Introduction
在过去的二十年中，以过表达和纯化膜转运蛋白的能力显着增加：离子通道，初级和次级转运目前一般均从异源表达系统，以及天然来源纯化。新的方法来监测表达，改善和促进提取和提高这些蛋白质的稳定性正在不断开发1-5。这些技术的突破已经有助于触发的原子级的结构信息上的膜蛋白，这反过来，提高了我们自己的功能的结构基础的理解的爆炸。相比之下，我们的能力来探测纯化的蛋白质的功能性质没有增加以同样的速度，这样，在某些情况下，高分辨率的结构信息是伴随着定性功能数据，从而限制了我们的定量测试结构为基础的预测能力。因此，发展定量和可普及功能测定t是朝着膜蛋白功能的机械基础的澄清的关键步骤。
在这里，我们描述了可用于定量测定纯化和重组的Cl键的功能性质外排测定-通道和转运。该测定法的基本原则可以推广到各种运输系统，以及非离子转运蛋白。脂质体重组，纯化的Cl -的信道/转运在一个大的氯的存在下-梯度（ 图1A，B）。 Cl -的流出是通过加入一种离子载体的启动，以允许对离子通量，在我们的情况下，第K +离子载体缬氨霉素，其分流由氯建立的电压-梯度和设置初始膜电位至K的平衡电位+ 6,7。没有T他离子载体没有显著净Cl -的流出发生的，因为它防止了由一个跨膜电位的产生。 -流出，并且f 0，不含有活性蛋白的脂质体的分数τ，C1的时间常数：所述数据是由两个可测量参数（ 图1C）定量描述。从τ和f 0酉Cl -的传输速率，活性蛋白质的级分和活性复合体的分子质量可以衍生8。已知结构和功能的热交换器-该技术是利用脂蛋白重构与CLC-EC1，一个良好表征CLC型H + /氯这里示出。该测定是很容易推广到通道或转运与不同的离子选择性或其活性依赖于电压和/或配体的存在。另外，该测定可用于确定是否小分子直接影响重组蛋白，以定量这些化合物和如何膜组合物或脂质修饰试剂影响重构的通道和转运功能的影响。
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Protocol
1.脂质制备
- 分装所需量的脂质成透明玻璃试管中。利用E.大肠杆菌极性脂质提取物，但大部分脂质组合物都可以使用。如果脂质是粉末形式，悬浮它们的氯仿至20毫克/毫升的浓度。干燥的脂质在室温下N 2气，直到所有溶剂蒸发。
- 悬浮在戊烷的脂类，再晾干气体N 2源源不断除去氯仿遗留的痕迹。干，直到所有溶剂蒸发。而干燥，轻轻旋转管，使得所述脂质分布在均匀的膜覆盖所述管的底部第三而非形成致密质在底部。
- 添加含洗涤剂重建缓冲液（300mM的氯化钾，50mM的柠檬酸，25mM的K 2 HPO 4，pH为4.5，35毫CHAPS）溶解脂质。使用其他温和的清洁剂进行这一步，如果蛋白质是很差容忍CHAPS。
- ResuspenD使用水浴超声波仪中的脂质对清晰度。浸入管在水中超声发生器浴中的最大功率的中心在短（30秒-1分钟）脉冲短（30秒-1分钟）暂停。该解决方案应该变得清晰。
注：清晰的最终程度实现取决于所使用的特定的脂质组合物。一些批与批变异在该步骤中，甚至在名义上相同脂质，也是可能的。残留雾度是由于光散射的大颗粒在悬浮液中，这可通过离心除去。 - 在室温下孵育的悬浮脂类为20-60分钟。
2.脂蛋白体的形成
注：几种策略可以用来插入洗涤剂增溶的蛋白质到脂质体中。对于CLC-EC1透析效果很好，因此是选择6,9,10的方法。
- 添加纯化的蛋白质的期望的蛋白质与脂质（P / L）的比值（表示为微克Ò F蛋白/毫克脂质）。的P / L的比例的选择取决于实验的目的。
- 如果目标是评估所关注的蛋白质的活性，重组在高的P / L的最大化信号，因为每个脂质体含有的蛋白质的多个副本。量化的活性和/或蛋白的单一传输速率，重建在泊松稀释制度低的P / L的，以使每个小泡平均含有1蛋白质。见第7步和讨论进行了较深入的分析时，使用每个政权。
- 来确定用于各种治疗方案的最佳P / L的值，执行活动的完整滴定作为蛋白质浓度8,11-13的函数。然而，对于激活单元中的任何蛋白质的量，分子量（MW，以kDa表示）被称为后的P / L的值可以被用作初始瞎猜：
皮克“/>
- 在预润湿的透析管或盒加载的蛋白质和脂质的混合物。将透析设备在含有500-1,000x脂质重建缓冲液的体积的烧杯中（ 即 ，进行1 ml类脂再悬浮的1升缓冲液）下缓慢搅拌。
- 改变缓冲液的3-4倍的间隔> 3小时。在每一个解决方案的变化，洗磁带/管和用蒸馏水的烧杯中，注入新鲜的重建缓冲液的烧杯中。包括1-2 O / N区间的解决方案转变。确切的数目的溶液的变化和持续时间取决于所用的确切的脂质和去污剂。
- 在最后一步完成后，从透析器去除脂质体，分装在其中管和闪光灯在-80℃冻结，在液体N 2或冻结。
3.记录的建立
<P类=“jove_content”>注意：记录设置（ 图2A）包括两个腔室（平底缸，〜3-4毫升容积）中，Cl -的（见下文）的电极，pH计用模拟或数字电输出，数字转换器，和一个计算机用适当的采集软件。- 连接Cl -的电极pH计，pH计，以被连接到计算机的数字化板的输出。放置在一个腔室中的参考电极和重新编码导线中的另一个（ 图2B）。
注：导线的极性是正确的，如果ΔV 校准 （见步骤6.4和7.2）是正的。 - 放置室上的轰动板录音室（ 图1B）的搅拌棒。确保搅拌棒不接触电极。
- 连接使用琼脂桥（ 图2B）（100毫米氯化钾和2％琼脂糖）的腔室。存储在100毫米氯化钾琼脂桥梁。
4.制备的Cl -电极
- 以一个老-possibly-非正常pH电极。打破玻璃涂层完全显示出来的银线。
- 小心地从使用手术刀刀片的银线去除涂层。清洗用H 2 O和乙醇的丰富金额的电线。
- 发生的FeCl 3（或漂白剂），直到导线的饱和溶液覆盖有均匀的深色涂层氯化银的。
5.准备单层囊中
- 夜的实验之前，膨胀将1g的Sephadex G-50珠在15ml外部缓冲液（1mM的氯化钾，150mM的K 2 SO 4，25mM的柠檬酸，pH4.5）中，轻轻摇动（不搅拌），用于至少3个小时，在室温后再使用。每个实验需要〜3个毫升肿珠。保持溶胀的珠粒于4℃几天至多。
- 而脂质体解冻在室温，倒在每列〜3米升肿G-50珠。让他们干通过在RT重力流;这通常需要1-2分钟。
- 通过使用0.4米聚四氟乙烯截止通过Mini-挤出机挤出的脂蛋白11次准备单层囊。
- 放置在一个塑料圆底管色谱柱。旋柱以除去过量的溶液。在临床离心机离心20-30秒在1400 XG。
- 丢弃流过，地点列在一个13×100毫米的玻璃管中，并添加100微升挤出囊泡到柱上。在临床离心机离心柱1分钟，在500×g离心。
- 收集〜200微升流动通过的，将被添加到记录室，在步骤6.5。
6.流出测量
- 放置加入2ml的100mM氯化钾在基准（接地）室和1.8毫升外部缓冲液（1mM的氯化钾，150mM的K 2 SO 4，25mM的柠檬酸，pH4.5）中，以记录室中。内部的细微渗透压失衡和外部的解决方案不影响
- 启动收购程序。让基本平衡，这可能需要几分钟的时间。
- 一旦信号达到稳定的基线（脂质体是准备和列干），开始记录（ 图3A）。
- 加入15微升10mM的KCl溶液校准系统（ 图2A）。
- 添加脂质体。阿细跳可能是可见的，由于不完全拆除外的Cl -从脂蛋白（ 图3A）。等到基线稳定。
- 加入缬氨霉素（1微升以1mg / ml，在EtOH中）来启动流出（ 图3A）。
- 让流出的运行时间过程，直到它高原（ 图3A）。
- 加入40微升在外部缓冲器以溶解所有的脂质体（ 图3A）中制备1.5M的β-辛基葡糖苷（β-OG）。结束录制。
7.数据nalysis
- 从ASCII或文本格式导出跟踪文件，并将其导入到所选择的分析程序。
- 测量的电压在以下各点（ 图3A）：
在记录开始时（V 0）;
此外校准脉冲（V CAL）之后;
在加入脂质体（V 脂 ）的;
在流出（Ⅴ 翅片 ）的端部;
在加入洗衣粉（V TOT）的;
基线的电压使V 0 = 0。 - 使用能斯特 - 普朗克公式确定的实验值
通过测量
其中，卷校准是在校准脉冲在微升的体积，1800是腔室容积在开始的实验中表达1，L，[CL] 卡/中是氯-在毫米外部缓冲器的校准脉冲和浓度ΔVCAL的校准脉冲后测得的跳毫伏。
注：此经验确定α的有三个目的：它保证了系统正常响应，提供实验之间的仪器的响应的一致性的措施，以及检查是否有错误是在溶液中做出决策。 - 每一步之后计算氯浓度如下：
该因子四百分之三来自稀释15微升校准脉冲的进入2000微升最终体积。 - 演算吃在每一步，ΔCL 脂/鳍/ TOT的变化[氯]。
- 转换V（T）的氯（T）与
在临界点直接决定（CL）值，并将其进行比较，以计算出的值作为内部对照。 - 标准化的跟踪，这样的氯相对 脂 = 0和Cl 相对 托特 = 1
- 适合的流出时间过程，以下面的等式：
其中L是Cl的速率-漏是通过实验，通过测量确定的氯-从在相同条件下，τ制备无蛋白质的脂质体流出是过程的时间常数。 - 计算V，初始速度：
其中，ΔCL 翅片表达于毫摩尔，V是在微升室的容积。 - 计算运输率/电导率
其中，p是在P / L时，MW为活性复合物的分子量以kDa表示
通过测量
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Representative Results
我们描述了一个详细而强大的协议来衡量Cl -的运输由纯化CLC-EC1，原核CLC-H型+ /氯介导-交换，重组的脂质体。该实验的示意图示于图3脂蛋白体重组，纯化的CLC-EC1和含有高内氯-浸渍在含低氯浴溶液- 。在这些条件下的净Cl -的流出防止通过在脂质体（ 图3A）正电荷的累积。此外缬氨霉素允许K +而穿过膜从而分流的电势和起始氯移动-流出（ 图3B）。通量时间过程使用C18监控- -选择性电极和Cl的总量-包含在囊泡直接用洗涤剂增溶这些测量。从这些散装实验能够确定单一重组蛋白质，如周转率，活性络合物活性的蛋白质和馏分的化学计量性质。使用方程7-9，以适应流出时间过程，并估计CLC-EC1的单一的运输速度，我们发现，τ（0.2微克/毫克）= 41秒和f 0（0.2微克/毫克）= 0.31，这表明〜1 /脂质体3 0含有活性蛋白。从这些值，我们计算出的单一运输率γ〜2500 Cl -的秒-1，与公布值8,14吻合。
图1：Cl -的流出法（A - B）的氯离子示意图- -efflux检测蛋白质，脂质体免费（A）或CLC-EC1。重构囊泡（B）中 。 （C）模拟时间的离子载体发起的氯过程-从脂蛋白（黑色）或无蛋白脂质体（灰色虚线）外排。流出，通过加入离子载体（*）的发起和终止通过加入去污剂以溶解脂质体（^）。红色虚线是指数拟合来确定时间常数τ，氯离子-外流含CLC-EC1和f 0的至少1活动副本脂质体含有0活性蛋白脂质体的一部分，请点击这里查看更大的版本这个数字。
图2：录制成立（A）的记录设置。 （B）特写的室。 <A HREF =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图3：样品跟踪与分析 （ 一 ）典型的V（T）从脂蛋白在0.2微克/毫克P / L重组与WT CLC-EC1的外排实验的痕迹。箭头表示加入氯化钾校准脉冲，脂质体，缬氨霉素和β-OG的的次。虚线指示在不同阶段的ΔV的值。 （B）中的V（t）的轨迹被使用公式5，利用公式归6和流出时间当然是拟合等式7（红色虚线）转化成氯（吨）。 （C）的从脂蛋白体在0.2微克/毫克的P / L（黑）再生与WT CLC-EC1或在5微克/毫克的P / L（灰色）归一化流出的时间进程。虚线s为流出时间课程最适合于等式7。
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Discussion
我们已经描述了详细的协议来测量Cl -的运输由纯化的阴离子选择性通道或转运蛋白重构于脂质体介导的。所使用的例子是原核H + / Cl -的换热器CLC-EC1。然而，该方法可以容易地适合于研究通过配体12,13,15，11,12的电压，或者通过更换银运动不同的阴离子选择性15,16门控通道：与一种适合于所考虑的离子氯化银电极。电极选择性离子比其它氯- ，如H +，I -和F - ，是市售的。
的一些关键步骤和假设的讨论随之而来。
泊松稀释假设的限制
幺率（公式7-9）的推导只适用于泊松稀释政权，当大多数脂质体续AIN只有一个活动的蛋白质，使得具有在给定的囊泡多个拷贝的可能性低，囊泡群体的宏观流出时间常数以及由含有单一蛋白的脂质体的近似。实际上，氯的比较-流出时间当然是由脂质体在低温（黑，0.2微克/毫克）和高P / L（灰色，5微克/毫克）再生与CLC-EC1介导的（ 图3C）显示，在后者的情况下的流出动力学变得更快和f 0减小，这表明总脂质体的一个较小的部分含有0蛋白质。氯的总量-包含两个囊泡样品中是可比较的，〜0.7和〜0.55微摩尔分别表明这两个样品中的泡囊的总内部容积是相似和该蛋白质的重组的量不影响的大小囊泡。装修的高P / L流出时间当然等式7产生τ值 ;（5微克/毫克）= 8.8秒，和f 0（5微克/毫克）= 0.06，这表明只有〜6％的囊泡不含活性CLC-EC1二聚体在对比中发现的〜31％时，P / L的= 0.2微克/毫克。因此，单一的周转率在高P / L的估计是γ〜450 Cl -的秒-1，近6倍，比公布的数据8,14的低P / L获得一个低。因此，从重组的脂质体在高P流出时间课程分析/ L的会低估重组蛋白的单一的运输速度。因此，为了准确地确定一个新的蛋白质是具有关键的重要性，以精确地确定蛋白质重构的量的单一传输速率和低的P / L的工作，在一个泊松稀释制度。这是理想的通过确定一个完整的蛋白质滴定分析，以确定最佳的政权工作在实现。
活性复合物的质量的测定
帐篷“>上述的分析假定的活性复合物的化学计量是已知的，所述重组蛋白是完全有活性的，然而，对于新制剂这些量可能是未知的先验 。在这种情况下，可以直接确定这些参数通过测量的f 0的在不同的蛋白质与脂质的比例
其中，p是所述蛋白的密度， 
，ρ是每脂质量的脂质体的数量，N A是阿伏伽德罗数，M·P是功能信道复合体的质量和φ是活性的蛋白质的级分。通过拟合试验确定f 0的的在不同的蛋白质与脂质的比例是POSsible确定P 0，因此M·P和φ。
脂质体的有限分数为难治性掺入
酉传输速率的推导假设在高的P / L的所有脂质体将含有至少一种活性转运蛋白。然而，在某些情况下，这已经被发现不是这样的情况：在高的P /脂质体L的一个显著馏分仍然难治一些蛋白质11-13,17重构。虽然这种现象的起源不明确可以想象的是更大的蛋白可能被排除在囊泡具有较小半径因而减少脂质体的数量。
在这种情况下，等式10需要被修改为： 
其中θ是脂质体难治protei的分数ñ结合。重要的是，ρ和φ也受到了重组的方法，因为不同的程序将在脂质体重组和形成具有不同的回收率为脂质和蛋白质。假定100％的产率为将导致一个错误估计γ的。因此，为了获得单一周转/电导的精确定量给实验确定重构8,11中的脂质和蛋白质丧失的馏分是重要的。
在重组蛋白的方向
一种在分析过程中所作的假设的是，所有的重新构成的蛋白质在功能上等同。然而，许多渠道和运输都首选交通工具的方向，这种现象称为整改。此功能不对称性可能会导致离职率的估计误差。此外，重组蛋白的取向是先验 +梯度，用于通道或转运是配体或电压依赖性。
上紧的脂质体的形成的考虑
其中允许使用澳关键因素˚F此处所描述的流出测定是紧的脂质体的形成。要考虑到为此三个重要的变量是洗涤剂的用于溶解的蛋白，所述洗涤剂除去策略和脂质体的脂质组合物的选择的选择。在这里介绍的协议，CLC-EC1溶解于癸吡喃麦芽糖苷（DM），具有很高的临界胶束浓度（CMC）值，因此容易除去洗涤剂。然而，各种合成的和天然存在的清净剂的已经用于纯化随后重新溶解在紧脂质体上的囊泡的密封性不影响蛋白质。这些去污剂有广泛的CMC的，高达毫摩尔（如DM或毛地黄皂苷）和低至微摩尔（如十二烷基麦芽糖苷（DDM）或dioctylpropane双吡喃麦芽糖苷（DMNG））。然而要注意，该脂质用于形成脂质体所使用的CHAPS溶解，或另一种柔性洗涤剂是很重要的，因此，由蛋白质和脂类的混合物得到的混合胶束可能具有不同于母体洗涤剂的不同化学 - 物理性质。因此，有可能在某些情况下，残留的洗涤剂除去可能不稳定，导致更明显泄漏的脂质体。为了解决这个问题，建议研究替代清洁剂去除策略，如biobeads 12,13，离心柱15或凝胶过滤18。最后，该囊泡的脂质组合物作为特定的混合物可能是泄漏到在一定条件下，不同的离子的重要参数。例如，脂质体从大肠杆菌形成大肠杆菌极性脂质提取物是紧到CL -在酸性pH下的却逐渐变得多个漏随着pH增加了从一个3形成19或脂质体：1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰-乙醇胺的1:1混合物（POPE）和1-棕榈酰酰-2-油酰磷脂酰甘油（POPG）显示低得多的渗透性的H +比那些来自大肠杆菌形成大肠杆菌极性脂质提取20。要注意然而，该囊泡的脂质组合物也可能会影响重组蛋白13,21,22的活性是重要的。因此，为了精确地确定在每种条件下制备的无蛋白囊泡的属性，然后以评估如何影响重组蛋白的性质是很重要的。
泛化到非CLC型通道和运输
流出测定中，如这里描述的，可直接用于确定任何C1的单分子特性- -选择性通道或转运，并且例如已被用于表征钙激活C1的属性-声道TMEM16A 12 。我们现在讨论如何适应外排法，调查转运或陈荫罴的属性ELS不在Cl -的选择性和/或具有单一传输速率是显著不同于CLC-EC1的〜10 3离子秒-1。
最简单的情况是，所研究的蛋白质是阴离子选择性。在这种情况下，唯一的必要的调整是取代的Ag：用适当的选择性市售氯化银电极，作为被用于F进行- -选择性Flucs和社区学习16,23,24或I -可渗透的渠道，例如CFTR 15 。如果，在另一方面，该重组蛋白质是选择性的阳离子，离子载体比缬氨霉素等必须被用于发起流出。定验证C1的稀缺-离子载体的有用替代是一个H +的离子载体，例如羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）。在这种情况下，以确保通过增加缓冲器的囊内pH值保持恒定，例如是重要荷兰国际集团的内部溶液的量。另一种策略是通过重组通道或转运通过使用质子作为抗衡并使用pH计25或比例PH敏感探针26监测的H +输送到后续阳离子流出。然而，这些测量的间接性质使得重构的蛋白难以的输运性质的定量。最后，电极选择性为一些阳离子存在的和可商购。第三种情况是，所研究的蛋白质是可渗透既阴离子和阳离子，例如一个不良选择性信道13或阳离子/ Cl -的转运。在此情况下，重构的脂质体不保持在溶液交换过程在KCl梯度（步骤5.4-5.5），以使它们失去盐含量。因此，在这种情况下，所有的动力学信息将丢失。然而，含有至少一种活性PROT脂质体的级分内容（步骤6.8） - EIN中，f 0，仍然可以通过加入洗涤剂，并测量残余被困氯确定。这允许该蛋白质的分子质量通过进行蛋白质滴定并使用等式10确定。
另一个方面考虑这样的可能性，即重构的蛋白的单一传输速率的数量级，从该CLC-EC1的不同的顺序。例如，大多数转运有1-10秒-1，比CLC-EC1幅度低2-3个数量级的周转率，而在10 6 -10 7秒-1，3-4,000倍比CLC更快最通道进行离子-ec1。对于慢转运C1的速率-从无蛋白质的脂质体的泄漏可以成为限制，因为在流出过程随着蛋白质的运输速度降低其相对权重。在我们的经验泄漏率制剂之间有所变化，并且通常在一个顺序几离子秒-1。因此，利用迟缓转运工作时最好是制备无蛋白质的脂质体并排于每个重构精确地测量对应于每个批次囊泡的泄漏。流出实验已经成功地用于确定慢转运与流动率周围1-10离子秒-1，诸如蓝藻CLC 27的单一速度。当重组蛋白具有高的电导率，例如离子通道发生相反的情况。在这种情况下，外排动力学太快待解决的混合时间（〜1-2秒）和记录电极成为限速的固有响应时间。在这种情况下，动力学信息丢失，但活性复合物的质量仍然可以判定24。值得注意的是，其他方法，如平面脂双层的记录或膜片钳脂质体更适合研究纯化的离子通道，因为这些德chniques直接提供高时间分辨率的单分子的信息。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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