Introduction
最後の二つの過剰発現および膜輸送タンパク質を精製する能力が劇的に増加している数十年：イオンチャネル、プライマリとセカンダリのトランスポーターは、現在日常的に異種発現系、ならびに天然の供給源から精製される。これらのタンパク質の安定性を、発現をモニタリング改善し、抽出を容易にし、強化するための新しいアプローチが常に1-5開発されている。これらの技術革新は、順番に、その機能の構造的な拠点の我々の理解を高め、膜タンパク質上の原子レベルの構造情報の爆発をトリガーに尽力している。対照的に、我々の能力は、いくつかの場合において、高分解能の構造情報をこのように定量的構造に基づいた予測をテストする我々の能力を制限する、定性機能的データが付随するように、同じ割合で増加しなかった精製されたタンパク質の機能的特性をプローブする。したがって、developmen定量的および一般化機能アッセイのtは膜タンパク質機能のメカニズムの基盤の解明に向けた重要なステップである。
チャネルおよびトランスポーター-ここでは、定量的に精製され、再構成されたCl -の主要な機能的特性を決定するために用いることができる流出アッセイを記載する。アッセイの基礎となる原理は、輸送システムの様々な、ならびに非イオン輸送タンパク質に一般化することができる。チャネル/大型のClの存在下でのトランス- -リポソームは、精製されたClで再構成する勾配（ 図1A、B）。のCl -の流出は、我々の場合K +イオノフォアバリノマイシンに、対イオン流束を可能にするために、イオノフォアを添加することによって開始のClによって確立された電圧をシャントれている-勾配及びKの平衡電位に初期の膜電位を設定する+ 6,7。トンなしそれは膜電位の発生により阻止されるように流出が発生し、 -彼は有意な正味のClをイオノフォアん。 -流出、およびf 0、活性タンパク質を含有しないリポソームの割合τ、Cl -の時定数：データは、定量的に2測定可能なパラメータ（ 図1C）によって記載されている。 τおよびf 0から一体のCl -輸送速度、活性タンパク質の画分と活性複合体の分子量は8導出することができる。既知の構造および機能の交換-技術はCLC-EC1、よく特徴付けCLC型H + / Clで再構成されたプロテオリポソームを用いて、ここに示されている。このアッセイは、容易に又は活性電圧および/またはリガンドの存在に依存して異なるイオン選択性チャネルまたは輸送体に一般化される。さらに、このアッセイは、小分子は、直接再構成タンパク質に影響を与えるかどうかを決定するために用いることができるこれらの化合物の効果を定量する方法、および膜組成物又は脂質修飾試薬は、再構成されたチャネルおよび輸送体の機能に影響を与える。
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Protocol
1.脂質の準備
- 透明なガラス管に所望量の脂質を分注し。 E.を使用してください大腸菌極性脂質抽出物が、ほとんどの脂質組成物を用いることができる。脂質は粉末形態である場合は、20 mg / mlの濃度のクロロホルムで再懸濁。すべての溶媒が蒸発するまでN 2ガ ス下、RTで脂質を乾燥させる。
- ペンタン中の脂質を再懸濁し、クロロホルムの残り痕跡を除去するために再びガスN 2の安定した流れを、それを乾燥させてください。乾燥した全ての溶媒が蒸発するまで。乾燥しながら脂質をチューブの底に三分の一をカバーする均一な膜に分布してではなく、一番下に密な塊を形成されるように、静かにチューブを回転させる。
- 脂質を溶解する界面活性剤（300mMの塩化カリウム、50mMのクエン酸、25mMのK 2 HPO 4、pH4.5で、35mMのCHAPS）を含有する再構成バッファを追加する。タンパク質がCHAPSにはあまり寛容である場合は、このステップのために他の中性洗剤を使用してください。
- Resuspen水浴超音波処理を使用して明瞭に脂質をdは。短い（30秒-1分）一時停止（30秒-1分）短いパルスの最大電力で水超音波処理槽の中心にチューブを浸し。溶液は透明になるはず。
注：達成明確化の最終的な程度は、使用される特定の脂質組成に依存します。この段階で、いくつかのバッチ間の変動があっても、名目上同一の脂質の中でも可能である。残留ヘイズは遠心分離により除去することができる懸濁液中の大きな粒子による光の散乱によるものである。 - 20〜60分間、室温で再懸濁脂質をインキュベートする。
2.プロテオリポソームの形成
注：いくつかの戦略は、リポソーム内に界面活性剤で可溶化タンパク質を挿入するために使用することができる。 CLC-EC1のために透析がうまく機能し、そのために選択6,9,10の方法です。
- μgのOで表され、所望のタンパク質対脂質（P / L）比（に精製タンパク質を追加します。 Fタンパク質/ mg脂質）。 P / L比の選択は、実験の目的に依存する。
- 目標は、関心対象のタンパク質の活性を評価することである場合には、各リポソームは、タンパク質の複数のコピーが含まれるように、信号を最大化するために高いP / L'sで再構成する。各小胞は、平均1タンパク質に含まれるように、活性および/またはタンパク質の単一の輸送速度を定量化するために、低いP / L'sのポアソン希釈領域で再構成する。各政権をどのような場合に使用するのより深い分析のための手順7と議論を参照してください。
- 様々なレジメンのための最適なP / L値を決定するには、タンパク質濃度8,11-13の関数として活性の完全な滴定を行う。しかし、活性単位の分子量（MWは、kDaので表す）する任意のタンパク質について、以下のP / Lの値が初期guesstimatesとして使用することができる知られている。
pgの "/>
- 予め湿らせた透析チューブまたはカセットにタンパク質と脂質混合物をロードします。 500-1,000x脂質再構成バッファのボリュームを含むビーカーに透析装置を配置（ すなわち 、脂質の再懸濁の1ミリリットルのため1 Lバッファ）穏やかに撹拌しながら。
- > 3時間間隔で変更バッファ3〜4回。すべてのソリューションの変更では、蒸留水でカセット/チューブ、ビーカーを洗浄し、新鮮な再構成緩衝液でビーカーを埋める。溶液交換のための1-2のO / N間隔を含めます。ソリューションの変更の正確な数と期間は、使用される正確な脂質や洗剤に依存します。
- 最後のステップが完了した後、-80℃で液体N 2又は凍結で、透析容器からリポソームを除去するチューブでそれらをアリコートし、フラッシュ、それらを凍結する。
3.録音セットアップ
<Pクラス= "jove_content">注： - （下記参照）電極、アナログとpH計記録のセットアップ（ 図2A）は、二つのチャンバー（平底シリンダー、〜3,4容）、Clから構成されていまたはデジタル電気出力、デジタイザ、および適切な取得ソフトウェアを備えたコンピュータ。- pH計の電極、コンピュータに接続されているデジタイザにpH計の出力-はClを接続します。 1チャンバー内の参照電極と他の（ 図2B）で再コーディングワイヤーを配置します。
注：ΔV カルが正である（ステップ6.4および7.2参照）がワイヤの極性が正しい。 - 記録チャンバー（ 図1B）で撹拌棒で撹拌プレート上室を置きます。撹拌棒が電極に接触していないことを確認してください。
- 寒天橋（ 図2B）（100 mMのKClおよび2％アガロース）を使用してチャンバーを接続します。 100のKClに寒天ブリッジを保管してください。
のCl 4.準備-電極
- 古いものと-possibly-非機能pH電極を取る。完全に銀線を明らかにするためにガラスコーティングを破る。
- 慎重に手術用メスの刃を使用して銀ワイヤからコーティングを除去。 H 2 OおよびEtOH大量のを使用して、ワイヤを清掃してください。
- ワイヤまでのFeCl 3（または漂白剤）の飽和溶液の代わりに塩化銀の均一な暗い被膜で覆われている。
単ラメラ小胞の5準備
- 実験前の夜は、のために（攪拌しないでください）穏やかに振盪しながら外部バッファ（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5）中の15ミリリットルでセファデックスG-50ビーズの1グラムを膨潤使用前に室温で少なくとも3時間。各実験は、膨潤したビーズの〜3ミリリットルが必要です。せいぜい数日、4℃で膨張したビーズにしてください。
- リポソームは、室温で解凍している間、各列〜3メートルに注ぐ膨潤したG-50ビーズリットル。 RTで重力流によってそれらが乾燥してみましょう。これは通常、1〜2分かかります。
- 0.4メートルテフロンカットオフを使用したミニ押出機を通してテオを11回押し出して単ラメラ小胞を準備します。
- プラスチック製の丸底チューブ内の列を配置します。過剰な溶液を除去するためのカラムをスピン。臨床遠心機で1400×gで20〜30秒間遠心する。
- フロースルーを捨て、13×100mmのガラス管内の場所の列と列に押し出された小胞の100μlを添加する。臨床遠心機で500×gで1分間コラムスピン。
- ステップ6.5で記録チャンバーに追加され、フロースルーの〜200μlのを収集します。
6.流出測定
- 記録チャンバーに置き参照2mlの100mMのKClを（接地）チャンバと外部バッファ1.8mlの（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5中）。内部の間のわずかな浸透圧の不均衡と外部のソリューションは影響しません
- 取得プログラムを起動します。これは数分かかることがあり、ベースラインが平衡化しましょう。
- 信号が安定したベースラインを（リポソームは準備ができていると列を乾燥）に達すると、（ 図3A）の記録を開始。
- システム（ 図2A）を校正するために10 mMのKCl溶液の15μlのを追加します。
- リポソームを追加します。プロテオリポソーム（ 図3A）から-小さなジャンプは、外部のClの除去が不完全に見えるかもしれません。ベースラインが安定するまで待ちます。
- 流出（ 図3A）を開始するためにバリノマイシン（EtOH中で1mg / mlで1μl）を追加します。
- 流出がそれプラトー（ 図3A）までの時間経過を実行してみましょう。
- すべてのリポソーム（ 図3A）を溶解するために、外部緩衝液中で調製1.5 Mβオクチルグルコシド（β-OG）の40μlを添加する。録音を終了します。
7.データAnalysis
- ASCIIまたはテキスト形式でのトレースファイルをエクスポートし、選択した解析プログラムにインポート。
- 以下の点（ 図3A）の電圧を測定します。
記録の開始時（V 0）。
較正パルス（V 校正 ）を添加した後、
リポソーム（V リポ ）を添加した後、
流出（V フィン ）の終わりに、
洗剤（V totは ）を添加した後、
ベースラインV 0 = 0となるよう電圧。 - の実験値を決定するために、ネルンスト - プランク方程式を使用して、
測定することにより、 
巻カルは、実験開始時の室容積はでμL、1800での校正パルスのボリューム表現されている場合1; L、[Clで] CAL /中 Clである-校正パルスのとMMとΔVCALで外部バッファの濃度は、校正パルス後に測定mV単位のジャンプです。
注：αのこの経験的な決定は、3の目的があります。それは、システムが適切に応答していることを保証し、実験間の機器の応答の一貫性の尺度を提供していますだけでなく、間違いが解製作に行われなかったことを確認する。 - 次のように各ステップの後のCl濃度を計算します。
要因400分の3は、2000μlの最終容量に15μlの校正パルスの希釈から来ている。 - 計算学会各ステップで[CL 'の変化、ΔCL リポ/フィン/ TOTを食べました。
- とはCl（t）がV（t）を変換する
直接の重要なポイントで 'CL値を決定し、内部統制などの計算値と比較します。 - トレースを正規のCl 相対 リポ = 0とCl REL TOT = 1となるよう
- 次式に流出時間経過をフィット：
実験的にはClを測定することによって決定される漏れ- - Lは、Clの割合である場合、同じ条件及びτで製造したタンパク質を含まないリポソームからの流出は、プロセスの時定数である。 - V、初期速度を計算します。
ここΔCL フィンはミリモルで発現され、Vはμlのチャンバの容積である。 - 輸送速度/コンダクタンスを計算します
pがP / Lであり、MWは、活性複合体の分子量は、kDaの中で発現され
測定することにより、 
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Representative Results
交換器、リポソーム中に再構成-精製されたCLC-EC1、原核生物CLC型H + / CLにより媒介輸送-私たちは、詳細かつ堅牢なのClを測定するためのプロトコルについて説明します。実験の概略図を図3に示されている精製されたCLC-EC1及び高い内部のClを含有する再構成されたプロテオリポソームは、 -低のClを含有する浴溶液に浸漬されている- 。これらの条件の下で正味のCl -流出リポソーム（ 図3A）における正電荷の蓄積を防止する。流出（ 図3B） -バリノマイシンを添加すると、K +は、このように電位を分路およびCLを開始する膜を横切って移動することができます。フラックスの経時変化のClを使用して監視されている-選択性電極およびClの総量-小胞に含まれているが、直接洗剤を使用して可溶化することによって測定される。これらから、バルク実験は、そのような回転率、活性複合体の化学量論および活性タンパク質の画分として単再構成されたタンパク質の特性を決定することが可能である。流出の時間経過に合わせて、式7-9を使用して、我々はτ（0.2μgの/ MG）= 41秒であり、f 0（0.2μgの/ MG）= 0.31は、〜1ことを示すことがわかりCLC-EC1の単一の輸送速度を推定リポソームの/ 3は0活性タンパク質が含まれています。秒-1、公表値8,14とよく一致して-これらの値から、我々は単一の輸送速度はγ〜2500 Clであることを計算する。
図1：のCl -流出アッセイ（A - B）のClの模式図- -effluxタンパク質を含まないリポソーム（A）のためのアッセイまたはCLC-EC1再構成された小胞（B）。 （C）イオノフォアが開始したClを模擬タイムコース-プロテオ（黒）またはタンパク質を含まないリポソーム（灰色破線）から流出。流出は、イオノフォア（*）の添加によって開始し、（^）リポソームを溶解する界面活性剤の添加により停止させる。赤は破線のClの時定数、τを決定する指数フィットです- CLC-EC1とf 0の少なくとも1のアクティブコピーを含むリポソームからの流出は、0活性タンパク質を含有するリポソームの割合です。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
図2：録画設定する（A）記録を設定。。 （B）室のクローズアップ。 <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：サンプル·トレースおよび分析を0.2μg/ mgのP / LにWT CLC-EC1で再構成プロテオから流出実験の（A）は、典型的なV（t）のトレース。。矢印は、KClの校正パルス、リポソーム、バリノマイシン及びβ-OGの添加時間を示す。破線は、様々な段階でのΔV値を示している。 （B）V（t）のトレースは、式5を用いて、Cl水溶液（トン）に変換されて、正規化を用いて式（6）および排出の時間経過は、（赤色の破線）式7に当てはめられる。 0.2μgの/ mgのP / L（黒）または5μgの/ mgのP / L（グレー）でWT CLC-EC1で再構成プロテオリポソームから（C）正規化された流出時間のコース。破線Sは7を方程式に流出時間のコースの最高のフィットです。
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Discussion
精製された陰イオン選択的チャネルまたはリポソーム中に再構成トランスポーターによって媒介輸送-私たちは、詳細はClを測定するためのプロトコルを記載している。交換CLC-EC1 -使用例は、原核生物のH + / CLだった。検討中のイオンに適したものでAgCl電極ただし、方法論は、容易にリガンド12,13,15、電圧11,12、またはAgを交換することによって、異なるアニオン選択15,16をスポーツによってゲートチャンネルを研究するために適合させることができる。のCl以外のイオンのための選択性電極- 、などのH +としては、I -及びF - 、市販されている。
重要なステップとの仮定のいくつかの議論が続く。
ポアソン希釈仮定の限界
ユニタリ率（式7-9）の導出は唯一のポアソン希釈政権、ほとんどのリポソームの続きに有効ですアインつのみ活性タンパク質所与の小胞に複数コピーを有する確率が低く、小胞の集団の巨視的流出時定数が十分に単一のタンパク質を含むリポソームのことによって近似されるようになっている。実際、Cl -の比較-低い（黒、0.2μgの/ MG）でのCLC-EC1で再構成したリポソームにより媒介流出の時間経過と高P / L（グレー、5μgの/ MG）（ 図3C）であることを示している後者の場合は、流出速度は、総リポソームの小さい画分が0のタンパク質が含まれていることを示す、より速く、F 0が減少になる。 Cl -の合計量-両方ベシクル試料中に含まれる2つの試料中の小胞の全内部容積は同様であったこと、および再構成タンパク質の量の大きさに影響を与えないことを示し、それぞれ〜0.7〜0.55マイクロモル、同等であった小胞。 7を方程式に高いP / Lの流出時間経過をフィッティングすると、τの値を生成する （5μgの/ MG）= 8.8秒であり、f 0（5μgの/ MG）= 0.06、小胞の唯一の〜6％は、〜31％時のP / L見つかったとは対照的にアクティブなCLC-EC1ダイマーが含まれていないことを示す= 0.2μgの/ mgで。秒-1、低P / Lと公表されたデータ8,14の時に得られたものよりもほぼ6倍低い-これにより、高P / Lにおける単一の離職率の推定値は、γ〜450 Clである。そのため、高P / L'sで再構成したリポソームからの流出時間のコースの分析は、再構成タンパク質の単一の輸送速度を過小評価します。したがって、正確に正確に再構成されたタンパク質の量を決定することが極めて重要である新規タンパク質の単一の輸送速度を決定し、ポアソン希釈領域で、低いP / L'sで動作する。これは、理想的に動作するように最適なレジームを識別するために、完全なタンパク質の滴定分析を決定することによって達成される。
活性複合体の質量の決定
10トン">分析は、上述の活性複合体の化学量論が知られており、再構成タンパク質が完全にアクティブであることを前提としているが、新たな調製物について、これらの量は、 先験的に知られていない可能性があり、この場合には、これらのパラメータを直接決定することが可能である脂質比に異なるタンパク質でF 0年代を測定することにより、
pは、タンパク質濃度であり、 
、ρは、脂質の質量あたりのリポソームの数であり、N Aはアボガドロ数は、M Pは、機能チャネル複合体の質量であり、φは、活性タンパク質の画分である。脂質比にさまざまなタンパク質で0年代のF実験的に決定をフィッティングすることにより、POSですP 0を決定するsibleので、M、P、φ。
リポソームの有限の割合は、定款に難治性である
単一の輸送速度の導出は高いPで/ L'sのすべてのリポソームは少なくとも一つの活性輸送タンパク質を含むことになることを想定しています。しかし、場合によってはこれはそうでないことが見出されている：高いPで/リポソームのLのかなりの部分は、いくつかのタンパク質11-13,17の再構成に対して難治性のままである。この現象の起源は不明であるが、それは、大きなタンパク質は、このように利用可能なリポソームの数を減らす小さな半径を有する小胞から除外されることが考えられる。
この場合、式10は、に変更される必要がある。 
θはproteiへのリポソームの耐火物の割合ですn個の取り込み。異なる手順は、リポソーム再構成と形成の間脂質とタンパク質のための別の回収を持つことになりますので、重要なことは、ρ、φはまた再構成法の影響を受けている。両方のために収率100％と仮定すると、γの誤推定をもたらす。したがって、単一のターンオーバー/コンダクタンスの正確な定量を得るためには、実験的に再構成8,11の間に失われ、脂質とタンパク質の割合を決定することが重要である。
再構成されたタンパク質のオリエンテーション
分析の実行中に行われる前提条件の一つは、すべて再構成されたタンパク質が機能的に同等であるということである。しかし、多くのチャネルやトランスポーターは、整流として知られる現象を輸送方向を推奨している。この機能的非対称性は離職率の推定誤差につながるかもしれない。さらに、再構成されたタンパク質の配向は、 先験的 + Kを使用して適切な値に貫通電圧を設定することにより、左右に機能的に両面阻害剤を用いて、2つの集団のいずれかをサイレンシングするか、選択的に活性化化合物の添加によって一方向のみのタンパク質を活性化することによって、この問題を回避することが可能であるリガンドまたは電位依存性であるチャネルやトランスポーターのための勾配、。
タイトなリポソームの形成に関する考察
ユースOの有効化重要な要因の一つここで説明流出アッセイfのタイトリポソームの形成である。この目的のために考慮されるべき3つの重要な変数は、タンパク質、界面活性剤除去戦略及びリポソームの脂質組成物の選択を可溶化するために使用される界面活性剤の選択である。ここに提示されたプロトコルでは、CLC-EC1は、デシルマルトピラノシド（DM）、したがって、容易に除去される高い臨界ミセル濃度（CMC）値を有する界面活性剤で可溶化される。しかし、合成および天然に存在する界面活性剤の様々なその後の小胞の気密性に全く影響をタイトリポソーム中に再構成したタンパク質を精製するために使用されている。これらの洗剤はミリモル濃度と高いCMCは、広範囲を有し、かつ（例えばドデシルマルトピラノシド（DDM）又はdioctylpropaneビスマルトピラノシド（DMNG）など）、マイクロモル程度の低い（例えば、DMまたはジギトニンなど）。これは、リポソームを形成するために使用される脂質はCHAPSを用いて可溶化されることが注意することが重要である、または他の中性洗剤、したがって、タンパク質および脂質の混合物から得られるハイブリッドミセルは、親洗剤とは異なる物理化学的特性を有するかもしれない。これは、より顕著なリークにつながるリポソームを不安定化する可能性がある場合には残留洗剤を除去ことが可能である。この問題を回避するためには、そのようなバイオビーズ12,13、スピンカラム15またはゲルろ過18などの代替界面活性剤除去戦略を、調査することをお勧めします。最後に、小胞の脂質組成物は、特定の混合物は、特定の条件の異なるイオン漏出かもしれないように、重要なパラメータである。例えば、リポソームはE.から形成される大腸菌極性脂質抽出物はCLにタイト-酸性pHであるが、pHが3から形成された19またはリポソームが増加するにつれて次第に漏出になる：1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジル-エタノールの1：1混合物を（POPE）および1-パルミトイル2-オレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）E.から形成されるものよりも、H +に非常に低い透過性を表示する大腸菌極性脂質抽出物20。それは、小胞の脂質組成はまた、再構成タンパク質13,21,22の活性に影響を与える可能性があることが注意することが重要である。したがって、正確に各条件で調製されたタンパク質を含まない小胞の特性を決定し、これは再構成されたタンパク質の特性にどのように影響するかを評価することが重要である。
非CLC型チャネルおよびトランスポーターへの一般
流出アッセイ、ここで説明したように、直接のCl単一分子特性を決定するために利用することができ-選択性チャネルまたは輸送体を、例えばCa 2+の性質を特徴付けるために使用されているのCl -活性化-チャネルTMEM16A 12 。私たちは現在、トランスポーターの性質を調査するために流出アッセイを適合させる方法を議論したりchannClではありませんELS -選択的および/ または〜10 3イオン秒-1 CLC-EC1の大きく異なる単一の輸送速度を持っている。
最も単純なケースは、研究対象のタンパク質がアニオン選択性であることである。この場合、唯一の必要な調整は、Ag交換することです。 - -選択FlucsとCLCを16,23,24またはI - Fのために行ったように、適切な選択性の市販のものとAgCl電極をそのようなCFTR 15などの透過性のチャンネル。一方、再構成されたタンパク質は、陽イオンに対して選択的である場合、バリノマイシン以外のイオノフォアは流出を開始するために使用されなければならない。検証済みのClの希少性を考える-便利な代替は、カルボニルシアニド4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）として、H +イオノフォアであるイオノフォア。この場合、バッファを増加させることによって小胞内のpHは、例えば、一定に維持されることを保証することが重要である内部溶液の容量はる。代替戦略は、対イオンとしてプロトンを用い、pH計25またはレシオメトリックpH感受性プローブ26を用いてH +輸送を監視することによって再構成されたチャネルまたは輸送体を介してカチオン流出に従うことである。しかし、これらの測定値を間接的に性質が困難な再構成タンパク質の輸送特性の定量化をレンダリングする。最後に、陽イオンの数の選択性電極が存在し、市販されている。共輸送体-第三のシナリオは、研究対象のタンパク質が、例えば不十分な選択性チャネル13または陽/ CL、陰イオンと陽イオンの両方に対して透過性であるということです。彼らは塩分を失うように、この場合には、再構成されたリポソームは、（5.4から5.5ステップ）溶液交換プロセス中のKCl勾配を維持していない。したがって、この場合、すべての運動情報が失われる。しかし、リポソームの画分は、少なくとも一つの活性のprotを含むコンテンツ（ステップ6.8） -アイン、f 0は 、まだClで捕捉された残余の界面活性剤を添加して測定することにより求めることができる。これは、タンパク質の滴定を実施し、式10を用いて、タンパク質の分子量の決定を可能にする。
考慮すべき別の態様は、再構成タンパク質の単一の輸送速度は、CLC-EC1とは異なる大きさのオーダーであることが可能である。ほとんどのチャンネルが10 6〜10 7秒-1、3-4,000倍速くCLCよりもイオンを伝導しながら、例えば、ほとんどの輸送体は、1-10秒の離職率-1、CLC-EC1よりも2〜3桁低いを持っている-ec1。遅いトランスポーターのClのレート-タンパク質を含まないリポソームから漏れ、タンパク質の輸送速度が低下するなどの流出過程が増加中での相対的な重みとして、制限になることができます。我々の経験では、漏れ率は準備の間で多少異なり、の順で通常少数のイオン秒-1。ゆっくりトランスポーターを扱う場合そのため、正確に小胞の各バッチに対応漏れを測定するために、それぞれの再構成に並んでタンパク質を含まないリポソーム側を準備することをお勧めします。流出アッセイは、正常に代謝回転速度の周り1-10イオン秒-1、そのようなシアノバクテリアCLC 27などの低速輸送体の単一の速度を決定するために使用されてきた。再構成されたタンパク質は、例えば、イオンチャネルのために、高い導電性を有する場合に逆の状況が発生する。この場合、排出速度、混合時間（〜1-2秒）の律速になって記録電極の固有の応答時間として解決されるにはあまりにも高速である。この場合には、運動情報が失われているが、活性複合体の質量は依然として24を決定することができる。このような平面脂質二重層の記録またはパッチクランプリポソームなどの他のアプローチは、これらのテとして精製イオンチャネルを研究するのがより適切であることは注目に値することである直接高時間分解能で単一分子の情報を提供chniques。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
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