एक Proteoliposome आधारित तपका परख सीएल के एकल अणु गुण निर्धारित करने के लिए Published: April 20, 2015 doi: 10.3791/52369

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Daniel Basilio¹, Alessio Accardi^1,2,3

¹Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, ²Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, ³Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

Introduction

पिछले दो overexpress और झिल्ली परिवहन प्रोटीन को शुद्ध करने की क्षमता में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है दशकों में: आयन चैनल, प्राथमिक और माध्यमिक ट्रांसपोर्टरों अब नियमित heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम के रूप में अच्छी तरह से प्राकृतिक स्रोतों से शुद्ध कर रहे हैं। इन प्रोटीनों की स्थिरता, अभिव्यक्ति की निगरानी में सुधार लाने और निकासी की सुविधा और बढ़ाने के लिए नए तरीकों को लगातार ^1-5 से विकसित किए जा रहे हैं। इन तकनीकी सफलताओं बारी में, उनके कार्य के संरचनात्मक ठिकानों के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया है, जो झिल्ली प्रोटीन पर परमाणु स्तर के संरचनात्मक जानकारी के विस्फोट को ट्रिगर में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इसके विपरीत, हमारी क्षमता कुछ मामलों में उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी इस प्रकार मात्रात्मक संरचना के आधार पर भविष्यवाणियों का परीक्षण करने की हमारी क्षमता सीमित, गुणात्मक कार्यात्मक डेटा के साथ है, इसलिए है कि एक ही दर पर वृद्धि नहीं था शुद्ध प्रोटीन के कार्यात्मक संपत्तियों की जांच करने के लिए। इसलिए, शहरीमात्रात्मक और generalizable कार्यात्मक assays के टी झिल्ली प्रोटीन समारोह के यंत्रवत आधार की व्याख्या की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।

चैनलों और ट्रांसपोर्टरों ^- यहाँ हम मात्रात्मक शुद्ध और पुनर्गठन सीएल की कुंजी कार्यात्मक गुण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक तपका परख का वर्णन है। परख सिद्धांतों एक परिवहन प्रणालियों की विविधता है, साथ ही गैर आयन परिवहन प्रोटीन के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। चैनल / एक बड़े सीएल की उपस्थिति में ट्रांसपोर्टरों ^{- -} liposomes शुद्ध सीएल के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं ढाल (चित्रा 1 ए, बी)। CL ^- तपका हमारे मामले में, काउंटर आयन प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए एक ionophore के अलावा द्वारा शुरू की है ⁺ K ionophore valinomycin, सी.एल. द्वारा स्थापित वोल्टेज अलग धकेलना ^- जो ढाल और कश्मीर के संतुलन क्षमता के लिए प्रारंभिक झिल्ली क्षमता सेट ^{+ 6,7।} टी के बिनायह एक transmembrane क्षमता की पीढ़ी से रोका जाता है के रूप में तपका होता है, ^- वह कोई महत्वपूर्ण शुद्ध सीएल ionophore। ^- तपका, और एफ _0, एक सक्रिय प्रोटीन युक्त नहीं liposomes के अंश τ, सी.एल. के निरंतर समय: डेटा मात्रात्मक दो मध्यम श्रेणी मानकों (चित्रा 1C) द्वारा वर्णित है। Τ और एफ ₀ एकात्मक सीएल से ^- परिवहन दर, सक्रिय प्रोटीन के अंश और सक्रिय परिसर के आणविक द्रव्यमान ^आठ प्राप्त किया जा सकता है। ज्ञात संरचना और समारोह की एक्सचेंजर ^- तकनीक सीएलसी-EC1, एक अच्छी तरह से विशेषता सीएलसी प्रकार एच ⁺ / सीएल के साथ पुनर्गठन proteoliposomes प्रयोग कर के सचित्र है। यह परख आसानी जिसका गतिविधि वोल्टेज और / या ligands की उपस्थिति पर निर्भर करता है अलग आयनिक चयनात्मकता के साथ या चैनल या ट्रांसपोर्टरों को सामान्यीकृत है। इसके अलावा, इस परख छोटे अणुओं सीधे पुनर्गठन प्रोटीन को प्रभावित निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है,इन यौगिकों और कैसे झिल्ली रचना या लिपिड संशोधित अभिकर्मकों पुनर्गठन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के कार्य को प्रभावित का प्रभाव quantitate करने के लिए।

Protocol

1. लिपिड तैयारी

1. एक स्पष्ट ग्लास ट्यूब में वांछित राशि लिपिड विभाज्य। तुम्हे देखना. कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने, लेकिन सबसे अधिक लिपिड रचनाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है। लिपिड पाउडर के रूप में कर रहे हैं, 20 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए क्लोरोफॉर्म में उन्हें resuspend। सभी विलायक सुखाया गया है जब तक एन ₂ गैस के तहत आरटी पर लिपिड सूखी।
2. पैंटेन में लिपिड Resuspend और क्लोरोफॉर्म के बचे हुए निशान को दूर करने के लिए फिर से गैस एन ₂ की एक सतत स्ट्रीम यह सूखी। सूखी सभी विलायक सुखाया गया है जब तक। सुखाने जबकि लिपिड तल पर एक गठन एक घने द्रव्यमान के बजाय ट्यूब के तीसरे तल को कवर करने के लिए एक समान फिल्म में वितरित किया जाता है, जिससे कि धीरे ट्यूब बारी बारी से।
3. पुनर्गठन बफर युक्त डिटर्जेंट जोड़ें (300 मिमी KCl, 50 मिमी साइट्रिक एसिड, 25 मिमी कश्मीर ₂ HPO _4, पीएच 4.5, 35 मिमी CHAPS) लिपिड भंग करने के लिए। प्रोटीन लोग के खराब सहिष्णु है तो इस चरण के लिए अन्य हल्के डिटर्जेंट का प्रयोग करें।
4. Resuspenएक पानी के स्नान sonicator का उपयोग कर स्पष्टता के लिए लिपिड होगी। छोटी (30 सेकंड-एक मिनट) के साथ संक्षेप में (30 सेकंड-एक मिनट) दालों अधिकतम शक्ति पर पानी sonicator स्नान के केन्द्र में ट्यूब विसर्जित कर रुक जाता है। समाधान स्पष्ट हो जाना चाहिए।
   नोट: स्पष्टता के अंतिम डिग्री हासिल प्रयुक्त विशिष्ट लिपिड संरचना पर निर्भर करता है। यहां तक ​​कि नाममात्र समान लिपिड के बीच इस कदम में कुछ बैच करने वाली बैच विभिन्नता, यह भी संभव है। अवशिष्ट धुन्ध centrifugation द्वारा हटाया जा सकता है जो निलंबन में बड़े कण ने प्रकाश बिखरने की वजह से है।
5. 20-60 मिनट के लिए आरटी पर resuspended लिपिड सेते हैं।

2. Proteoliposome गठन

नोट: कई रणनीतियों liposomes में डिटर्जेंट solubilized प्रोटीन सम्मिलित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। सीएलसी-EC1 के लिए डायलिसिस अच्छी तरह से काम करता है और इसलिए पसंद ^6,9,10 की विधि है।

1. को शुद्ध प्रोटीन जोड़ें वांछित प्रोटीन-टू-लिपिड माइक्रोग्राम प्रति ओ में व्यक्त (पी / एल) अनुपात ( एफ प्रोटीन / मिलीग्राम लिपिड)। पी / एल अनुपात की पसंद प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है।
   1. लक्ष्य है, ब्याज की प्रोटीन की गतिविधि का आकलन उच्च पी में पुनर्गठित करने के लिए है, तो प्रत्येक liposome प्रोटीन की कई प्रतियां शामिल हैं के रूप में / ल, संकेत अधिकतम करने के लिए। प्रत्येक पुटिका औसत एक प्रोटीन पर होता है तो यह है कि गतिविधि और / या प्रोटीन की एकात्मक परिवहन दर यों, कम पी / ल पर एक पॉसों कमजोर पड़ने शासन में पुनर्गठित। प्रत्येक शासन उपयोग करने के लिए जब एक और अधिक गहराई से विश्लेषण के लिए चरण 7 और चर्चा देखें।
2. विभिन्न regimens के लिए इष्टतम पी / एल मूल्यों का निर्धारण करने के लिए, प्रोटीन एकाग्रता ^8,11-13 के एक समारोह के रूप में गतिविधि का एक पूरा अनुमापन प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, सक्रिय इकाई की आणविक वजन (मेगावाट, केडीए में व्यक्त) जिसके लिए किसी भी प्रोटीन के लिए निम्नलिखित पी / एल मूल्यों प्रारंभिक guesstimates के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जाना जाता है:
   पीजी "/>
   
3. एक पूर्व गीला डायलिसिस ट्यूब या एक कैसेट में प्रोटीन और लिपिड मिश्रण लोड करें। 500-1,000x लिपिड पुनर्गठन बफर की मात्रा युक्त एक बीकर में डायलिसिस डिवाइस जगह (यानी, लिपिड मेजबान के 1 मिलीलीटर के लिए एक एल बफर) कोमल सरगर्मी के तहत।
   1. बदले बफर अंतराल> 3 घंटा में 3-4 बार। हर समाधान परिवर्तन पर, कैसेट / ट्यूबिंग और आसुत जल के साथ बीकर धोने और ताजा पुनर्गठन बफर के साथ बीकर भरें। समाधान बदलाव के लिए 1-2 हे / एन अंतराल में शामिल। समाधान परिवर्तन की सही संख्या और अवधि का इस्तेमाल किया सटीक लिपिड और डिटर्जेंट पर निर्भर करता है।
4. अंतिम चरण के पूरा होने पर, डायलिसिस पोत से liposomes को दूर ट्यूबों में उन्हें विभाज्य और फ्लैश -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल एन ₂ या फ्रीज में उन्हें फ्रीज।

3. रिकॉर्डिंग सेट-अप

<पी वर्ग = "jove_content"> नोट: रिकॉर्डिंग सेट अप (2A चित्रा) के दो कक्षों (फ्लैट तली सिलेंडर, ~ 3-4 मिलीलीटर मात्रा), एक सीएल के होते हैं ^- इलेक्ट्रोड, एक एनालॉग के साथ एक पीएच मीटर (नीचे देखें) डिजिटल बिजली के उत्पादन, एक अंकरूपक, और एक उचित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर या।

1. पीएच मीटर करने के लिए बिजली, कंप्यूटर से जुड़ा है, जो digitizer के लिए पीएच मीटर का उत्पादन ^- सीएल कनेक्ट करें। एक कक्ष में संदर्भ इलेक्ट्रोड और अन्य (चित्रा 2B) में recoding तार रखें।
   नोट: ΔV _काल सकारात्मक है (चरण 6.4 और 7.2 देखें) अगर तारों के polarity सही है।
2. रिकॉर्डिंग कक्ष (चित्रा 1 बी) में एक हलचल पट्टी के साथ एक हलचल प्लेट पर कक्षों रखें। हलचल बार इलेक्ट्रोड स्पर्श नहीं करता है सुनिश्चित करें।
3. एक अगर पुल (चित्रा 2 बी) (100 मिमी KCl और 2% agarose) का उपयोग कर कक्षों से कनेक्ट करें। 100 मिमी KCl में अग्रवाल पुलों स्टोर।

   सीएल 4. तैयारी ^- इलेक्ट्रोड

   1. एक पुराने और -possibly- गैर कामकाज पीएच इलेक्ट्रोड ले लो। पूरी तरह से चांदी के तारों प्रकट करने के लिए गिलास कोटिंग तोड़ो।
   2. ध्यान से एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर चांदी के तारों से कोटिंग हटा दें। एच ₂ हे और EtOH की प्रचुर मात्रा का उपयोग तारों को साफ करें।
   3. तारों तक FeCl ₃ (या ब्लीच) के एक संतृप्त समाधान में रखें AgCl के एक समान अंधेरे कोट के साथ कवर कर रहे हैं।

   Unilamellar vesicles 5. तैयारी

   1. प्रयोगों से पहले की रात, के लिए बाहरी बफर के 15 मिलीलीटर (1 मिमी KCl, अतः _4, 25 मिमी साइट्रिक एसिड, पीएच 4.5 150 मिमी कश्मीर ₂₎ कोमल झटकों के साथ (हलचल नहीं है) में Sephadex जी-50 मोतियों की 1 ग्राम प्रफुल्लित उपयोग करने से पहले आरटी पर कम से कम 3 घंटा। प्रत्येक प्रयोग में सूजन मोतियों की ~ 3 मिलीलीटर की आवश्यकता है। ज्यादा से ज्यादा कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सूजन मोती रखें।
   2. Liposomes आरटी पर विगलन कर रहे हैं, प्रत्येक स्तंभ ~ 3 मीटर में डालनासूजन जी-50 मोतियों की एल। आरटी पर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से उन्हें सूखी; यह आम तौर पर 1-2 मिनट लगते हैं।
   3. एक 0.4 मी Teflon कटऑफ का उपयोग कर एक मिनी Extruder के माध्यम से proteoliposomes 11 बार extruding द्वारा unilamellar पुटिकाओं तैयार करें।
   4. एक प्लास्टिक दौर तली ट्यूब में स्तंभ रखें। अतिरिक्त समाधान निकालने के लिए कॉलम स्पिन। एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 1400 XG पर 20-30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र।
   5. एक 13 x 100 मिमी ग्लास ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से, जगह स्तंभ त्यागें और स्तंभ के लिए extruded vesicles के 100 μl जोड़ें। एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 500 XG पर 1 मिनट के लिए स्तंभ स्पिन।
   6. कदम 6.5 में रिकॉर्डिंग कक्ष में जोड़ दिया जाएगा कि प्रवाह के माध्यम से ~ 200 μl ले लीजिए।

   6. तपका मापन

   1. संदर्भ (भूमि) के चैम्बर में 100 मिमी KCl के 2 मिलीलीटर और बाहरी बफर के 1.8 मिलीलीटर प्लेस (1 मिमी KCl, 150 मिमी कश्मीर ₂ अतः _4, 25 मिमी साइट्रिक एसिड, पीएच 4.5) रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए। आंतरिक बीच मामूली आसमाटिक असंतुलनऔर बाहरी समाधान को प्रभावित नहीं करता
   2. अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू करो। इसमें कुछ समय लग सकता है, आधारभूत संतुलित करना।
   3. संकेत एक स्थिर आधारभूत (liposomes तैयार कर रहे हैं और स्तंभों सूखा) में पहुँचता है, (चित्रा 3 ए) रिकॉर्डिंग शुरू।
   4. प्रणाली (2A चित्रा) जांच करने के लिए एक 10 मिमी KCl समाधान के 15 μl जोड़ें।
   5. Liposomes जोड़ें। Proteoliposomes (चित्रा 3A) से ^- एक छोटे से कूद कारण बाहरी सीएल का अधूरा हटाने के लिए दृश्यमान हो सकता है। आधारभूत स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें।
   6. Valinomycin जोड़ें (1 मिलीग्राम EtOH में / मिलीलीटर में 1 μl) तपका (चित्रा 3A) आरंभ करने के लिए।
   7. तपका अपने समय बेशक यह पठार तक (चित्रा 3A) चलाते हैं।
   8. सभी liposomes (चित्रा 3A) को भंग करने के लिए बाहरी बफर में तैयार 1.5 एम β-octylglucoside (β-ओग) के 40 μl जोड़ें। रिकॉर्डिंग खत्म होता है।

   7. डेटा एकnalysis

   1. एक ASCII या पाठ स्वरूप में से ट्रेस फ़ाइल निर्यात और यह पसंद का विश्लेषण कार्यक्रम के लिए आयात करते हैं।
   2. निम्नलिखित बातों (चित्रा 3 ए) में वोल्टेज उपाय:
      रिकॉर्डिंग की शुरुआत में (वि _0);
      औजार नाड़ी (वी _काल) के अलावा के बाद;
      Liposomes (वी _{लाइपो)} के अलावा के बाद;
      तपका (वी _पंख) के अंत में;
      डिटर्जेंट (वी _{मुन्ना)} के अलावा के बाद;
      बेसलाइन voltages के लिए इतना है कि वी ₀ = 0।
   3. की प्रयोगात्मक मूल्य निर्धारित करने के लिए नेर्न्स्ट का तख्ता समीकरण का प्रयोग करें नापने के जरिए
      
      कहां खंड _काल μl में अंशांकन नाड़ी की मात्रा प्रयोग में व्यक्त की शुरुआत में चैम्बर मात्रा, 1800 है1 ^-; अंशांकन नाड़ी की और मिमी में बाहरी बफर की सांद्रता और ΔV _{सीएएल} अंशांकन नाड़ी के बाद मापा एम वी में कूद है L, [सीएल] _{सीएएल / में} CL रहे हैं।
      नोट: α की यह अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प तीन उद्देश्यों में कार्य करता है: यह सिस्टम ठीक से जवाब है कि यह सुनिश्चित करता है, प्रयोगों के बीच साधन की प्रतिक्रिया की स्थिरता का एक उपाय प्रदान करता है और साथ ही कोई गलती समाधान बनाने में किए गए थे कि जाँच करने के लिए।
   4. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक कदम के बाद सीएल सांद्रता की गणना:
      
      
      
      कारक 3/400 2000 μl अंतिम मात्रा में 15 μl अंशांकन नाड़ी के कमजोर पड़ने से आता है।
   5. Calculहर कदम, _फिन ΔCl _{लाइपो / / मुन्ना} पर [सीएल] में परिवर्तन खा _{लिया।}
   6. साथ सीएल (टी) में वी (टी) कन्वर्ट
      
      सीधे महत्वपूर्ण बिंदुओं पर [सीएल] मूल्यों का निर्धारण और एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में मूल्यों की गणना करने के लिए उन्हें तुलना करें।
   7. ट्रेस मानक के अनुसार सीएल _{रिलायंस एनर्जी} ^{लाइपो} = 0 और सीएल _{रिलायंस एनर्जी} ^{मुन्ना} = 1 इतना है कि
      
   8. निम्न समीकरण को तपका समय बेशक फिट:
      
      प्रयोगात्मक सीएल मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है कि रिसाव ^{- -} एल सीएल की दर कहां है उसी स्थिति और τ में तैयार प्रोटीन से मुक्त liposomes से तपका प्रक्रिया के समय स्थिर है।
   9. वी, प्रारंभिक वेग की गणना:
      कहां ΔCl _फिन millimolar में व्यक्त किया और वी μl में चैम्बर की मात्रा है।
   10. परिवहन दर / प्रवाहकत्त्व की गणना
       
       पी पी / एल कहां है, मेगावाट सक्रिय परिसर के आणविक वजन केडीए में व्यक्त किया जाता है

Representative Results

एक्सचेंजर, liposomes में पुनर्गठन ^- शुद्ध सीएलसी-EC1, एक प्रोकार्योटिक सीएलसी प्रकार एच ⁺ / सीएल द्वारा मध्यस्थता परिवहन ^- हम एक विस्तृत और मजबूत सीएल को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रयोग का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 3 में दिखाया गया है शुद्ध सीएलसी-EC1 और उच्च आंतरिक सीएल को रोकने के साथ पुनर्गठन Proteoliposomes ^-। कम सीएल युक्त स्नान समाधान में डूब रहे हैं ^-। इन शर्तों के शुद्ध सीएल तहत ^- तपका liposome (चित्रा 3A) में सकारात्मक चार्ज के buildup से रोका जाता है। तपका (3B चित्रा) ^- Valinomycin के अलावा कश्मीर ⁺ झिल्ली इस प्रकार विद्युत क्षमता shunting और सीएल की शुरुआत भर में स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है। प्रवाह समय बेशक एक सीएल का उपयोग करते हुए नजर रखी है ^- -selective इलेक्ट्रोड और सीएल की कुल राशि ^- पुटिकाओं में निहित सीधे डिटर्जेंट का प्रयोग कर उन्हें solubilizing द्वारा मापा जाता है। इन सेथोक प्रयोगों यह इस तरह के कारोबार दर, सक्रिय प्रोटीन का सक्रिय जटिल और अंश के stoichiometry के रूप में एकल पुनर्गठन प्रोटीन, के गुणों को निर्धारित करने के लिए संभव है। समीकरण 7-9 का उपयोग करना है कि ~ एक तपका समय बेशक फिट हैं और हम τ (0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /) = 41 सेकंड और एफ ₀ (0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /) = 0.31, यह दर्शाता है कि लगता है सीएलसी-EC1 की एकात्मक परिवहन दर का अनुमान लगाने के लिए liposomes की / 3 0 सक्रिय प्रोटीन होते हैं। सेकंड ^-1, प्रकाशित मूल्यों ^8,14 के साथ अच्छे समझौते में ^- इन मूल्यों से हम एकात्मक परिवहन दर 2500 ~ γ सीएल है कि गणना।

चित्रा 1: CL ^- तपका परख (ए - बी) सीएल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ^- प्रोटीन से मुक्त liposomes (ए) या ​​सीएलसी-EC1 के लिए -efflux परख।पुनर्गठन पुटिकाओं (बी)। (सी) ionophore-संचालित सीएल के नकली समय पाठ्यक्रम ^- proteoliposomes (काला) या प्रोटीन से मुक्त liposomes (ग्रे धराशायी लाइन) से तपका। तपका ionophore (*) के अलावा द्वारा शुरू की और (^) liposomes भंग करने के लिए डिटर्जेंट के अलावा द्वारा समाप्त होता है। लाल रेखा एक घातीय सीएल के निरंतर समय निर्धारित करने के लिए फिट, τ है, धराशायी ^-। 0 सक्रिय प्रोटीन युक्त liposomes के अंश सीएलसी-EC1 और एफ ₀ के कम से कम एक सक्रिय प्रतिलिपि युक्त liposomes से तपका है एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

चित्रा 2: सेट अप रिकॉर्डिंग (ए) रिकॉर्डिंग की स्थापना की।। (बी) के कक्षों के बंद हुआ। <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: नमूना का पता लगाने और विश्लेषण 0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पी / एल पर गुम्मट सीएलसी-EC1 साथ पुनर्गठन proteoliposomes से तपका प्रयोगों की (ए) विशिष्ट वी (टी) निशान।। तीर KCl कैलिब्रेशन नाड़ी, Liposomes, valinomycin और β-ओग के अलावा के समय से संकेत मिलता है। धराशायी लाइनों विभिन्न चरणों में ΔV मूल्यों का संकेत मिलता है। (बी) वी (टी) का पता लगाने के समीकरण 5, सामान्यीकृत का उपयोग कर समीकरण 6 और पाठ्यक्रम 7 समीकरण के लिए फिट है तपका समय (लाल धराशायी लाइन) का उपयोग सीएल (टी) में बदल जाता है। (सी) 0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पी / एल (काला) पर गुम्मट सीएलसी-EC1 साथ पुनर्गठन proteoliposomes से या 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पी / एल (ग्रे) पर सामान्यीकृत तपका समय पाठ्यक्रमों। धराशायी रेखा7 समीकरण को तपका समय पाठ्यक्रमों का सबसे अच्छा फिट बैठता है।

Discussion

शुद्ध आयनों चयनात्मक चैनलों या liposomes में पुनर्गठित ट्रांसपोर्टरों द्वारा मध्यस्थता परिवहन ^- हम एक विस्तृत सीएल को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। सीएलसी-EC1 एक्सचेंजर ^- इस्तेमाल किया उदाहरण प्रोकार्योटिक एच ⁺ / सीएल था। विचाराधीन आयन के लिए उपयुक्त एक साथ AgCl इलेक्ट्रोड: हालांकि, कार्यप्रणाली आसानी से ligands के ^12,13,15, वोल्टेज ^11,12, या एजी की जगह से अलग ऋणात्मक चयनात्मकता ^15,16 खेल से gated चैनलों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इलेक्ट्रोड सीएल अलावा अन्य आयनों के लिए चुनिंदा ^- ऐसे एच ⁺ के रूप में, मैं ^- और एफ ^-, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

महत्वपूर्ण कदम और मान्यताओं में से कुछ की एक चर्चा का पालन करें।

पॉसों कमजोर पड़ने धारणा की सीमाएं

एकात्मक दर (समीकरण 7-9) की व्युत्पत्ति केवल एक पॉसों कमजोर पड़ने शासन, जब सबसे liposomes शेष भाग में मान्य हैऐन केवल एक सक्रिय प्रोटीन एक दिया पुटिका में कई प्रतियां होने की संभावना कम है और पुटिका आबादी के macroscopic तपका समय लगातार अच्छी तरह से एक भी प्रोटीन युक्त liposomes की है कि द्वारा approximated है कि इतनी। दरअसल, सीएल की तुलना ^- कम (काला, 0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /) और उच्च पी / एल (ग्रे, 5 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीग्राम) में सीएलसी-EC1 साथ पुनर्गठन liposomes द्वारा मध्यस्थता तपका समय कोर्स (चित्रा -3 सी) से पता चलता है कि में उत्तरार्द्ध मामले तपका कैनेटीक्स कुल liposomes के एक छोटे अंश 0 प्रोटीन होता है यह दर्शाता है कि तेजी से और एफ ₀ घटने हो जाते हैं। सीएल की कुल राशि ^- दोनों पुटिका नमूनों में निहित दो नमूनों में vesicles की कुल आंतरिक संस्करणों के समान था कि और पुनर्गठन प्रोटीन की मात्रा के आकार को प्रभावित नहीं करता है, यह दर्शाता है क्रमशः ~ 0.7 और ~ 0.55 μmoles, तुलनीय था पुटिकाओं। 7 समीकरण को उच्च पी / एल तपका समय बेशक फिटिंग τ के मूल्यों का उत्पादन ; Vesicles के केवल ~ 6% पाया ~ 31% के विपरीत कोई सक्रिय सीएलसी-EC1 dimers होते हैं यह दर्शाता है कि (5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /) = 8.8 सेकंड और एफ ₀ (5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /) = 0.06, जब पी / एल = / मिलीग्राम 0.2 माइक्रोग्राम प्रति। इस प्रकार, उच्च पी / एल पर एकात्मक कारोबार दर का अनुमान 450 ~ γ सीएल है ^- सेकंड ^-1, लगभग कम पी / एल पर प्राप्त की तुलना में एक और प्रकाशित डेटा ^8,14 के निचले 6 गुना। इसलिए, उच्च पी में पुनर्गठित liposomes से तपका समय पाठ्यक्रमों का विश्लेषण / ल पुनर्गठन प्रोटीन की एकात्मक परिवहन दर बहुत मूल्यवान समझना होगा। इस प्रकार, सही ढंग से ठीक पुनर्गठन प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए यह महत्वपूर्ण महत्व का है एक उपन्यास प्रोटीन की एकात्मक परिवहन दर निर्धारित करने के लिए और एक पॉसों कमजोर पड़ने के शासन में, कम पी / ल में काम करने के लिए। इस आदर्श रूप में काम करने के लिए इष्टतम शासन की पहचान करने के लिए एक पूर्ण प्रोटीन अनुमापन विश्लेषण का निर्धारण करके हासिल की है।

सक्रिय जटिल के द्रव्यमान का निर्धारण

तम्बू "> ऊपर वर्णित विश्लेषण सक्रिय जटिल के stoichiometry जाना जाता है और पुनर्गठन प्रोटीन पूरी तरह से सक्रिय है कि मानता है। बहरहाल, नए की तैयारी के लिए इन मात्रा एक प्राथमिकताओं नहीं जाना जा सकता है। इस मामले में यह सीधे इन मापदंडों का निर्धारण करने के लिए संभव है लिपिड अनुपात करने के लिए विभिन्न प्रोटीन में एफ ₀ की मापने के द्वारा

जहां पी प्रोटीन घनत्व है, , Ρ लिपिड की बड़े पैमाने पर प्रति liposomes की संख्या है, एन _ए एवोगेड्रो की संख्या एम _पी कार्यात्मक चैनल जटिल की बड़े पैमाने पर है और φ सक्रिय प्रोटीन का अंश है, है। लिपिड अनुपात करने के लिए विभिन्न प्रोटीन पर ₀ 'एस एफ प्रयोगात्मक निर्धारित फिटिंग द्वारा यह स्थिति हैपी ₀ निर्धारित करने के लिए असंभव है, और इसलिए एम _पी और φ।

Liposomes की एक परिमित अंश समावेश करने के लिए आग रोक है

एकात्मक परिवहन दर की व्युत्पत्ति उच्च पी पर / ल सभी liposomes कम से कम एक सक्रिय परिवहन प्रोटीन शामिल होंगे रखती है। हालांकि, कुछ मामलों में यह मामला नहीं पाया गया है: उच्च पी पर / liposomes के ल एक महत्वपूर्ण अंश कुछ प्रोटीन ^11-13,17 का पुनर्गठन करने के लिए आग रोक बनी हुई है। इस घटना के मूल स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, जबकि यह बड़ा प्रोटीन इस प्रकार उपलब्ध liposomes की संख्या को कम करने के लिए छोटे radiuses साथ पुटिकाओं से बाहर रखा जा सकता है कि बोधगम्य है।

इस मामले में समीकरण 10 को संशोधित करने की जरूरत है:

θ protei को आग रोक liposomes का अंश है, जहांएन समावेश। विभिन्न प्रक्रियाओं liposome पुनर्गठन और गठन के दौरान लिपिड और प्रोटीन के लिए अलग वसूलियां होगा के बाद से महत्वपूर्ण बात है, ρ और φ भी पुनर्गठन विधि से प्रभावित हैं। दोनों के लिए 100% उपज मानते हुए γ के गलत आकलन करने के लिए नेतृत्व करेंगे। इसलिए, यह प्रयोगात्मक पुनर्गठन ^8,11 दौरान लिपिड और प्रोटीन खो के अंश का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है एकात्मक कारोबार / प्रवाहकत्त्व के एक सटीक quantitation के प्राप्त करने के लिए।

पुनर्गठन प्रोटीन की अभिविन्यास

विश्लेषण के दौरान किए गए मान्यताओं में से एक सभी का पुनर्गठन प्रोटीन कार्यात्मक बराबर हो रहा है। हालांकि, कई चैनलों और ट्रांसपोर्टरों परिवहन के दिशा-निर्देश, सुधार के रूप में जाना जाता घटना को प्राथमिकता दी है। यह कार्यात्मक विषमता कारोबार दर में एक अनुमान त्रुटि हो सकती है। इसके अलावा, पुनर्गठन प्रोटीन के उन्मुखीकरण एक प्राथमिकताओं है + कार्यात्मक चुनिंदा ही पक्ष की यौगिक को सक्रिय करने के लिए या कश्मीर का उपयोग कर उपयुक्त मूल्यों के ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज की स्थापना द्वारा इसके माध्यम से एक ओरिएंटेशन में ही प्रोटीन को सक्रिय पक्षीय अवरोधकों का उपयोग करते हुए दो आबादी में से एक मुंह बंद या द्वारा द्वारा इस समस्या को नाकाम करने के लिए संभव है ligand- या वोल्टेज पर निर्भर कर रहे हैं कि चैनल या ट्रांसपोर्टरों के लिए ढ़ाल,।

तंग liposomes के गठन पर विचार

उपयोग ओ सक्रिय करने के महत्वपूर्ण कारकों में से एकयहाँ वर्णित तपका परख च तंग liposomes का गठन है। यह अंत करने के लिए विचार किया जा करने के लिए तीन महत्वपूर्ण चर प्रोटीन, डिटर्जेंट हटाने की रणनीति और liposomes के लिपिड रचना की पसंद solubilize करने के लिए इस्तेमाल डिटर्जेंट का चुनाव कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सीएलसी-EC1 decyl-Maltopyranoside (डीएम), इसलिए आसानी से निकाल दिया जाता है, जो एक उच्च महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) मूल्य के साथ एक डिटर्जेंट में solubilized है। हालांकि, कृत्रिम और प्राकृतिक रूप से उत्पन्न डिटर्जेंट की एक किस्म बाद में vesicles की तंगी पर कोई प्रभाव के साथ तंग liposomes में पुनर्गठन किया गया है कि प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये डिटर्जेंट millimolar के रूप में उच्च CMCs की एक विस्तृत श्रृंखला है, और (जैसे Dodecyl- Maltopyranoside (DDM) या dioctylpropane-बीआईएस maltopyranoside (DMNG) के रूप में) micromolar के रूप में के रूप में कम है (जैसे कि डीएम या Digitonin के रूप में)। यह लिपिड liposomes CHAPS का उपयोग कर solubilized, या किसी अन्य हल्के साबुन रहे हैं फार्म का उपयोग किया है, तथापि नोट करना महत्वपूर्ण हैहै, और इसलिए प्रोटीन और लिपिड के मिश्रण से उत्पन्न संकर मिसेलस माता पिता डिटर्जेंट के उन लोगों से अलग chemico-भौतिक गुण हो सकता है। इसलिए यह संभव है कि कुछ मामलों में अधिक स्पष्ट लीक करने के लिए अग्रणी liposomes को अस्थिर कर सकता है कि अवशिष्ट डिटर्जेंट हटाने। इस समस्या को नाकाम करने के लिए यह एक ऐसी biobeads ^12,13, स्पिन कॉलम ¹⁵ या जेल निस्पंदन ¹⁸ के रूप में वैकल्पिक डिटर्जेंट हटाने रणनीतियों, जांच करने के लिए सलाह दी जाती है। अंत में, vesicles के लिपिड रचना विशिष्ट मिश्रण निश्चित परिस्थितियों में अलग आयनों को टपका हुआ हो सकता है के रूप में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। उदाहरण के लिए, ई से गठित liposomes कोलाई ध्रुवीय लिपिड निकालने सीएल के लिए तंग कर रहे हैं ^- अम्लीय पीएच की, लेकिन पीएच 3 से गठित ¹⁹ या liposomes बढ़ जाती है के रूप में उत्तरोत्तर अधिक टपकाया बन: 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidyl-ethanolamine का एक मिश्रण (पोप) और एक-palmitoyl- 2-oleoyl phosphatidylglycerol (POPG) ई गठन से उन लोगों की तुलना एच ⁺ करने के लिए एक बहुत कम पारगम्यता प्रदर्शित कोलाई ध्रुवीय लिपिड ²⁰ निकाल सकते हैं। यह vesicles के लिपिड रचना भी पुनर्गठन प्रोटीन ^13,21,22 की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है कि हालांकि नोट करना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, यह ठीक हर हालत में तैयार प्रोटीन से मुक्त पुटिकाओं के गुणों को निर्धारित करने के लिए और फिर इस पुनर्गठन प्रोटीन के गुणों को प्रभावित करता है कि कैसे मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

गैर सीएलसी प्रकार चैनलों और ट्रांसपोर्टरों को सामान्यीकरण

यहाँ के रूप में वर्णित तपका परख, सीधे किसी भी क्लोरीन का एक अणु के गुण निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ^- -selective चैनल या ट्रांसपोर्टर, और उदाहरण के लिए सीए ^{2 +} -activated सीएल के गुणों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ^- TMEM16A ¹² चैनल । अब हम ट्रांसपोर्टरों या chann के गुणों की जांच करने के तपका परख अनुकूलित करने के लिए कैसे पर चर्चाचयनात्मक और / या सीएलसी-EC1 की ~ 10 ³ आयन सेकंड ^-1 से काफी अलग हैं कि एकात्मक परिवहन दर है ^- सीएल नहीं कर रहे हैं कि एल्स।

सरल मामले अध्ययन के तहत प्रोटीन आयनों चयनात्मक है। इस मामले में केवल आवश्यक समायोजन एजी को बदलने के लिए है: ^- -selective Flucs और CLCs ^16,23,24 या मैं ^- एफ के लिए किया गया था, के रूप में उपयुक्त चयनात्मकता के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एक साथ AgCl इलेक्ट्रोड ऐसे CFTR के रूप में ¹⁵ पारगम्य चैनलों । दूसरी तरफ, पुनर्गठन प्रोटीन फैटायनों के लिए चयनात्मक है, तो valinomycin के अलावा किसी अन्य ionophore तपका आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना है। पुष्टि सीएल की कमी को देखते हुए ^- ionophores एक उपयोगी विकल्प है ऐसे कार्बोनिल साइनाइड 4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) के रूप में एक एच ⁺ ionophore,। इस मामले में यह बफर में वृद्धि से intravesicular पीएच उदाहरण के लिए, निरंतर बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैआंतरिक समाधान की क्षमता रही है। एक वैकल्पिक रणनीति एक counterion के रूप में प्रोटॉन का उपयोग कर और एक पीएच मीटर ²⁵ या एक ratiometric पीएच के प्रति संवेदनशील जांच ^{में 26} का उपयोग करते हुए एच ⁺ परिवहन की निगरानी के द्वारा एक पुनर्गठन चैनल या ट्रांसपोर्टर के माध्यम से कटियन तपका पालन करने के लिए है। हालांकि, इन मापों के अप्रत्यक्ष प्रकृति मुश्किल पुनर्गठन प्रोटीन के परिवहन के गुणों की मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। अंत में, इलेक्ट्रोड फैटायनों मौजूद का एक नंबर के लिए चयनात्मक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। एक तीसरा परिदृश्य अध्ययन के तहत प्रोटीन, anions और फैटायनों दोनों के लिए पारगम्य है कि है, उदाहरण के लिए एक खराब चयनात्मक चैनल ¹³ या एक कटियन / CL ^- cotransporter। वे अपने नमक की मात्रा को खोने के लिए इतना है कि इस मामले में, पुनर्गठन liposomes (5.4-5.5 कदम) समाधान का आदान-प्रदान की प्रक्रिया के दौरान एक KCl ढाल बनाए रखने के लिए नहीं है। इसलिए इस मामले में सभी गतिज जानकारी खो दिया है। हालांकि, liposomes के अंश का कम से कम एक सक्रिय prot युक्तसामग्री (कदम 6.8) ^- Ein, ₀ एफ, अभी सीएल फंस अवशिष्ट डिटर्जेंट जोड़ने और मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यह एक प्रोटीन अनुमापन से बाहर ले जाने और समीकरण 10 का उपयोग करके प्रोटीन की आणविक द्रव्यमान का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है।

विचार करने के लिए एक और पहलू का पुनर्गठन प्रोटीन की एकात्मक परिवहन दर सीएलसी-EC1 के उस से अलग परिमाण के आदेश है कि संभावना है। उदाहरण के लिए, सबसे ट्रांसपोर्टरों, 1-10 सेकंड ^-1, सीएलसी-EC1 की तुलना में कम परिमाण के 2-3 आदेशों का कारोबार दर है, जबकि 10 ⁶ -10 ⁷ सेकंड ^-1, 3-4,000 में सबसे चैनलों आचरण आयनों गुना तेजी से सीएलसी से -ec1। धीमी गति से ट्रांसपोर्टरों सीएल की दर के लिए ^- प्रोटीन से मुक्त liposomes से रिसाव प्रोटीन के परिवहन दर घटने के रूप में तपका प्रक्रिया बढ़ जाती है में अपने रिश्तेदार वजन के रूप में, सीमित बन सकता है। हमारे अनुभव में रिसाव दर तैयारियों के बीच कुछ हद तक भिन्न होता है और एक के क्रम में आम तौर पर हैकुछ आयन सेकंड ^-1। धीमी गति से ट्रांसपोर्टरों के साथ काम करते हैं, इसलिए यह सही vesicles के प्रत्येक बैच के लिए इसी रिसाव को मापने के लिए प्रत्येक पुनर्गठन की ओर से प्रोटीन से मुक्त liposomes पक्ष तैयार करने के लिए सलाह दी जाती है। तपका परख सफलतापूर्वक इस तरह के एक cyanobacterial सीएलसी ²⁷ के रूप में कारोबार दरों के साथ धीमी गति से ट्रांसपोर्टरों के आसपास 1-10 आयन सेकंड ^-1, के एकात्मक दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। पुनर्गठन प्रोटीन उदाहरण एक आयन चैनल के लिए एक उच्च चालकता है जब बातचीत की स्थिति उत्पन्न होती है। इस मामले में तपका कैनेटीक्स मिश्रण समय (~ 1-2 सेकंड) और दर सीमित हो जाते हैं रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के आंतरिक प्रतिक्रिया समय के रूप में हल किया जा करने के लिए भी तेजी से कर रहे हैं। इस मामले में, गतिज जानकारी खो दिया है, लेकिन सक्रिय जटिल की बड़े पैमाने पर अभी भी ²⁴ से निर्धारित किया जा सकता है। ऐसे तलीय लिपिड bilayer रिकॉर्डिंग या पैच clamping liposomes के रूप में अन्य तरीकों, इन ते के रूप में शुद्ध आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं कि यह ध्यान देने योग्य हैसीधे उच्च समय संकल्प के साथ एक अणु में जानकारी प्रदान chniques।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Benchtop	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter			These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe			Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger	DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software	DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass	Kimble Chase	73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids Inc.	610000
Computer