Introduction
Det anslås, at halvdelen af den amerikanske befolkning oplever en fraktur i en alder af 65 1. For de patienter med frakturer behandles kirurgisk, 500.000 procedurer indebærer brug af en knogletransplantation 2 og dette tal forventes at stige med en stadig aldrende befolkning 3 . Selv om knoglen er en af de få organer, der har kapacitet til helt heler uden ardannelse, er der tilfælde, hvor processen ikke 3,4. Afhængig af omstændighederne og kvalitet i behandlingen, 2-30% af lange knoglebrud mislykkes, hvilket resulterer i ikke-union 3,5. Mens der stadig er en vis debat om definition, pseudoarthrose, kritiske størrelse eller ikke-union knogleskader generelt refererer til en skade, der ikke heler i løbet af naturlige levetid emne 6. Til forsøgsformål, er denne varighed afkortes til den gennemsnitlige tid, der kræves til fuldstændig helbredelse af en gennemsnitlig størrelse knogle skade. Ikke-union knoglelæsioner forekomme numerous grunde, men vigtige faktorer omfatter ekstrem traume resulterer i en kritisk størrelse hul, infektion, dårlig angiogenese, tobaksrygning eller hæmmet osteoregenerative kapacitet på grund af sygdom eller alder 7. Selv om ikke-fagforeninger med held behandles, kan det koste over $ 60,000 per procedure, afhængigt af typen af skade og de metoder, der anvendes 8.
I moderate tilfælde er autolog knogletransplantation ansat. Denne strategi indebærer genopretning af knogle fra en donor websted og implantation på skadestedet. Selv om denne fremgangsmåde er ekstremt effektiv, mængden af tilgængelige donor-afledte knogle er begrænset, og procedure indebærer en yderligere operation, hvilket resulterer i vedvarende smerter i mange patienter 9,10. Desuden effektiviteten af autolog knogletransplantation er afhængig af patientens helbred. Bone erstatninger fremstillet af syntetiske materialer eller forarbejdet afdød knogle er rigeligt til rådighed 11-13, men de have væsentlige begrænsninger, herunder dårlige host-celle adhæsionsegenskaber, reduceret osteokonduktivitet, og mulighederne for immunafstødning 14. Der er derfor et presserende behov for knogleregenerering teknologier, som er sikker, effektiv og bredt tilgængelige.
Vores evne til at forbedre knogle regenerative strategier er kritisk afhængig af evnen til at efterligne alvorlig knogle traumer i forsøgsdyr, men genereringen og stabilisering af store knoglelæsioner er teknisk udfordrende. I de fleste tilfælde er alvorlig lang knogle traumer efterlignes eksperimentelt ved at etablere en defekt, som ikke naturligt helbrede. Selvom det kan variere med arter 15, opnås dette ved fuldstændig fjernelse af en knogle segment, der er større end 1,5 gange diameteren af knoglen tværsnit 16. Knoglen derefter stabiliseret med et metalimplantat til at opretholde korrekt orientering af bruddet kanter og give mulighed for mobilitet. På grund af deres lille størrelse og skrøbelighedderes lange ben, etablering af sådanne læsioner i mus er ud over mulighederne i de fleste forskningsgrupper. Som sådan er lang knogledefekt modeller begrænset til rotter og større dyr. Alligevel mus gav en betydelig forskningsindsats fordele, at de kan være genetisk modificerede og opdrættet som immunsvækkede stammer, som afviser ikke humane celler og væv.
For humane celle-baserede applikationer, immunsvækkede mus er attraktive at arbejde med, fordi de er fysiologisk velkarakteriseret, let at hus, omkostningseffektiv og let analyserede radiologisk og histologisk. Af afgørende betydning er, at immunsvækkede mus ikke afviser celler fra forskellige arter, herunder mennesker. Deres lille størrelse tillader også afprøvning af et meget lille antal celler eller mængder af eksperimentelle stilladser i ortopædiske applikationer. Flere murine ortopædiske modeller er blevet rapporteret, at tillade forskellige grader af knogle stabilitet 17,18. De, systems, der resulterer i meget høje niveauer af stabilitet, såsom eksterne fikseringsindretninger og låseplader overvejende helbrede ved intramembranous ossifikation selvom endochondral heling er rapporteret 19. I modsætning hertil dem, der tillader nogle mikro- og / eller makro-bevægelse, som dem, der anvender ikke-fikserede eller delvist faste medullære pins, generelt helbrede med en overvægt af endochondral ossifikation 20,21. Forsinket union eller non-union-defekter af lange knogler er særligt vanskeligt at opnå i mus på grund af den ekstra niveau af stabilisering nødvendig. Imidlertid er der rapporteret en række metoder, herunder medullære pins med sikringsanlæg søm, låseplader og eksterne fikseringsindretninger 22. Disse systemer fungerer generelt godt, men i betragtning af deres komplicerede design, de kan være teknisk udfordrende at installere. For eksempel Garcia et al. 23 udtænkt en elegant sikringsanlæg pin til anvendelse i mus, men proceduren indebærer indsnit på to separate websteds og omfattende ændring af lårbenet til at rumme benene. Disse procedurer blev udført under et dissektionsmikroskop.
Heri beskriver vi en simpel femoral medullær pin med en central krave designet til at forhindre lukning af en 3 mm knogle underskud og også afgrænse de oprindelige kanter defekten. Mens pin ikke var fastgjort til selve knoglen, til præcis dimensionering af stiften diameter og rivning af marvhulen resulterer i tilstrækkelig interferens minimere torsionsstivhed bevægelse (figur 1). Med omhyggelig udvælgelse af indavlede alder, køn og stamme-matchede mus, er resultatet en meget reproducerbar hypertrofisk ikke-uniondefect 22, som let kan evalueres radiologisk. Desuden områder af interesse kan reproducerbart defineres efter mikro-computertomografi (μCT) til måling af de novo knogledannelse og histomorfologisk parametre. Stifterne blev prototype i vores laboratorium ved hjælp af let tilgængelige værktøjer.
Figur 1: Eksperimentel princip Skematisk oversigt over den segmentdefekt model.. Den centrale 3 mm segment af en 9-10 mm murine lårben udskæres kirurgisk (venstre). En 3 mm lang, 19 gauge kirurgisk stål rør er ført over en 9 mm lange, 22 g rustfrit stålrør og fastgjort med klæbestof på det nøjagtige centrum (højre). Den resulterende stift monteret i medullære kanaler af de øvrige proximale og distale dele af femur med 19 g krave erstatte 3 mm segment af knogle (nedenfor i midten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol er beregnet til kvindelige nøgen (nu / J) mus (18-25 g, 6 uger) erhvervet fra Jackson Laboratories. Da stammer af mus variere en smule i forhold til anatomi og vækst, anbefaler vi, at fremstillingen af stifter er optimeret til stammen, køn og alder af modtagerne inden implantation i levende fag. Hvis stammerne omhyggeligt matches, prespasningen mellem tappen og marvkavitetsareal er meget reproducerbar. Procedurer for boliger, kost og generel dyrehold er uden for rammerne af denne protokol, men alle mus blev huset i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (8 th Edition) og institutionelle politik fastsat af det institutionelle Animal Care og Brug Udvalg (IACUC) og Afdeling for Medicin (DCM) ved Scott og White Hospital.
1. Fremstilling af Pins
- Skær en 9 mm længde på 22 g rustfrit hypodermisk rør, og en 3 mm længde på 19 g rør ved hjælp af en glasfiber diameter 23,8 mm forstærket tunge skæreskive monteret på en roterende værktøj. Brug små fine spids tang til at immobilisere slangen (figur 2A, ovenfor). Bær passende øjenbeskyttelse og håndtere roterende værktøj med omhu.
- Placer en lille mængde (ca. 10 ul) af cyanoacrylat klæbemiddel til midten af 9 mm aksel. Før 3 mm krave over 9 mm aksel indtil i midten og sno at fordele limen mellem kraven og skaftet. Mål dimensioner med et par digitale skydelærer og sammenlign med figur 1. Lad det stå i mindst 15 timer (figur 2A, i midten).
- Brug en 220 grus smergel-imprægneret disk for at fjerne grater og overdreven lim.
- Ved hjælp af roterende værktøj, polere stiften ved hjælp af en filt polerskive.
- Skyl med deioniseret vand og tør med omfatssed luft.
- Test integritet ved at placere en 19 g hypodermisk stump nål over akslen af den nyligt gjort stift og skubbe mod kraven. Kontroller, at kraven kan modstå ca. 25 g vægt.
- Skyl stiften i sterilfiltreret phosphatbufret saltvand (figur 2B, top). Kontroller, at skaftet af stiften passer stramt ind i den femorale medullære hulrum med kraven flugter kanter cut knogle (figur 2C). Prototype forskellige konfigurationer til de specifikke formål med undersøgelsen og modtageren (figur 2D). Kontroller, at enderne af stiften trænger ind i det trabekulære knogle i diafysen således at maksimere fiksering og forbedre presforbindelse (Figur 2E).
BEMÆRK: Det anbefales, at pasformen er testet på knogle prøver før implantation i levende mus (fx figur 2C). - Brug en 4 mm diameter Punch-biopsi cutter til at skære en cylinderfra en 5 mm tyk plade af kirurgisk gelatinesvamp. Brug en skalpel til at trimme cylinderen til 3 mm længde og passere en 20 G kanyle langs længden af cylinderen for at frembringe et hul (figur 2A, nedenfor).
BEMÆRK: Vi har fundet, at placeringen af en gelatine eller collagen stillads på stedet for defekten forbedrer celle fastholdelse og inducerer langsgående vækst langs aksen af knoglen. - Før gelatine skum cylinder over stiften og tilpasse med kraven (figur 2B, i midten) og autoklave på en tør cyklus ved 120 ° C ved 15 psi. Gelatinen skum vil tørre og mørkere i farve (figur 2B, nedenfor).
2. Kirurgisk teknik
BEMÆRK: Følgende procedure er skrevet observere alle retningslinjer fastsat af vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (8 th Edition). Overhold alle nye politikkerfastsat af den lokale IACUC og sikre en IACUC-godkendt brug af dyr protokol (eller tilsvarende) er på plads, før du fortsætter med de følgende afsnit.
Figur 3: kirurgiske instrumenter. (A) Kirurgisk kit. Micro-drill (1), opskæring hjul (2), resorberbar sutur (3), ydre sutur (4), skalpelblade (5), skalpel håndtag (6), sterile medullære pins indpakket i folie (7), medullær dybdemåler fremstillet form subkutan rør (8), fine nosed pincet (9), rotte-tænder pincet (10), stump oprømningselementerne nåle (11), nål drivere (12), små hemostats (13), fine sakse (14), periosteal elevator (15), ændret Kern pincet (16) (b):. Ændringer, der er nødvendige for at producere Kern-stil knogle-greb for mus.
- Vælg en kirurgisk procedure rum eller rent laboratorium med en aflukkelig dør og ingen gennemgående trafik. Desinficere et passende arbejde overflade med en klinisk kvalitet kvaternær baseret desinfektionsmiddel renere.
- Mens iført engangs sterile handsker og kjortel, der er nedsat et sterilt felt på ca. 60 x 90 cm 2 på desinficeret arbejde overflade med autoklaverede klud gardiner.
BEMÆRK: Det er tilrådeligt at have en assistent fjerne den ydre emballage og præsentere de sterile materialer til investigator oprettelse banen. - Placer en sminket varmepude monteret på en varm vand re-cirkulationspumpe på filmen og dække med sterile engangs gardiner. Varm en perle sterilisator til driftstemperatur (250-265 ° C, det tager op til 30 min).
- På det sterile område, arrangere den kirurgiske kit (figur 3A) til at skabe nem adgang til alle komponenter. Også give steril bomuldsgaze (2 x 2 inch 2), sterile Q-tips, en steril stål skål (500 ml) indeholdende sterilt saltvand (0,9% w / v), og chlorhexidin / isopropylalkohol kirurgisk desinficerende applikatorer.
- Saml en lilledyr anæstesi enhed ved siden af det sterile område med en induktion kammer og næse-kegle samling i overensstemmelse med veterinær vejledning og brugervejledningen. Brug klinisk kvalitet ilt som levering og isofluran gas, USP.
Figur 4: Kirurgisk procedure. (AC) metode og eksponering af lårbenet. (DE) Højde og nedskæringer. (FK) Rivning og dimensionering af medullære kanaler.
Figur 5: Kirurgisk procedure. (AB) Installation af pin. (CD) Lukning. (E) Typisk billede af korrekt placeret stift 24 timer efter operationen.
- Placer en mus i induktion Kammer anæstesi-systemet og set output til 2 L min -1 O 2 og isofluran koncentration til 3% (v / v).
- Kontroller, at musen er bevidstløs inden for 1 min; øge koncentrationen til 4% (v / v) om nødvendigt. Fjern mus, sted på sterile område med varmepuden placeret nedenunder og anvende næsekeglen. Transfer tilflyde kegle, og reducere isofluran til 2,5%, vent yderligere 20 sek, og test for tilstrækkelig kirurgisk plan i overensstemmelse med den institutionelle politik. Typisk manglende et bagben refleks når forsigtigt presset er tilstrækkelig til at bestemme passende bedøvelse.
- Under hele processen, har en assistent monitor for en stærk regelmæssig vejrtrækning og lyserød farvning af ekstremiteterne og mund regionen for at sikre en passende grad af iltning mens bevidstløs. Juster anæstesi efter veterinær vejledning og institutionelle politik om nødvendigt. Anvend steril kunstige tårer smøremiddel salve (15% (v / v) mineralsk olie, 83% (v / v) WHite vaseline) for øjnene.
- Vend musen på den ene side med hind-lemmer opad på en ny engangs drapere. Fjern om nødvendigt pels med en elektrisk barbermaskine eller hårfjerning creme. Tør site med sterilt saltvand og fjern ekstra drapere med overskydende pels. Placer en ny fenestreret filmen over musen for at dække alle dele, men hele hind-ben (figur 4A), men opretholde visning af ansigt og pote til at overvåge farvning og vejrtrækning.
- Find de proximale og distale ender af lårbenet og incise huden i 5-10 mm langs den langsgående akse (figur 4B). Adskil hudlag fra fascia med en # 15 skalpel, udsætter en lateral tilgang til lårbenet via biceps femoris og vastus lateralis. Find hvor septa begge muskler mødes (det er en linje af hvide væv mod lyserød farvning af muskel). Med en skalpel, forsigtigt dissekere langs intermuscular grænse indtillårbenet er synlig (figur 4B).
- Develop snittet med en stump periosteal elevator for at blotlægge hele diafysen (figur 4C). Brug elevatoren for yderligere udsætte de centrale totredjedele af lårben samtidig med, at bevare den bageste nerveforgrening på den mediale side (figur 4D). Skrabe forsigtigt blødt væv ud af knoglen med en skalpel, og tør efter med en steril vatpind eller tilsvarende.
- Find midten af lårbenet med calipre om nødvendigt og mærke med en steril skalpel eller markør, så markere 1,5 mm proksimalt og distalt fra centrum. Klem forsigtigt lårbenet ved hjælp af et par fine næse tænger tidligere gammeldags i Kern stil at forhindre overdreven pres på knoglen.
BEMÆRK: De nøjagtige dimensioner for ændringer leveres i figur 3B. Det er tilrådeligt at teste pincet på en aflivet prøve før anvendelse for at sikre, at knoglen vil ikke bryde under pres kræverd til immobilisering under skæring. - Ved hjælp af en fin boremaskine forsynet med en fin diamant-grus belagt skærende hjul (8 mm i diameter x 0,1 mm bredde), gøre det første snit med elevatoren for at beskytte væv nedenfor (Figur 4E). Raising snittet femur til 45 °, mens fast holder yderste diafysen, gør den anden cut, fjerne en 3 mm segment.
Anbefales Face beskyttelse på dette stadium: BEMÆRK. - Med knoglen immobiliseret ved pincet forsigtigt ream de medullære kaviteter i hver ende med en stump 23 G kanyle. Ved hjælp af en pre-made rytterværktøj fremstillet af en længde på 22 g rør anbragt i 19 g rør (figur 3A, i tem 8) vurdere dybden af reamed marvhulen og sikre, at det er 3 mm (figur 4F-K) . Hvis marvhulen modstår 22 g dybdemåler, ream igen med en stump 22 G kanyle.
- Sæt forsigtigt medullære stift i proksimale så distale medullær cavities at bringe femur tilbage til sin oprindelige længde og etablere en stabil 3 mm hul (figur 5A, B). Hvis det er nødvendigt, anvende en lille mængde manuelt stress for at opnå en god pasform af stangen interferens med barkbenet af lårbenet. Kontroller, at stiften passer stramt ind i de medullære kaviteter på begge sider og kanter cut ben flugter med kraven. Hvis der er et mellemrum, ream igen med en 22 G stump nål.
- Flyt musklen og perifere væv over stiften og lukke med en kontinuerlig absorberbar 5-0 sutur (figur 5C). Luk hudincision med 5-7 knude nylon 5-0 suturer og tætning med kirurgisk klæbemiddel (figur 5D).
3. Postoperative procedurer
- Efter lukning af huden indsnit, trække anæstesi, men tillade O 2 forbliver flyder, indtil musen begynder at bevæge sig; Dette bør tage mindre end 1 min. Hvis musen forbliver ubevægelig efter 5 min afO 2 administration, se institutionelle politikker for veterinær indgriben.
- Når musen begynder at bevæge sig, forsigtigt overføre det til et bur fortrinsvis indeholder tørt, autoklaveret sengetøj.
- Placer en iglo-typen reden i hvert bur og musen vil trække sig tilbage ind i det, reducerer bevægelse. Kontroller, at musen genvinder hind-lemmer mobilitet 5-10 min efter helbredelse af bevidsthed.
- Udfør daglig postoperativ overvågning i overensstemmelse med institutionelle politikker. Giv gelatineret hydrering og mad på gulvet i buret i de første 5-7 dage og administrere analgesi og postoperativ overvågning i overensstemmelse med institutionelt godkendte politikker.
BEMÆRK: Vi administrerer 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorphin 24 med 0,25 ml saltvand subkutant, to gange dagligt i de første 3 dage og derefter hvis musen ikke genvinde normal nytte.
- Efter de første 24 timers for inddrivelse, udføre levende dyr røntgenbilleder under anæstesi at visualisere pin placering (figur 4E). Hvis PIN-koden forvredet, overveje øjeblikkelig revision kirurgi.
- På dag 7 efter kirurgi, fjerne suturer under anæstesi og hus i grupper efter institutionelle dyrehold politikker.
- Efter 2-5 uger, humant aflive dyr i overensstemmelse med den amerikanske Veterinary Medical Association godkendte metoder for eutanasi 25.
BEMÆRK: Et intraperitoneal injektion af kommercielt tilgængeligt barbiturat-kombination eutanasi cocktail er effektiv og human, men bør følges lokale institutionelle politikker for eutanasi. - Dissekere forsigtigt væk hind-led ved at udsætte den proksimale femur og bækkenet fra den mediale side. Tryk forsigtigt fælles indad fra den laterale side af benet, mens aftagning lårbenshovedet fra acetabulum (hofteskålen) med en skalpel. Skær resterende muskler og hud med en skarp skalpel eller mikro-saks, frigiverhele ekstremiteten danne bækkenet. Med en skarp par rongeurs eller tunge saks, klippe den nederste hind-ben (skinneben / fibula) ca. 5 mm under knæleddet.
BEMÆRK: Det anbefales, at alle prøver er opbevaret på samme måde inden analyse. - Fjern hud, men lad muskel på plads. Fastgør væv i 10% pufret formalin suppleret med 10 mM CaCl2 fiksativ for 1 uge, efterfulgt af opbevaring i phosphatpufret saltvand suppleret med 10 mM CaCl2 i op til 1 måned før billeddannelse. Udfør fiksering og opbevaring ved 4 ° C. Alternativt, scan prøver straks uden fiksering.
4. Analyse af Enheder
BEMÆRK: Bone healing kan vurderes ved en bred vifte af metoder, der er uden for rammerne af denne protokol. Det følgende er en metode, vi med succes har ansat ved hjælp af en prøve microCT (μCT) imager. Det anbefales, at følgende parametre are testet, dernæst optimeret til de specifikke behov i projektet.
- Wrap modellen i et tyndt lag plastik forsegling film og position den lodret i instrumentet kammer. Kontroller, at lårbenet er vinkelret på prøven fase under hele scanningen. Indstil scanning til følgende parametre; spænding = 29 kV, nuværende = 661 uA, magt = 19 W, image pixelstørrelse (um) = 21,00; 360 graders rotation = yes; ramme gennemsnitsberegning = på (5); trin rotation (grader) = 1,00, tilfældig bevægelse = på. Gem billeder som JPEG-filer i en enkelt destination mappe pr scanning (fx figur 6A).
BEMÆRK: Scanningen skal være komplet i 57 min. - Udnyt genopbygningen software til at generere aksiale billeder baseret på følgende parametre; udjævning = om (4), forskydning kompensation = på, ring artefakt reduktion = på (5), stråle-hærdende korrektion (40%), CS rotation (grader) = 0,00. Indstil output til 2,000-15,000 Hounsfield enheder. Gem billeder som JPEG-fileri en enkelt destination mappe pr scanning.
- Brug af aksiale billeder og analytisk software, definere regionen af interesse (ROI) ved først at indstille den proximale og distale kanter af den oprindelige defekt. Opnå dette ved at vælge de afsnit, som omfatter kun kraven. Da kraven er tykkere end den benpibestift er disse sektioner nemt defineres (figur 6B, venstre). Udeluk kraven fra beregninger ved at trække en udelukkelse zone omkring det (med en 100 um margin) og overføre den zone til hver af sektionerne i ROI (figur 6B, højre).
BEMÆRK: Polar inertimomenter, 3D rekonstruktioner og beregninger såsom mængden af ny knogle (figur 6C, D) kan let opnås ved hjælp af softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus typisk genvinde bevidstheden og Hind-lemmer mobilitet 5-10 minutter efter tilbagetrækning af anæstesi. I løbet af de første 5 dage, er det tilrådeligt at huse mus individuelt og indføre miljøberigelse at forhindre overdreven brug af lemmet. Til dette formål iglo-type reder reducere behovet for redebygning og tilskynde hvile. Vi har også observeret, at levering af mad og hydrogel på gulvet i buret reducerer sandsynligheden for pin forskydning. I perioden 5 dage, bør analgesi administreres efter behov i overensstemmelse med institutionelt-godkendte politikker. Vægttab på op til ca. 15% af den oprindelige præoperativ vægt er muligt i løbet af 5-dages postoperativ periode. Fireogtyve timer efter operationen, er røntgenbilleder af de ramte led anbefales at vurdere pin-placering. Stifterne skal helt ind de proksimale og distale medullære kanaler med kanterne af defekt flugter kraven (figur 2C,2E, figur 5E, og figur 6A). I sjældne tilfælde (<5% af tilfældene), kan pins blive forvredet på tidlige stadier af healing og animalske brug protokoller bør sørge for revision kirurgi, hvis dette sker. Selv om det er teknisk udfordrende at kvantificere torsions bevægelse på murine lårben, manuel palpering af prøver bekræftede, at torsionsstivhed og langsgående bevægelse er marginal efter 7 dage som bindevæv akkumuleres omkring stiften. Efter 5 dages postoperativ overvågning, kan musene returneres til standard kollektiver pr institutionelt godkendt politik.
Uden terapeutisk intervention, kanterne af defekten typisk strække 0,5 mm i løbet af 21 dage, men i sjældne tilfælde kan ny knoglevækst være op til 1 mm (figur 6A). Knoglevækst anholdelser efter denne periode som de inflammatoriske og anabolske stadier af regenerering ophører resulterer i en ikke-union defekt. Efter 14-21 dages healing, mængden of de novo knogle kan let bestemmes fra aksiale billeder genereret af μCT scanning. Ved hjælp af scanning, aksiale genopbygning og udvælgelse ROI, der er beskrevet i protokollen, mængden af ny knogle genereret stiger med tiden, men ikke generelt overstiger i alt 1 mm 3 i fravær af terapeutisk intervention (figur 6C) i forhold til 6- 7 mm 3 i en anatomisk ækvivalent region skadede lårben. Mens konventionelle biomekanisk testning er teknisk udfordrende på grund af modellen størrelse og art fiksering metode, den polære inertimoment (PMI), en vurdering af evnen af et materiale til at modstå vridning baseret på tværsnitsareal og tæthed, har været vist sig at udgøre en passende vurdering af styrken i lange knogler 26,27. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, kan vælges aksiale tværsnit i forskellige afstande fra de læsioner kanter til analyse. Efter 21 dage PMI af de novo knogle 0,25 mm from læsionen kanter varierer fra mellem 0,05-0,35 mm 4 i forhold til 0,02-0,08 mm 4 i midten af læsionen yderligere bekræfter tilstedeværelsen af ikke-union i ubehandlede tilfælde (figur 6D). PMI for skadede lårbenet i en anatomisk tilsvarende placering ligger typisk mellem 0,5-0,7 mm 4 ved betingelserne beskrevet her.
Figur 6: Typiske resultater. (A) X-ray scanninger af lårben på dag 7, 14 og 21 efter kirurgi demonstrerer begrænset indvækst af knogle Panel B:. Skematisk repræsentation af ROI parametre for volumetrisk knogle måling. Repræsentant aksialt tværsnit med en udelukkelse zone (EX) over stiften krave herunder en 100 um margin at udelukke målinger af artefakter på metal-væv interface (venstre). Fuld knoglescanning (right, øverst) viser den langsgående ROI defineret af dele af knoglen mellem kanterne af kraven med originale knoglevæv udelukket (EX). De oprindelige læsion kanter er placeret i de aksiale sektioner ved hjælp af forskellen mellem diameteren af stiften og kraven (højre, nedenfor). (C) Typiske volumetriske målinger på dag 7, 14 og 21 efter kirurgi med ingen terapeutisk intervention (betyder med standardafvigelser, n = 3). (D) PMI målinger ved aksiale sektioner 0,25 mm fra den proximale og distale læsioner kanter og midtpunktet (middel med standardafvigelser, n = 3). (E) Massons trichrom-farvede paraffinindlejret sektion (venstre) skæres i længderetningen demonstrerer knogle udvækst består af brusk (CA) og spongiøs knogle (b) (skala bar = 0,5 mm). Positionen af feltet er angivet på X-ray scanning (højre). (F) ikke-decalcified, methylmethacrylat indlejret koronalt sektion på 1 dag gammel defekt farvet med hematoxylin og eosin (skala bar = 1,0 mm). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Afkalkning af væv typisk tager 10-14 dage under anvendelse af standardbetingelser, og er let overvåges ved røntgen-scanning. Det er tilrådeligt at bevare en vis muskulaturen på prøverne under afkalkning at forbedre stabiliteten under håndtering. Efter afkalkningen kan stifter fjernes forsigtigt med en skarp skalpel tillader paraffinindlejring og histologi. Masson trichrom farvning af langsgående sektioner tillader visualisering af endochondral knogle udvækst med en forkant af brusk (ca) efterfulgt af spongiøs knogle (cb) (figur 6E). Mens nogle skader uundgåeligt vil forekomme under dissektion, den histologiske struktur af knogleog bindevæv forbliver klar, hvis stiften fjernes omhyggeligt. Alternativt kan methylmethacrylat indlejring og sektionering af ikke-demineraliseret sektioner udføres med stiften på plads (figur 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskriver vi en simpel metode til at generere en kritisk størrelse pin-stabiliserede defekt af den murine femur ved anvendelse af standard laboratorieudstyr og veterinære udstyr. Mens samlingen af benene og kirurgiske procedure selv kræver praksis, er det godt inden mulighederne i en veluddannet biomedicinsk forsker eller dyrlæge.
Stiften er placeret i marvkanalen uden yderligere fiksering, hvilket gør proceduren teknisk mere gennemførlige end mere komplicerede metoder, der anvender eksterne fikseringsindretninger eller sikringsanlæg skruer. Mens nogle torsions bevægelser kan forekomme i løbet af de tidlige stadier af heling, dette minimeres ved omhyggelig opmærksomhed på pin diameter og tilstrækkelig rømning af marvkanalen så man opnår en fast prespasning mellem implantatet og endosteum. Med omhyggelig udvælgelse af indavlede stamme og matchning af alder og køn, bliver fit reproducerbart robust inden for få dage. Alligevel with fremkomsten af 3D trykteknikker, forventes det, at torsions bevægelser kan reduceres yderligere ved mere avancerede udgaver af den knappenål, der indarbejde ru overflader og / eller modhager bindingssteder. Den lette pin fabrikation og tilgængeligheden af en bred vifte af hypodermiske rørstørrelser også tillader optimering af teknikken til stort set alle voksne indavlede mus, uanset fysiske eller eksperimentel knogle fænotype.
Den unikke pin-krave design tjener to formål: (i) at forhindre afvigende indsnævring af defekten og skaden af knoglen ekstremiteter gennem langsgående glidning, og (ii) at give vartegn, der definerer de oprindelige kanter defekten. Som sådan volumetrisk og PMI målinger kan foretages nemt ved hjælp af en prøve μCT scanner såsom en Skyscan 1174. Faktisk har denne fremgangsmåde tillader en grad af kvantificering, der ikke let opnås med standard ikke-kritiske størrelse fraktur teknikker, der ofte udviser variabel eller poorly definerede skader. Mens en μCT enhed er at foretrække for kvantificering af healing, evaluering af objektiv vurdering af ortogonale røntgenbilleder eller 2D-billede analyseteknikker kan repræsentere mulige alternativer. På grund af deres lille størrelse og relativt lavt indhold af mineraler, kan murine lemmer let fremstilles til histologi og monteret som hele prøver til konventionel histomorfometri. Dette afviser prøveudtagning problemer ofte står over for forskere, der udfører histomorfometriske analyser af store dyr frakturer.
I forsøgene beskrevet her, helbredende tid var relativt kort efter 3 uger, hvilket svarer til den hurtige, anabolske fase af knogleheling. Derefter knogleremodellering er en meget langsom proces 28. Generelt, hvis brodannelse ikke overholdes efter 4 uger, er usandsynlig og efter aftale healing, observere vi meget lidt ekstra knoglevækst efter 4 uger i dette system. Endvidere et 3 mm hul opfylder kriterierne i Key et all. 16 for en kritisk størrelse defekt og Garcia et al. viste, at et hul så smal som 1,8 mm ikke i tilstrækkelig grad heler efter 10 uger, og dette kan blive forsinket til 15 uger med strippet perichondrium 23.
Mens størrelse og sårbarhed af deres knogler tilstedeværende alvorlige tekniske udfordringer for ortopædisk forskning, brug af mus er fordelagtig på mange måder. For eksempel er der en bred vifte af immunsvækkede stammer, der tillader testning af humane celler og proteiner uden frygt for immunologisk afstødning, og deres lille størrelse reducerer behovet for store mængder af værdifulde eksperimentelle materialer, celler eller forbindelser. Dette er eksemplificeret ved vores nylige undersøgelse, som viser effekten af voksne humane stamceller og deres ekstracellulære proteiner til osteoregeneration 29. Den relativt korte levetid af mus også præsentere mulighed for forskning i aldring 30 og den brede vifte af indavlede stammer peRMIT studiet af globale genotype på healing 31. Der er også en række sygdomstilstande modeller, der er let nedsat i mus, såsom diabetes og osteoporose 32,33. Af væsentlige note er tilgængeligheden af mange transgene mus, der kan anvendes med denne teknik til at fremme vores forståelse af regenerativ knogle fysiologi under forhold med ekstrem traumer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takke personalet og dyrlæger på Scott & White Hospital Afdeling for Medicin, Temple, Texas, for deres uvurderlige råd og bistand under udviklingen af denne teknik. Dette arbejde blev finansieret delvist af Institut for regenerativ medicin programmet finansierer, Scott & White RGP tilskud # 90172, NIH 2P40RR017447-07 og NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Vi takker Dr. Suzanne Zeitouni til korrektur manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
- Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
- Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
- Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
