Introduction
On estime que la moitié de la population américaine l'expérience d'une fracture à l'âge de 65 1. Pour les patients atteints de fractures traitées chirurgicalement, 500 000 procédures impliquent l'utilisation d'un greffon osseux 2 et ce nombre devrait augmenter avec une population vieillissante de plus en plus 3 . Bien que l'os est l'un des rares organes qui a la capacité de guérir complètement sans laisser de cicatrices, il ya des cas où le processus échoue 3,4. Selon les circonstances et la qualité du traitement, 2-30% des fractures des os longs, provoquant ainsi non syndiqué 3,5. Bien qu'il reste un débat sur la définition, la pseudarthrose, lésions osseuses critiques taille ou non syndiqués se réfère généralement à une blessure qui ne guérit pas sur la durée de vie naturelle de l'objet 6. À des fins expérimentales, cette durée est ramenée à la durée moyenne nécessaire pour la guérison complète d'une blessure de taille moyenne os. Lésions osseuses non syndiqués se produisent pour numbreuses raisons, mais les principaux facteurs comprennent traumatismes extrêmes résultant en un écart de taille critique, une infection, une mauvaise angiogenèse, l'usage du tabac, ou la capacité de osteoregenerative inhibée en raison de maladie ou d'âge de 7 ans. Même si les non-syndicats sont traités avec succès, il peut coûter plus de $ 60 000 par la procédure, selon le type de blessure et les approches utilisées 8.
Dans les cas modérés, greffe osseuse autologue est employé. Cette stratégie implique la récupération de l'os à partir d'un site donneur et l'implantation sur le site de la blessure. Bien que cette approche est extrêmement efficace, le volume de l'os disponible des donateurs dérivés est limité et la procédure implique une intervention chirurgicale supplémentaire, qui se traduit par une douleur persistante dans de nombreux patients 9,10. En outre, l'efficacité de la greffe osseuse autologue dépend de la santé du patient. substituts osseux synthétiques fabriqués à partir de matériaux ou de la moelle cadavérique traitées sont abondamment disponibles 11-13, mais ils Have des limitations importantes, y compris les pauvres propriétés d'adhérence hôte cellulaire, ostéoconductivité réduite, et le potentiel de rejet immunitaire 14. Il ya donc un besoin urgent de technologies de régénération osseuse qui sont sûrs, efficaces et largement disponible.
Notre capacité à améliorer les stratégies de régénération osseuse dépend essentiellement de la capacité d'imiter graves traumatismes des os chez les animaux d'essai, mais la génération et la stabilisation de grandes lésions osseuses est techniquement difficile. Dans la plupart des cas, de graves traumatismes des os longs est imité expérimentalement en établissant un défaut qui ne seront pas guérir naturellement. Bien qu'elle puisse varier avec les espèces 15, ceci est obtenu par l'élimination complète d'un segment d'os qui est supérieure à 1,5 fois le diamètre de l'os en coupe 16. L'os est ensuite stabilisé avec un implant métallique pour maintenir une orientation correcte des bords de la fracture et permettre la mobilité. En raison de leur petite taille et la fragilité deleurs os longs, l'établissement de telles lésions chez les souris sont au-delà des capacités de la plupart des groupes de recherche. En tant que tel, les modèles de défauts des os longs sont confinés à des rats et des animaux plus gros. Néanmoins, les souris présentent des avantages significatifs de recherche en ce sens qu'ils peuvent être génétiquement modifiés et élevés que les souches immunodéprimés qui ne rejettent cellules et de tissus humains.
Pour les applications à base de cellules humaines, des souris immunodéprimées sont attrayants pour travailler avec, car ils sont physiologiquement bien caractérisés, facile à la maison, rentables, et facilement analysés radiologiquement et histologiquement. Est d'une importance primordiale que les souris immunodéprimées ne rejettent pas les cellules de différentes espèces, dont les humains. Leur petite taille permet également l'essai de très petits nombres de cellules ou des volumes d'échafaudages expérimentaux dans des applications orthopédiques. Plusieurs modèles murins orthopédiques ont été signalé que permettre différents degrés de stabilité osseuse 17,18. Ceux systems qui aboutissent à des niveaux très élevés de stabilité, tels que des fixateurs externes et plaques de verrouillage guérissent principalement par l'ossification endochondrale intramembranaire bien la guérison a été rapporté 19. En revanche, celles qui permettent certaines micro et / ou macro-mouvement, tels que ceux employant broches médullaires non fixées ou partiellement fixes, guérir généralement avec une prédominance de l'ossification endochondrale 20,21. Union retardée ou défauts non syndiqués de os long sont particulièrement difficiles à obtenir chez des souris en raison du niveau supplémentaire de stabilisation requise. Cependant, un certain nombre d'approches ont été signalés, y compris broches médullaires avec des clous de verrouillage, plaques de verrouillage et des fixateurs externes 22. Ces systèmes fonctionnent généralement bien, mais étant donné leur conception compliquée ils peuvent être techniquement difficile à installer. Par exemple, Garcia et al. 23 conçu un élégant système d'axe de verrouillage pour une utilisation chez les souris, mais la procédure implique des incisions à deux site distincts et une modification importante du fémur pour recevoir les tiges. Ces procédures ont été effectuées sous un microscope à dissection.
Nous décrivons ici d'une simple broche médullaire fémoral d'une collerette centrale destinée à empêcher la fermeture d'un déficit osseux de 3 mm et également délimiter les bords d'origine du défaut. Bien que la broche n'a pas été fixé à l'os lui-même, le dimensionnement précis du diamètre de la broche et l'alésage du résultat de la cavité médullaire interférence suffisante pour minimiser le mouvement de torsion (figure 1). Avec une sélection rigoureuse de consanguin âge, du sexe et des souris de souche appariés, le résultat est une non-uniondefect hypertrophique hautement reproductible 22 qui peut être facilement évaluée par radiologie. De plus les régions d'intérêt peuvent être définies de manière reproductible après la micro-tomographie (μCT) pour la mesure de la formation de novo de l'os et les paramètres histomorphologiques. Les broches ont été prototypé dans notre laboratoire en utilisant des outils facilement disponibles.
Figure 1: principe expérimental résumé schématique du modèle de défaut segmentaire.. Le segment central 3 mm d'un fémur de souris 9-10 mm est excisé chirurgicalement (à gauche). Un tube en acier chirurgical de calibre 19 3 mm de long est passé sur un 9 mm de long, 22 G tube en acier inoxydable et fixe avec colle exactement au centre (à droite). La tige résultante est ajusté dans les canaux médullaires des parties proximale et distale du fémur restant avec le collier 19 G en remplaçant le segment de 3 mm d'os (ci-dessous, au centre).
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Protocol
NOTE: Ce protocole est conçu pour nude (Nu / J) des souris femelles (18-25 g, 6 semaines) acquis auprès de Jackson Laboratories. Depuis souches de souris varient légèrement en termes d'anatomie et de taux de croissance, nous vous conseillons de la fabrication de broches est optimisé pour la souche, le sexe et l'âge des bénéficiaires avant l'implantation dans des sujets vivants. Si les souches sont appariés avec soin, l'ajustement serré entre la broche et la cavité de la moelle osseuse est très reproductible. Procédures pour le logement, l'alimentation et l'élevage générale des animaux sont au-delà du champ d'application de ce protocole, mais toutes les souris ont été logées en conformité avec le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (8 e édition) et les politiques institutionnelles fixé par l'institutionnel de protection des animaux et de Utilisation Comité (IACUC) et Département de médecine comparative (DCM) à Scott et à l'Hôpital Blanc.
1. Fabrication de Pins
- Couper une longueur de 9 mm de 22 G tube hypodermique inoxydable, et une longueur de 3 mm de 19 G tubage à l'aide d'une lourde roue de coupure de fibre de verre de 23,8 mm de diamètre renforcé monté sur un outil rotatif. Utilisez de petites pinces à pointe fine pour immobiliser le tube (figure 2A, ci-dessus). Porter des lunettes de protection et à manipuler avec soin outil rotatif.
- Placer une petite quantité (environ 10 ul) d'adhésif à base de cyanoacrylate pour le milieu de l'arbre 9 mm. Faire passer le col de 3 mm au-dessus de l'arbre jusqu'à 9 mm au centre et se tordre pour distribuer uniformément la colle entre le collier et l'arbre. Mesurer les dimensions avec une paire d'étriers numériques et les comparer avec la figure 1. Laisser reposer pendant au moins 15 heures (figure 2A, centre).
- Utilisez un disque d'émeri imprégné de grain 220 pour enlever les bavures et de la colle excessive.
- Utilisation de l'outil rotatif, polir la broche en utilisant un disque de polissage senti.
- Rincer à l'eau déminéralisée et sécher avec compressed air.
- intégrité de test en plaçant une aiguille hypodermique 19 G émoussée sur l'arbre de la broche nouvellement fabriqué et poussée contre la collerette. Assurez-vous que le collier peut résister à environ 25 g de poids.
- Rincer la broche dans phosphate salin filtration stérile tamponnée (figure 2B, en haut). Se assurer que l'arbre de la broche se adapte parfaitement dans la cavité médullaire du fémur avec la chasse d'eau de collier contre les bords de l'os de la coupe (figure 2C). Diverses configurations prototypes aux fins spécifiques de l'étude et le destinataire (figure 2D). Se assurer que les extrémités de la goupille pénètrent dans l'os trabéculaire de la diaphyse de façon à maximiser la fixation et d'améliorer l'ajustement serré (figure 2E).
NOTE: Il est recommandé que l'ajustement est testé sur des échantillons d'os avant l'implantation chez des souris en direct (par exemple, la figure 2C). - Utilisez un coupe-punch-biopsie de 4 mm de diamètre pour couper un cylindreà partir d'une feuille épaisse de 5 mm d'chirurgicale éponge de gélatine. Utiliser un scalpel pour couper le cylindre à 3 mm de longueur et de passer une aiguille hypodermique 20 G le long de la longueur du cylindre pour générer un trou (figure 2A, ci-dessous).
REMARQUE: On a trouvé que le positionnement de la gélatine ou un échafaudage de collagène au niveau du site du défaut améliore la rétention de cellules et induit la croissance longitudinale le long de l'axe de l'os. - Faire passer le cylindre de mousse de gélatine sur la broche et se aligner avec le collier (figure 2B, au centre) et sur un cycle autoclave sec à 120 ° C à 15 psi. La mousse de gélatine va sécher et assombrir en couleur (Figure 2B, ci-dessous).
2. Technique chirurgicale
NOTE: La procédure suivante est écrit en observant toutes les directives établies par le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (8 e édition). Se il vous plaît d'observer toutes les politiques supplémentairesfixé par le IACUC locale et d'assurer un protocole d'utilisation d'animaux IACUC approuvé (ou équivalent) est en place avant de procéder avec les sections suivantes.
Figure 3: Les instruments chirurgicaux. (A) kit chirurgical. Micro-forage (1), la roue de coupe (2), la suture absorbable (3), suture externe (4), les lames de bistouri (5), poignée de scalpel (6), broches médullaires stériles enveloppés dans du papier (7), jauge de profondeur médullaire formulaire mis à tube hypodermique (8), pince fine nez (9), rat-dents pince (10), des aiguilles d'alésage Blunt (11), les pilotes de l'aiguille (12), les petites pinces hémostatiques (13), des ciseaux fins (14), rugine (15), pince modifiés Kern (16) (B):. Modifications nécessaires à la production d'os poignées Kern de style pour les souris.
- Sélectionnez une salle chirurgicale de procédure ou un laboratoire propre avec une porte qui peut être fermée et aucun trafic de transit. Désinfectez une surfac de travail adaptée avec un nettoyant désinfectant à base quaternaire de grade clinique.
- Tout en portant des gants stériles jetables et robe, mettre en place un champ stérile d'environ 60 x 90 cm 2 sur la surface de travail aseptisé avec des rideaux en tissu autoclaves.
NOTE: Il est conseillé d'avoir un assistant enlever l'emballage extérieur et présenter les matériaux stériles à la mise en place de l'enquêteur sur le terrain. - Placez un coussin chauffant aseptisé monté sur une réutilisation de l'eau chaude sur le circulateur drapé et couvrir avec des rideaux stériles jetables. Chauffer un stérilisateur à billes à la température de fonctionnement (250 à 265 ° C, cela prend jusqu'à 30 minutes).
- Sur le champ stérile, arranger le kit chirurgical (figure 3A) de fournir un accès facile à tous les composants. En outre, fournir la gaze de coton stérile (2 x 2 pouces 2), Q-tips stériles, un bol en acier stérile (500 ml) contenant une solution saline stérile (0,9% p / v) applicateurs et chlorhexidine désinfectants / alcool isopropylique chirurgicale.
- Assembler un petitunité de l'anesthésie des animaux à côté du champ stérile avec une chambre d'induction et l'assemblage nez cône conformément aux directives vétérinaire et le manuel utilisateur. Utiliser l'oxygène de grade clinique que l'alimentation en gaz et de l'isoflurane, USP.
Figure 4: procédure chirurgicale. (AC) approche et l'exposition du fémur. (DE) Elevation et les coupes. (FK) alésage et le dimensionnement des canaux médullaires.
Figure 5: Intervention chirurgicale. (AB) Installation de la broche. (DR) Clôture. (E) d'image typique de bien positionné broche 24 h après la chirurgie.
- Placer une souris dans la chambre d'admission du système d'anesthésie et SEt à la sortie L 2 O 2 min -1 et la concentration d'isoflurane à 3% (v / v).
- Vérifiez que la souris est inconscient en 1 min; augmenter la concentration de 4% (v / v), si nécessaire. Retirer la souris, lieu le champ stérile avec le coussin chauffant positionné sous et appliquer le cône de nez. Transfert écouler vers le cône, et de réduire l'isoflurane à 2,5%, attendre un autre 20 secondes, et le test pour le plan chirurgical adéquat conformément à la politique institutionnelle. Typiquement, le manque d'un membre postérieur réflexe lorsqu'il serra doucement est suffisante pour déterminer une anesthésie adéquate.
- Pendant tout le processus, avoir un moniteur adjoint de la respiration régulière et forte coloration rose des extrémités et de la bouche région pour assurer un niveau approprié d'oxygénation alors inconscient. Réglez l'anesthésie conformément aux directives vétérinaire et politique institutionnelle si nécessaire. Appliquer larmes artificielles lubrifiant pommade stérile (15% (v / v) d'huile minérale, 83% (v / v) white vaseline) pour les yeux.
- Tourner la souris sur une face avec le membre postérieur tourné vers le haut sur un nouveau drap jetable. Si nécessaire, enlever la fourrure avec un rasoir électrique ou de la crème d'épilation. Essuyez le site avec une solution saline stérile et enlever le drap supplémentaire avec excès de fourrure. Placez un nouveau drapé fenêtrée sur la souris de manière à couvrir toutes les parties, mais l'ensemble des membres postérieurs (figure 4A), mais de maintenir vue de la face et de la patte de surveiller la coloration et la respiration.
- Localiser les extrémités proximale et distale du fémur et inciser la peau pendant 5 à 10 mm le long de l'axe longitudinal (figure 4B). Séparer la couche de peau de l'aponévrose avec un scalpel # 15, exposant une approche latérale au fémur via les biceps crural et vaste externe. Repérez les endroits où les cloisons des deux muscles répondre (ce est une ligne de tissu blanc contre la coloration rose du muscle). Avec un scalpel, disséquer soigneusement le long de la frontière jusqu'à ce intermusculairele fémur est visible (Figure 4B).
- Développer l'incision avec une rugine émoussée de manière à exposer l'ensemble de diaphyse (figure 4C). Utilisez l'ascenseur pour exposer davantage les deux tiers central du fémur tout en prenant soin de préserver le faisceau neurovasculaire postérieure du côté médial (figure 4D). Grattez délicatement tissus mous hors de l'os avec un scalpel, et sécher avec un Q-tip ou équivalent stérile.
- Localisez le centre du fémur avec étriers si nécessaire et marque avec un scalpel stérile ou un marqueur, puis marquez 1,5 mm proximale et distale du centre. Saisir doucement le fémur en utilisant une paire de pinces fines nez préalablement façonnés dans le style Kern pour éviter une pression excessive sur l'os.
REMARQUE: Les dimensions exactes de modification sont fournies sur la figure 3B. Il est conseillé de tester la pince sur un échantillon euthanasiés avant de les utiliser pour assurer l'os ne cassera pas sous pression nécessiterad pour l'immobilisation pendant la coupe. - En utilisant une amende forage équipé d'une roue diamant fin grain coupe revêtu (8 mm de diamètre x 0,1 mm de largeur), faire la première coupe avec l'ascenseur en place pour protéger les tissus ci-dessous (figure 4E). Augmenter le fémur de coupe à 45 ° tout en tenant fermement l'extrémité de la diaphyse, faire la deuxième coupe, enlever un segment de 3 mm.
REMARQUE: Protection du visage est recommandé à ce stade. - Avec l'os immobilisé par forceps, ramette attentivement les cavités médullaires de chaque extrémité avec un 23 G aiguille hypodermique émoussé. Utiliser une profondeur de calibre pré-faites fabriqué à partir d'une longueur de 22 G tube placé dans 19 G tube (figure 3A, i TEM 8), évaluer la profondeur de la cavité médullaire alésé et se assurer qu'il est de 3 mm (figure 4F-K) . Si la cavité médullaire résiste à la 22 G jauge de profondeur, avec une rame nouveau G 22 aiguille hypodermique émoussé.
- Insérez délicatement la broche médullaire dans le proximale puis distale c médullaireavities pour amener le fémur retour sur sa longueur d'origine et d'établir un écart de 3 mm stable (figure 5A, B). Si nécessaire, appliquer une petite quantité de stress manuel pour obtenir un bon ajustement serré de la tige avec l'os cortical du fémur. Se assurer que la broche se insère parfaitement dans les cavités médullaires des deux côtés et les bords de l'os de coupe sont au ras de la collerette. Si il ya un écart, rame une fois de plus avec une aiguille émoussée 22 G.
- Repositionner le muscle et le tissu périphérique sur la broche et fermer avec un continue absorbable 5-0 suture (Figure 5C). Fermer la peau incision avec 5-7 noeud carré en nylon 5-0 sutures et le joint avec de la colle chirurgicale (figure 5D).
3. Procédures postopératoires
- Après la fermeture de l'incision de la peau, retirer l'anesthésie, mais permet de rester 2 O se écoulant jusqu'à ce que la souris commence à se déplacer; cela devrait prendre moins de 1 min. Si la souris reste immobile après 5 min deO 2 l'administration, reportez-vous aux politiques institutionnelles sur l'intervention vétérinaire.
- Lorsque la souris commence à se déplacer, transférer doucement à une cage contenant de préférence une litière sèche et autoclave.
- Passer une nid de type igloo dans chaque cage et la souris se retirera en elle, réduire le mouvement. Vérifiez que la souris récupère la mobilité des membres postérieurs 5-10 min après la reprise de conscience.
- Effectuer le suivi post-opératoire quotidienne conformément aux politiques institutionnelles. Fournir hydratation gélatinisé et de la nourriture sur le plancher de la cage pour les 5-7 premiers jours et administrer l'analgésie et la surveillance post-opératoire, conformément aux politiques approuvées institutionnellement.
NOTE: Nous administrons 0,05-0,1 mg kg -1 buprénorphine 24 avec 0,25 ml de solution saline sous-cutanée, deux fois par jour pour les 3 premiers jours et par la suite si la souris ne reprenne pas l'utilité normale.
- Après les 24 premières heures de la reprise, effectuez animaux vivants imagerie par rayons X under anesthésie pour visualiser l'emplacement du drapeau (Figure 4E). Si la tige est disloqué, envisager la chirurgie de révision immédiate.
- Au jour 7 post-chirurgie, retirer les sutures sous anesthésie et la maison en groupes conformément aux politiques d'élevage institutionnel.
- Après 2-5 semaines, euthanasier humainement les animaux conformément à l'American Veterinary Medical Association méthodes d'euthanasie 25 approuvés.
REMARQUE: Une injection intrapéritonéale de disponible dans le commerce barbituriques combinaison euthanasie cocktail est efficace et humaine, mais les politiques institutionnelles locales sur l'euthanasie doivent être suivies. - Disséquer délicatement le membre postérieur en exposant le fémur proximal et le bassin du côté médial. Presser doucement le joint vers l'intérieur depuis le côté latéral de la branche tout en détachant la tête fémorale de l'acétabule (de la douille de la hanche) avec un scalpel. Coupez le muscle et la peau restante avec un scalpel ou micro-ciseaux, libérantformer tout le membre le bassin. Avec une paire forte des rongeurs ou des ciseaux lourds, couper le membre postérieur inférieure (tibia / péroné) environ 5 mm en dessous de l'articulation du genou.
NOTE: Il est recommandé que tous les spécimens sont stockés de manière identique avant l'analyse. - Enlever la peau, mais laisser le muscle en place. Fixer le tissu dans du formol tamponné à 10% supplémenté avec 10 mM de CaCl2 fixateur pour 1 semaine, suivi par un stockage dans une solution saline tamponnée au phosphate additionné de 10 mM de CaCl 2 jusqu'à un mois avant l'imagerie. Effectuer la fixation et le stockage à 4 ° C. Alternativement, analyser les échantillons immédiatement sans fixation.
4. Analyse des échantillons
NOTE: La consolidation osseuse peut être évaluée par une grande variété de méthodes qui sont au-delà du champ d'application de ce protocole. Ce qui suit est une méthode que nous avons employée avec succès en utilisant un spécimen microCT (μCT) imageur. Il est recommandé que les paramètres suivants are testé d'abord, puis optimisé pour les besoins spécifiques du projet.
- Envelopper échantillon en une couche mince de film de matière plastique d'étanchéité et le placer verticalement dans la chambre de mesure. Assurez-vous que le fémur est perpendiculaire à la platine d'échantillon au cours de l'ensemble de balayage. Réglez l'analyse des paramètres suivants; tension = 29 kV, courant = 661 uA, puissance = 19 W, la taille d'image de pixel (um) = 21,00; Rotation de 360 degrés = yes; trame moyenne = sur (5); étape de rotation (degrés) = 1,00, mouvement aléatoire = on. Enregistrer les images comme des fichiers JPEG dans un dossier de destination unique par analyse (par exemple la figure 6A).
NOTE: L'analyse devrait être terminée en 57 min. - Utiliser le logiciel de reconstruction pour générer des images axiales sur la base des paramètres suivants; lissage = sur (4), la compensation de désalignement = on, la réduction anneau d'artefact = sur (5), faisceau durcissement correction (40%), la rotation CS (deg) = 0,00. Réglez la sortie de 2,000-15,000 unités Hounsfield. Enregistrer les images comme des fichiers JPEGdans un dossier de destination unique par balayage.
- En utilisant les images axiales et un logiciel d'analyse, définir la région d'intérêt (ROI) en fixant la première bords proximal et distal du défaut d'origine. Atteindre cet objectif en sélectionnant les sections qui englobent le collier seulement. Parce que la collerette est plus épaisse que la broche médullaire, ces sections sont facilement définis (figure 6B, à gauche). Exclure le collier de calculs en dessinant une zone d'exclusion autour de lui (avec une marge de 100 um) et le transfert de la zone à chacune des sections dans le ROI (figure 6B, à droite).
REMARQUE: moments d'inertie polaire, des reconstitutions en 3D et des calculs tels que le volume d'os nouveau (figure 6C, D) peuvent facilement être obtenus en utilisant le logiciel.
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Representative Results
Souris récupèrent la conscience et des membres postérieurs mobilité 5-10 minutes après l'arrêt de l'anesthésie. Pendant les 5 premiers jours, il est conseillé de loger souris individuellement et introduire enrichissement de l'environnement pour éviter l'utilisation excessive de la branche. A cet effet, les nids de type igloo réduisent la nécessité de la construction du nid et encouragent repos. Nous avons également observé que la fourniture d'aliments et d'hydrogel sur le plancher de la cage permet de réduire la probabilité de broche déplacement. Au cours de la période de 5 jours, l'analgésie doit être administré au besoin, conformément aux politiques approuvées institutionnellement. La perte de poids jusqu'à environ 15% du poids initial préopératoire est possible pendant toute la période post-opératoire de 5 jours. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les rayons X du membre affecté est recommandé d'évaluer pin-placement. Les broches doivent être complètement insérées dans les parties proximale et distale canaux médullaires avec les bords de la chasse d'eau de défauts contre la collerette (Figure 2C,2E, la figure 5E, et la figure 6A). Dans de rares cas (<5% des cas), les broches peuvent se disloquer à des stades précoces de protocoles d'utilisation guérison et animale devrait prévoir pour la chirurgie de révision si cela se produit. Se il est techniquement difficile de quantifier le mouvement de torsion sur fémurs murins, palpation manuelle de spécimens confirmé que le mouvement de torsion et longitudinale est marginale après sept jours que le tissu conjonctif se accumule autour de la broche. Après cinq jours de suivi post-opératoire, les souris peuvent être retournés à un logement communal norme conformément aux politiques institutionnellement approuvés.
Sans intervention thérapeutique, les bords du défaut se étendent généralement 0,5 mm pendant 21 jours, mais dans de rares cas, une nouvelle croissance osseuse peuvent être jusqu'à 1 mm (figure 6A). arrestations de croissance osseuse après cette période que les stades inflammatoires et anabolisants de la régénération cessez résultant en un défaut non syndiqués. Après 14 à 21 jours de cicatrisation, le volume of osseuse de novo peut être facilement déterminée à partir des images axiales générées par balayage μCT. Utilisation de la numérisation, les procédures de reconstruction et de sélection de ROI axiales décrites dans le protocole, le volume d'os nouveau généré augmente avec le temps, mais ne dépasse généralement pas un total de 1 mm 3 en l'absence d'une intervention thérapeutique (Figure 6C), comparativement à 6 7 mm 3 dans une région anatomique équivalent du fémur indemne. Bien que les tests biomécaniques classiques est techniquement difficile en raison de la taille de l'échantillon et de la nature de la méthode de fixation, le moment d'inertie polaire (PMI), une estimation de la capacité d'un matériau à résister à la torsion en fonction de surface de section transversale et de la densité, a été montré pour représenter une estimation appropriée de la force dans les os longs 26,27. En utilisant cette méthode, des coupes axiales à différentes distances des bords de la lésion peuvent être sélectionnés pour l'analyse. Après 21 jours, l'indice PMI de novo osseuse 0,25 mm from la lésion bords de plages de 0,05 à 0,35 mm entre 4 par rapport à 0,02 au 0,08 mm 4 au centre de la lésion qui confirme la présence de non-union dans les cas non traités (Figure 6D). L'indice PMI du fémur indemne à un emplacement anatomiquement équivalent est généralement comprise entre 0,5-0,7 mm 4 en utilisant les conditions décrites ici.
Figure 6: Les résultats typiques. Scans (A) X-ray de fémurs au jour 7, 14 et 21 post-opératoire montrant la croissance interne limitée de l'os Groupe B:. Représentation schématique des paramètres de retour sur investissement pour la mesure osseuse volumétrique. Axiale représentant de la Croix-section avec une zone d'exclusion (EX) sur la broche-collier comprenant une marge de 100 um d'exclure mesure d'artefacts à l'interface métal-tissus (à gauche). Plein scintigraphie osseuse (rroite, en haut) montrant la ROI longitudinal défini par les sections de l'os entre les bords de la collerette avec le tissu osseux d'origine exclu (EX). Les bords de la lésion d'origine sont situées dans les coupes axiales en utilisant la différence entre le diamètre de la broche et la collerette (à droite, ci-dessous). (C) des mesures volumétriques typiques à jour 7, 14 et la chirurgie 21 de poste sans intervention thérapeutique (ce qui signifie avec écarts-types, n = 3). (D) mesures PMI à des coupes axiales 0,25 mm de l'extrémité proximale et lésion distale bords et à mi-parcours (moyens avec des écarts types, n = 3). (trichrome teinté de E) Masson la paraffine section (gauche) couper dans le sens longitudinal démontrant excroissance osseuse constitué de cartilage (ca) et l'os spongieux (b) (échelle de bar = 0,5 mm). La position du champ est indiquée sur l'analyse des rayons X (à droite). (F) non-decalcified, le méthacrylate de méthyle coupe coronale intégrée de 1 jour, âgé de défaut colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (échelle bar = 1,0 mm). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La décalcification des tissus prend généralement 10 à 14 jours en utilisant des conditions standard, et est facilement surveillée par balayage aux rayons X. Il est conseillé de conserver une certaine musculature sur les échantillons pendant décalcification pour améliorer la stabilité lors de la manipulation. Après décalcification, broches peuvent être soigneusement enlevées avec un scalpel permettant inclusion dans la paraffine et l'histologie. Trichrome de Masson la coloration de sections longitudinales permet la visualisation de l'os endochondral excroissance avec un bord d'attaque de cartilage (CA), suivi par de l'os spongieux (cb) (figure 6E). Alors que certains dommages va inévitablement se produire lors de la dissection, la structure histologique de l'oset du tissu conjonctif reste clair si la broche est retirée avec précaution. Alternativement, le méthacrylate de méthyle inclusion et la coupe de sections non déminéralisées peuvent être effectuées avec la broche en place (Figure 6F).
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode simple pour générer un défaut critique taille pin-stabilisé du fémur murin utilisant laboratoire standard et vétérinaire. Tandis que l'ensemble des broches et la procédure chirurgicale elle-même exige de la pratique, ce est bien dans les capacités d'un scientifique de recherche biomédicale bien formé ou un vétérinaire.
La broche est positionnée dans le canal médullaire sans fixation supplémentaire, rendant la procédure plus faisable techniquement que les approches plus complexes qui emploient des fixateurs externes ou des vis de verrouillage. Alors que certains mouvement de torsion peut se produire au cours des premiers stades de la cicatrisation, ce est minimisée par une attention particulière au diamètre de la broche et l'alésage adéquat du canal médullaire de façon à obtenir un ajustement serré ferme entre l'implant et endoste. Avec une sélection rigoureuse des souche pure et l'appariement de l'âge et le sexe, l'ajustement devient reproductible robuste dans quelques jours. Néanmoins, wie l'avènement des techniques d'impression 3D, il est prévu que le mouvement de torsion peut être encore réduite par des versions plus sophistiquées de la broche qui incorporent des surfaces rugueuses et / ou des sites de fixation à barbes. La facilité de fabrication et la broche disponibilité d'une large variété de tailles de tubes hypodermiques permettent également l'optimisation de la technique pour pratiquement ne importe quel adulte souris consanguines, indépendamment du phénotype de l'os naturel ou expérimental.
La conception unique broches col sert à deux fins: (i) pour prévenir le rétrécissement aberrante du défaut et le dommage des extrémités osseuses par glissement longitudinal, et (ii) de fournir des points de repère qui définissent les bords d'origine du défaut. En tant que tel, volumétriques et PMI mesures peuvent être effectuées facilement en utilisant un scanner échantillon de μCT tel qu'un Skyscan 1174. En effet, cette approche permet un niveau de quantification qui ne est pas facile à obtenir avec des techniques classiques de rupture de taille non critiques qui présentent souvent variable ou pooblessures RLY défini. Bien qu'une unité μCT est préférable pour la quantification de la guérison, l'évaluation par évaluation objective des images de rayons X ou orthogonales 2D techniques d'analyse d'images peuvent représenter des alternatives possibles. En raison de leur petite taille et relativement faible teneur en minéraux, membres murins peuvent être facilement préparées pour l'histologie et montés comme des spécimens entiers pour histomorphométrie conventionnelle. Ce rejette les questions d'échantillonnage fréquemment rencontrés par les chercheurs de la scène analyses histomorphométriques de grandes fractures animales.
Dans les expériences décrites ici, le temps de guérison a été relativement courte à 3 semaines, ce qui correspond à la phase anabolique rapide de la cicatrisation osseuse. Par la suite, le remodelage osseux est un processus très lent 28. Généralement, si pontage ne est pas observée après quatre semaines, la guérison est peu probable de se produire et en accord, on observe très peu de croissance osseuse supplémentaire après 4 semaines de ce système. En outre, un écart de 3 mm répond aux critères de clé et unl. 16 pour un défaut de taille critique et Garcia et al. a démontré qu'un espace aussi étroit que 1,8 mm ne guérit pas suffisamment après 10 semaines, ce qui pourrait être retardée de 15 semaines avec 23 périchondre dépouillé.
Bien que la taille et la fragilité de leurs os présentent des défis techniques graves pour la recherche en orthopédie, l'utilisation de souris est avantageux dans de nombreuses façons. Par exemple, il existe une variété de souches de immunodéprimés qui permettent test des cellules humaines et des protéines sans crainte de rejet immunologique, leur petite taille et réduit le besoin de quantités excessives de matières précieuses expérimentaux, des cellules ou des composés. Ceci est illustré par notre étude récente démontre l'efficacité des cellules souches humaines adultes et leurs protéines extracellulaires pour osteoregeneration 29. La relativement courte durée de vie de souris présentent également la possibilité pour la recherche sur le vieillissement 30 et la grande variété de souches consanguines peRMIT l'étude du génotype mondiale sur la guérison 31. Il ya aussi un certain nombre de modèles de maladies qui sont facilement établie chez la souris comme le diabète et l'ostéoporose 32,33. Il importe de souligner est la disponibilité de nombreuses souris transgéniques qui peuvent être utilisés avec cette technique d'approfondir notre compréhension de la physiologie osseuse de régénération dans des conditions extrêmement traumatisants.
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Acknowledgments
Nous remercions le personnel et les vétérinaires au ministère Scott & Blanc Hôpital de médecine comparée, Temple, Texas, pour leurs conseils et une aide précieuse lors de la mise au point de cette technique. Ce travail a été financé en partie par l'Institut for Regenerative Medicine Fonds du Programme, Scott & White RGP subvention # 90172, NIH et le NIH 2P40RR017447-07 R01AR066033-01 (NIAMS). Nous remercions le Dr Suzanne Zeitouni pour l'épreuvage le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
- Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
- Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
- Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
