 9 mm lång, 22 G-rostfritt stålrör och fixeras med bindemedel vid den exakta centrum (höger). Den erhållna stiftet är monterat i medullära kanalerna i de återstående proximala och distala delarna av lårbenet med 19 G kragen ersätter den 3 mm segment av ben (nedan, mitten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll är utformad för kvinnlig naken (Nu / J) möss (18-25 g, 6 veckor) förvärvats från Jackson Laboratories. Eftersom stammar av möss variera något i termer av anatomi och tillväxttakt, rekommenderar vi att tillverkningen av stiften är optimerad för stammen, kön och ålder av mottagarna före implantering i levande individer. Om stammarna är noggrant matchas, är presspassningen mellan stiftet och märghålighet mycket reproducerbar. Rutiner för bostäder, kost och allmän djurhållning är utanför ramen för detta protokoll, men alla möss inrymt i enlighet med Guide för skötsel och användning av försöksdjur (8: e upplagan) och institutionella politik som fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och Institutionen för medicin (DCM) vid Scott and White Hospital.
1. Tillverkning av Pins
- Skär en 9 mm längd 22 G rostfritt injektions slang, och en 3 mm längd 19 G slang med hjälp av en glasfiber 23,8 mm diameter förstärkt tunga kapskiva monterad på ett roterande verktyg. Använd små fina spets tång för att immobilisera slangen (Figur 2A, ovan). Bär lämpligt ögonskydd och handtag roterande verktyg med omsorg.
- Placera en liten mängd (ca 10 l) av cyanoakrylat-adhesiv till mitten av 9 mm axel. Passera 3 mm kragen över 9 mm axeln tills i mitten och vrid att fördela limmet mellan kragen och axeln. Mät mått med ett par digitala skjutmått och jämför med figur 1. Låt det i minst 15 timmar (Figur 2A, mitten).
- Använd en 220 grit smärgel impregnerade skiva för att ta bort grader och överdriven lim.
- Med hjälp av roterande verktyg, polera stiftet med hjälp av en filt polerskiva.
- Skölj med avjoniserat vatten och torka med omfatssed luft.
- Test integritet genom att placera en 19 G injektion trubbig nål över axeln av den nygjorda stiftet och tryck mot kragen. Se till att kragen kan motstå ca 25 g vikt.
- Skölj stiftet i sterilfiltrerad fosfatbuffrad saltlösning (Figur 2B, överst). Se till att axeln hos stiftet passar tätt in i den femorala märghålan med kragen tätt mot kanterna på den kapade ben (Figur 2C). Prototyp olika konfigurationer för de specifika ändamålen med studien och mottagaren (figur 2D). Se till att ändarna av tappen tränga in i trabekulärt ben av diafysen för att maximera fixering och förbättra presspassning (fig 2E).
OBS: Vi rekommenderar att passformen testas på ben prover före implantation i levande möss (t.ex. figur 2C). - Använd en 4 mm diameter punch-biopsi fräs för att skära en cylinderfrån en 5 mm tjockt ark av kirurgisk gelatinsvamp. Använd en skalpell för att trimma cylindern till 3 mm längd och passera en 20 G injektionsnål utmed cylinderns längd för att alstra ett hål (figur 2A, nedan).
OBS: Vi har funnit att placeringen av en gelatin eller kollagenbyggnadsställning vid platsen för defekten förbättrar cell retention och inducerar längsgående tillväxt längs axeln av benet. - Passera gelatinskumcylinder över stiftet och rikta med kragen (Figur 2B, mitten) och autoklav på en torr cykel vid 120 ° C vid 15 psi. Gelatin skummet torkar och mörkna i färg (figur 2B, nedan).
2. Kirurgisk teknik
OBS: Följande procedur är skriven observera alla riktlinjer som Guide för skötsel och användning av försöksdjur (8: e upplagan). Vänligen observera alla nya strategierfastställts av lokala IACUC och säkerställa en IACUC-godkänd djuranvändning protokoll (eller motsvarande) är på plats innan du fortsätter med de följande avsnitten.
Figur 3: Kirurgiska instrument. (A) Kirurgisk kit. Micro-borr (1), skärhjul (2), absorber sutur (3), ytter sutur (4), skalpellblad (5), skalpell handtag (6), sterila märg stift inslagna i folie (7), medullär djupmätare gjorde formen injektion slang (8), fina nosed pincett (9), rått-tänder pincett (10), trubbiga brotschning nålar (11), nål förare (12), små peanger (13), fina saxar (14), periosteal hissen (15), modifierade Kern pincett (16) (B):. Ändringar som krävs för att producera Kern stil ben-grepp för möss.
- Välj ett kirurgiskt ingrepp rum eller rent laboratorium med en stängbar dörr och ingen genomfartstrafik. Sanera ett lämpligt arbete surface med en klinisk klass kvartar baserade desinfektionsmedel renare.
- Iklädd sterila engångshandskar och mantel, skapa ett sterilt område på cirka 60 x 90 cm 2 på sanerade arbetsytan med autoklave trasa draperier.
OBS: Det är tillrådligt att ha en assistent bort den yttre förpackningen och presentera de sterila material för att utredaren inrätta fältet. - Placera en sanerad värmedyna monterad på ett varmt vatten återcirkulationspumpen på duken och täck med sterila engångs draperier. Värm en pärla autoklav till driftstemperatur (250-265 ° C, tar detta upp till 30 min).
- På det sterila området, ordna kirurgiska kit (Figur 3A) för att ge bekväm tillgång till alla komponenter. Också, ger steril gasväv (2 x 2 tum 2), sterila Q-tips, en steril stålskål (500 ml) innehållande steril saltlösning (0,9% vikt / volym), och klorhexidin / isopropylalkohol kirurgisk desinficerande applikatorer.
- Montera en litendjur anestesi enhet intill det sterila området med en induktionskammare och noskonen montering enligt veterinär vägledning och instruktionsbok. Använd klinisk kvalitet syre som gasförsörjning och isofluran, USP.
Figur 4: Kirurgisk procedur. (AC) metoden och exponering av lårbenet. (DE) Elevation och nedskärningar. (FK) Brotschning och dimensionering av medullära kanaler.
Figur 5: Kirurgisk procedur. (AB) Installation av stiftet. (CD) Stängning. (E) Typisk bild av korrekt placerad stift 24 timmar efter operationen.
- Placera en mus i induktionskammaren i anestesisystemet och set utmatningen till 2 Lmin -1 O 2 och isofluran koncentrationen till 3% (volym / volym).
- Kontrollera att musen är medvetslös inom 1 minut; höja koncentrationen till 4% (v / v) om så är nödvändigt. Ta musen, placera på sterila området med värmedynan placerad nedanför och tillämpa noskonen. Överföring strömma till konen, och minska isofluran till 2,5%, vänta ytterligare 20 sekunder, och testet för adekvat kirurgisk plan i enlighet med den institutionella politiken. Vanligtvis avsaknaden av en bakbens reflex när försiktigt pressas är tillräcklig för att bestämma lämplig anestesi.
- Under hela processen, har en assistent bildskärm för starkt regelbunden andning och rosa färg i extremiteterna och mun regionen för att säkerställa en lämplig nivå av syresättning medan medvetslös. Justera anestesi enligt veterinär vägledning och institutionella politik om det behövs. Applicera steril artificiella tårar smörjmedel salva (15% (vol / vol) mineralolja, 83% (volym / volym) white vaselin) för ögonen.
- Vänd musen på en sida med det hind-lem uppåt på en ny engångs drapering. Om det behövs, ta bort päls med en elektrisk rakapparat eller hårborttagningskräm. Torka området med steril koksaltlösning och ta bort extra drapera med överskott päls. Placera en ny operationsduk med fönster över musen så att den omfattar alla delar utan hela hind-lem (Figur 4A) men bibehålla bild av ansiktet och tass för att övervaka färgning och andning.
- Lokalisera de proximala och distala ändarna av lårbenet och incisionsfilm huden för 5-10 mm längs längdaxeln (Figur 4B). Separera hudskiktet från fascian med en # 15 skalpell, utsätta en lateral riktning mot femur via biceps femoris och vastus lateralis. Leta där septa båda musklerna möter (det är en linje av vit vävnad mot rosa färg av muskeln). Med en skalpell, försiktigt dissekera längs intermuscular gränsen tillslårbenet är synlig (Figur 4B).
- Utveckla snittet med en trubbig periostal hiss för att exponera hela diafys (Figur 4C). Använda hissen för att ytterligare exponera de centrala två tredjedelar av lårbenet samtidigt se till att bevara den bakre neurovaskulära bunt på den mediala sidan (Figur 4D). Skrapa försiktigt mjukvävnad bort av benet med en skalpell, och torka med en steril tops eller motsvarande.
- Lokalisera mitten av lårbenet med passare vid behov och markera med en steril skalpell eller markör och därefter markera 1,5 mm proximalt och distalt från centrum. Ta försiktigt tag lårbenet med hjälp av ett par fina-nosed pincett tidigare fashioned i Kern stil för att förhindra alltför stort tryck på benet.
OBS: Exakta dimensioner för modifieringar tillhandahålls i figur 3B. Det är lämpligt att testa tången på en euthanized exemplar före användning för att säkerställa benet kommer inte att bryta under tryck kräverd för immobilisering under skärning. - Med hjälp av en fin borrmaskin försedd med en fin diamant-grit belagd kapskiva (8 mm diameter x mm bredd 0,1), gör den första snittet med hissen för att skydda vävnaden nedan (Figur 4E). Raising the cut lårbenet till 45 ° medan ett fast grepp om änden av diafysen, gör den andra snitt, avlägsna en 3 mm segment.
OBS: Ansiktsskydd rekommenderas i detta skede. - Med benet orörlig med pincett, försiktigt brotscha märg hålrummen i varje ände med en trubbig 23 G injektionsnål. Med hjälp av en pre-made djupmätare tillverkad av en längd på 22 G slang placeras i 19 G slang (Figur 3A, jag tem 8), bedöma djupet på uppryms märghålan och säkerställa att det är 3 mm (Figur 4F-K) . Om märghålan motstår 22 G djupmätare, brotscha igen med en trubbig 22 G injektionsnål.
- Försiktigt in i märg stiftet i den proximala sedan distala medullär cavities att bringa lårbenet tillbaka ut till sin ursprungliga längd och etablera en stabil 3 mm spalt (fig 5A, B). Om det behövs, använda en liten mängd av manuell spänning för att uppnå en god presspassning av staven med det kortikala benet av lårbenet. Se till att stiftet passar tätt in i de medullära håligheterna i båda sidorna och kanterna på det skurna ben är i jämnhöjd med kragen. Om det finns en lucka, brotscha gång med en 22 G trubbig nål.
- Flytta muskeln och perifer vävnad över stiftet och avsluta med en kontinuerlig absorber 5-0 sutur (Figur 5C). Nära hudincision med 5-7 råbandsknop nylon 5-0 suturer och tätning med kirurgiskt lim (Figur 5D).
3. Postoperativa förfaranden
- Efter stängning snittet huden, dra anestesi, men tillåt O2 förbli flyter fram musen börjar röra; Detta bör ta mindre än 1 minut. Om musen förblir orörlig efter 5 min avO2 administration, se institutionella politik för veterinära ingrepp.
- När musen börjar röra sig försiktigt överföra den till en bur helst innehåller torrt, autoklaveras sängar.
- Lägg ut en igloo-typ häckar i varje bur och musen kommer retirera in i det, minskar rörelsen. Kontrollera att musen återhämtar hind-lem rörlighet 5-10 min efter återvinning av medvetande.
- Utför dagliga postoperativ övervakning i enlighet med institutionella politik. Ge gelatinerad hydrering och mat på golvet i buren för de första 5-7 dagarna och administrera smärtlindring och postoperativ övervakning i enlighet med institutionellt godkända politik.
OBS: Vi administrerar 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfin 24 med 0,25 ml saltlösning subkutant, två gånger dagligen under de första 3 dagar och därefter om musen inte återfå normal användbarhet.
- Efter de första 24 tim på återhämtning, spela live-djurröntgenavbildning under anestesi att visualisera stift placering (Figur 4E). Om stiftet är ur led, anser omedelbar översyn kirurgi.
- Vid dag 7 efter operation, ta bort suturer under narkos och hus i grupper enligt institutionell djurhållning politik.
- Efter 2-5 veckor, humant avliva djur i enlighet med den amerikanska Veterinary Medical Association godkända metoder för dödshjälp 25.
OBS: En intraperitoneal injektion av kommersiellt tillgänglig barbiturat-kombinations dödshjälp cocktail är effektivt och humant, men lokala institutionella politik dödshjälp bör följas. - Försiktigt dissekera bort hind-lem genom att exponera den proximala lårbenet och bäckenet från den mediala sidan. Tryck försiktigt leden inåt från den laterala sidan av lemmen samtidigt loss lårbenshuvudet från acetabulum (höften uttaget) med en skalpell. Skär resterande muskler och hud med en vass skalpell eller mikro-sax, släppahela lemmen bildar bäckenet. Med en vass par rongeurs eller tunga sax, klippa lägre hind-lem (tibia / fibula) ca 5 mm under knäleden.
OBS: Vi rekommenderar att alla prover lagras på samma sätt före analys. - Ta bort huden, men lämna muskler på plats. Fäst vävnaden i 10% buffrad formalin kompletterat med 10 mM CaCl2 fixativ för en vecka, följt av lagring i fosfatbuffrad saltlösning kompletterad med 10 mM CaCl2 för upp till en månad före avbildning. Utför fixering och förvaring vid 4 ° C. Alternativt, scanna prover omedelbart utan fixering.
4. Analys av Prover
OBS: benläkning kan bedömas genom en mängd olika metoder som är utanför ramen för detta protokoll. Följande är en metod som vi framgångsrikt har anställt hjälp av ett prov microCT (μCT) imager. Det rekommenderas att följande parametrar are testade initialt, därefter optimerad för de specifika behoven i projektet.
- Wrap provet i ett tunt lager av plast förseglingsfilmen och placera den vertikalt i instrumentkammaren. Kontrollera att lårbenet är vinkelrät mot provstadiet under hela avsökningen. Ställ skanningen till följande parametrar; spänning = 29 kV, nuvarande = 661 iA, effekt = 19 W, bildpixelstorlek (nm) = 21.00; 360 graders rotation = ja; frame medelvärdes = på (5); rotationssteg (deg) = 1,00, slumpmässig rörelse = på. Spara bilder som JPEG-filer i en enda målmapp per scan (t.ex. figur 6A).
OBS: Skann bör vara klar i 57 min. - Utnyttja återuppbyggnads programvara för att generera axiella bilder baserat på följande parametrar; utjämning = på (4), snedställning kompensation = på, ring artefakt reduktion = på (5), balk-härdande korrigering (40%), CS rotation (grader) = 0,00. Sätt Utdata till 2,000-15,000 Hounsfield-enheter. Spara bilder som JPEG-fileri en enda målmapp per skanning.
- Använda de axiella bilder och analytisk programvara, definiera regionen av intresse (ROI) genom att först ställa in proximala och distala kanter ursprungliga felet. Uppnå detta genom att välja de avsnitt som omfattar endast kragen. Eftersom kragen är tjockare än den medullära stiftet är dessa sektioner lätt definieras (Figur 6B, vänster). Uteslut kragen från beräkningar genom att dra en säkerhetszon runt den (med en 100 nm-marginal) och överföring av zonen till var och en av sektionerna i ROI (Figur 6B, höger).
OBS: Polar tröghetsmoment, 3D rekonstruktioner och beräkningar som volymen av nytt ben (Figur 6C, D) kan lätt uppnås med hjälp av programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss återhämtar normalt medvetande och hind-lem rörlighet 5-10 minuter efter indragning av anestesi. Under de första fem dagarna, är det lämpligt att hysa möss individuellt och införa miljöberikning för att förhindra överskott användning av lemmen. För detta ändamål igloo-typ bon minska behovet av bobyggande och uppmuntra vila. Vi har också observerat att tillhandahålla livsmedel och hydrogel på golvet av buren minskar sannolikheten för stiftet deplacement. Under 5-dagars period, bör smärtlindring ges efter behov i enlighet med institutionellt godkända politik. Viktminskning upp till ca 15% av den ursprungliga preoperativ vikt är möjligt under 5-dagars postoperativ period. Tjugofyra timmar efter operationen, är röntgenbilder av den påverkade extremiteten rekommenderas att bedöma stift-placering. Stiften bör vara helt insatt i de proximala och distala medullära kanaler med kanterna av defekt tätt mot kragen (figur 2C,2E, Figur 5E, och figur 6A). I sällsynta fall (<5% av fallen), kan stiften bli vrickat vid tidiga stadier av helande och djuranvändning protokoll bör innehålla revisionskirurgi om detta inträffar. Även om det är tekniskt utmanande att kvantifiera torsionsrörelse på murina lårben, manuell palpation av prover bekräftade att vrid- och longitudinell rörelse är marginell efter 7 dagar så bindväv samlas runt stiftet. Efter fem dagar av postoperativ övervakning, kan mössen återföras till standard kommunala bostäder per institutionellt godkända politik.
Utan terapeutisk intervention, kanter defekten sträcker normalt 0,5 mm under 21 dagar men i sällsynta fall kan ny bentillväxt vara upp till 1 mm (figur 6A). Bentillväxt gripanden efter denna period som de inflammatoriska och anabola stadier av förnyelse upphör som resulterar i en icke-fackligt defekt. Efter 14-21 dagar av healing, volymen of de novo ben kan lätt bestämmas från axiella bilder som genereras av μCT scanning. Med hjälp av scanning, axiella återuppbyggnad och ROI urvalsförfaranden som beskrivs i protokollet, volymen av nytt ben genererade ökar med tiden, men i allmänhet inte överstiga 1 mm 3 i frånvaro av terapeutisk intervention (figur 6C) jämfört med 6- 7 mm 3 i en anatomiskt likvärdig region i oskadad lårbenet. Medan konventionella biomekanisk testning är tekniskt utmanande på grund av provet storlek och karaktär fixeringsmetod, polartröghetsmoment (PMI), en uppskattning av ett materials förmåga att motstå torsion baserad på tvärsnittsarea och densitet, har varit visat att representera en lämplig skattning av styrka i långa ben 26,27. Med användning av denna metod, kan axiella tvärsektioner på olika avstånd från lesionsspecimen kanterna väljas för analys. Efter 21 dagar, PMI för de novo ben 0,25 mm frabout lesionen kanter varierar från mellan 0,05-0,35 mm 4 jämfört med 0,02-0,08 mm 4 i mitten av lesionen ytterligare bekräftar förekomsten av icke-fackligt i obehandlade fall (Figur 6D). PMI för oskadade lårbenet på ett anatomiskt likvärdig plats varierar normalt mellan 0,5-0,7 mm 4 med användning av de förhållanden som beskrivs här.
Figur 6: Typiska resultat. (A) röntgenskanningar av lårben vid dag 7, 14 och 21 efter operationen visar begränsad inväxt av ben Panel B:. Schematisk återgivning av de ROI parametrar för volymmätning ben. Representativa axiellt tvärsnitt med en säkerhetszon (EX) över stift-krage fattande en 100 ^ m marginal för att utesluta mätningar av artefakter vid metall-vävnadsgränssnittet (vänster). Fullständig sökning ben (right, överst) visar den longitudinella ROI definieras av de sektioner av ben mellan kanterna på kragen med original benvävnad uteslutna (EX). De ursprungliga lesion kanterna är belägna i de axiella sektioner med hjälp av skillnaden mellan diametern på stiftet och kragen (höger, nedan). (C) Typiska volumetriska mätningar vid dag 7, 14 och 21 efter operation utan någon terapeutisk intervention (organ med standardavvikelser, n = 3). (D) PMI mätningar vid axiella sektioner 0,25 mm från de proximala och distala lesion kanter och mittpunkten (organ med standardavvikelser, n = 3). (E) Massons trikrom-färgade paraffininbäddade avsnitt (vänster) skärs i längdriktningen visar ben utväxt bestående av brosk (ca) och poröst ben (b) (skala bar = 0,5 mm). Positionen av fältet anges på röntgen scan (höger). (F) Icke-decalcified, metylmetakrylat inbäddade koronala delen av 1 dagsgamla defekt färgades med hematoxylin och eosin (skala bar = 1,0 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Avkalkning av vävnaderna tar normalt 10-14 dagar med användning av standardbetingelser, och kan lätt övervakas genom röntgenstråleskanning. Det är lämpligt att behålla en viss muskulatur på proverna under urkalkning att förbättra stabiliteten under hantering. Efter avkalkning, kan stiften avlägsnas försiktigt med en vass skalpell tillåter paraffininbäddning och histologi. Massons trikromfläckning av längsgående sektioner medger visualisering av endokondral benvävnad utväxt med en ledande kant av brosk (CA) följt av spongiöst ben (CB) (figur 6E). Medan vissa skador kommer oundvikligen inträffar under dissektion, den histologiska strukturen av benoch bindväv förblir klar om stiftet avlägsnas försiktigt. Alternativt kan metylmetakrylat inbäddning och snittning av icke-avmineraliserade sektioner utföras med stiftet på plats (Figur 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskriver vi en enkel metod för att generera en kritisk storlek stift stabiliserade defekten av den murina lårbenet med användning av standardlaboratorie och veterinärmedicinsk utrustning. Medan montering av stiften och det kirurgiska ingreppet i sig kräver praktiken är det väl inom funktionerna i en välutbildad biomedicinsk forskare eller veterinär.
Stiftet placeras i medullära kanalen utan ytterligare fixering, vilket gör proceduren tekniskt mer genomförbart än mer komplicerade metoder som använder externa fixators eller skruvar förregling. Medan vissa torsionsrörelse kan förekomma under de tidiga stadierna av healing, detta minimeras genom noggrann uppmärksamhet på stiftet diameter och adekvat brotschning av märgkanalen för att uppnå en fast passning mellan implantatet och endosteum. Genom ett noggrant urval av inavlad stam och matchning av ålder och kön, blir passningen reproducerbart robusta inom några dagar. Ändå with tillkomsten av 3D trycktekniker, är det förväntat att torsionsrörelse kan reduceras ytterligare genom mer sofistikerade versioner av stiftet som inkorporera uppruggade ytor och / eller hullingförsedda fästställen. Lättheten att stiftet tillverkning och tillgängligheten av en bred variation av hypodermiska slangstorlekar tillåter också optimeringen av tekniken för praktiskt taget alla vuxna inavlad mus, oavsett naturliga eller experimentell ben fenotyp.
Den unika pin-krage designen tjänar två syften: (i) för att förhindra avvikande förträngning av fel och skador av benet extremiteter genom longitudinell glidning, och (ii) att tillhandahålla landmärken som definierar de ursprungliga kanter defekten. Som sådan, volymetriska och PMI mätningar kan utföras enkelt med hjälp av ett prov μCT scanner såsom en SkyScan 1174. Faktiskt tillåter detta tillvägagångssätt en nivå av kvantifiering, som inte är lätt erhållas med standard icke kritiska stora brott tekniker som ofta uppvisar variabel eller poorly definierade skador. Medan en μCT enhet är att föredra för kvantifiering av healing, utvärdering genom objektiv bedömning av ortogonala röntgenbilder eller 2D bildanalystekniker kan representera genomförbara alternativ. På grund av sin ringa storlek och relativt låg mineralhalt, kan murina lemmar lätt framställas för histologi och monteras som hela exemplar för konventionell histomorfometri. Detta avfärdar provtagnings frågor av forskare som utför histomorfometriska analyser av stora djur frakturer ofta möter.
I de experiment som beskrivs här, läkningstiden var relativt kort på 3 veckor, vilket motsvarar den snabba, anabola fasen av benläkning. Därefter är benremodellering en mycket långsam process 28. Generellt, om brygg inte observeras efter 4 veckor, är osannolik och i samförstånd healing, observerar vi mycket lite extra bentillväxt efter 4 veckor i detta system. Dessutom möter en 3 mm spalt kriterierna för Key et al. 16 för en kritisk storlek defekt och Garcia et al. visade att ett gap så smal som 1,8 mm inte tillräckligt läka efter 10 veckor och det kan försenas till 15 veckor med avskalade perikondrium 23.
Medan storlek och bräcklighet deras ben nuvarande allvarliga tekniska utmaningar för ortopedisk forskning, är fördelaktigt på många sätt användningen av möss. Till exempel finns det en mängd olika immunkomprometterade stammar som medger kontroll av mänskliga celler och proteiner utan risk för immunologisk avstötning, och deras ringa storlek minskar behovet av överdrivna mängder av värdefulla experimentella material, celler eller föreningar. Detta exemplifieras av vår nyligen genomförd studie visar effekten av vuxna mänskliga stamceller och deras extracellulära proteiner för osteoregeneration 29. Den relativt korta livslängd möss presentera också möjlighet för forskning om åldrande 30 och det stora utbudet av inavlade stammar peRMIT studiet av globala genotyp på healing 31. Det finns också ett antal sjukdomsmodeller som lätt är etablerade i möss som diabetes och benskörhet 32,33. Av betydande intresse är tillgången på många transgena möss som kan användas med denna teknik för att öka våra kunskaper om regenerativ benfysiologi under förhållanden med extrem trauma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar personalen och veterinärer på Scott & White Hospital Institutionen för medicin, Temple, Texas, för deras ovärderliga råd och hjälp under utvecklingen av denna teknik. Detta arbete har finansierats delvis av Institutet för regenerativ medicin Program fonder, Scott & White RGP bidrag # 90.172, NIH 2P40RR017447-07 och NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Vi tackar Dr Suzanne Zeitouni för korrektur manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
- Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
- Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
- Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
