Introduction
En las últimas dos décadas la capacidad para sobreexpresar y purificar las proteínas de transporte de membrana ha aumentado dramáticamente: canales iónicos, transportadores primario y secundario están ahora purificaron rutinariamente a partir de sistemas de expresión heterólogos, así como de fuentes naturales. Constantemente se están desarrollando nuevos enfoques para controlar la expresión, mejorar y facilitar la extracción y mejorar la estabilidad de estas proteínas 1-5. Estos avances tecnológicos han sido fundamentales en el desencadenamiento de la explosión de la información estructural a nivel atómico en las proteínas de membrana que, a su vez, mejorado nuestra comprensión de las bases estructurales de su función. En contraste, nuestra capacidad para investigar las propiedades funcionales de las proteínas purificadas no aumentó en la misma proporción, de modo que en algunos casos alta resolución información estructural está acompañada por datos funcionales cualitativos, lo que limita nuestra capacidad para probar cuantitativamente predicciones basadas en la estructura. Por lo tanto, la development de ensayos funcionales cuantitativos y generalizables es un paso clave hacia la elucidación de las bases mecanicistas de la función de las proteínas de membrana.
Aquí se describe un ensayo de flujo de salida que se puede utilizar para determinar cuantitativamente propiedades funcionales clave de purificado y reconstituido Cl - canales y transportadores. Los principios subyacentes del ensayo se pueden generalizar a una variedad de sistemas de transporte, así como a las proteínas no-iónicos transporte. Los liposomas se reconstituyen con purificados Cl - canal / transportadores en la presencia de un gran Cl - gradiente (Figura 1A, B). Cl - flujo de salida se inicia mediante la adición de un ionóforo para permitir flujo de contra-ión, en nuestro caso el K + valinomicina ionóforo, que la tensión de derivación establecido por el Cl - y establecer el gradiente de potencial inicial membrana para el potencial de equilibrio de K + 6,7. Sin tque ionóforo no significativa Cl neta - flujo de salida se produce, ya que se evita mediante la generación de un potencial transmembrana. Los datos se describe cuantitativamente por dos parámetros medibles (Figura 1C): τ, la constante de tiempo de eflujo de Cl -, y f 0, la fracción de liposomas que no contienen una proteína activa. De τ f 0 y el unitaria Cl - velocidad de transporte, la fracción de proteínas activas y la masa molecular del complejo activo se pueden derivar 8. La técnica se ilustra aquí usando proteoliposomas reconstituidos con CLC-EC1, un bien caracterizado de tipo CLC H + / Cl - intercambiador de la estructura y función conocida. Este ensayo se generaliza fácilmente a los canales o transportadores con diferente selectividad iónica o cuya actividad depende de la presencia de voltaje y / o ligandos. Además, este ensayo se puede usar para determinar si las moléculas pequeñas afectan directamente a la proteína reconstituida,para cuantificar los efectos de estos compuestos y cómo composición de la membrana o de los reactivos modificadores de lípidos afectan a la función de los canales y transportadores reconstituidas.
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Protocol
1. Preparación de lípidos
- Alícuota de los lípidos cantidad deseados en un tubo de vidrio transparente. Tu Ves. coli extracto lipídico polar, pero la mayoría de composiciones lipídicas pueden ser utilizados. Si los lípidos están en forma de polvo, ellos resuspender en cloroformo a una concentración de 20 mg / ml. Secar los lípidos a TA bajo N2 gas hasta que todo el disolvente se haya evaporado.
- Resuspender los lípidos en pentano y secar de nuevo un flujo constante de gas N 2 para eliminar los restos sobrantes de cloroformo. Seco hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Si bien el secado, gire suavemente el tubo de manera que el lípido se distribuye en una película uniforme que cubre el tercio inferior del tubo en lugar de una formación de una masa densa en la parte inferior.
- Añadir el tampón de reconstitución que contiene detergente (300 mM KCl, 50 mM de ácido cítrico, 25 mM de K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) para disolver los lípidos. Utilice otros detergentes suaves para este paso si la proteína es poco tolerante a la CHAPS.
- Resuspend los lípidos a la claridad utilizando un aparato de ultrasonidos baño de agua. Sumergir el tubo en el centro del baño de agua sonicador la máxima potencia a corto (30 seg-1 min) con impulsos cortos (30 seg-1 min) pausas. La solución debería quedar claro.
NOTA: El grado final de la claridad lograrse depende de la composición lipídica específico usado. Alguna variación de lote a lote en este paso, incluso entre los lípidos nominalmente idénticos, también es posible. Bruma residual es debido a la dispersión de la luz por las grandes partículas en la suspensión, que se pueden eliminar por centrifugación. - Incubar los lípidos se resuspendieron a temperatura ambiente durante 20-60 min.
2. Proteoliposoma Formación
NOTA: Varias estrategias se puede emplear para insertar la proteína solubilizada con detergente en liposomas. Para CLC-EC1 diálisis funciona bien y por lo tanto es el método de elección 6,9,10.
- Añadir la proteína purificada a la deseada proteína-lípido (P / L) relación (expresada en microgramos o f proteína / mg de lípidos). La selección de la relación P / L depende de la finalidad del experimento.
- Si el objetivo es evaluar la actividad de la proteína de interés, reconstituir a alta P / L's para maximizar la señal, ya que cada liposoma contiene múltiples copias de la proteína. Para cuantificar la actividad y / o la velocidad de transporte unitario de la proteína, reconstituir en un régimen de dilución de Poisson a baja P / L's, de modo que cada vesícula contiene en promedio proteína 1. Vea el paso 7 y Discusión para un análisis más profundo de cuándo utilizar cada régimen.
- Para determinar los valores de P / L óptimas para los diferentes regímenes, realizar una valoración completa de la actividad como una función de la concentración de proteína 8,11-13. Sin embargo, para cualquier proteína para la que el peso molecular (MW, expresado en kDa) de la unidad activa se conocen los siguientes valores P / L se pueden utilizar como guesstimates iniciales:
pg "/>
- Cargue la proteína y mezcla de lípidos en un tubo de diálisis pre-humedecida o un casete. Coloque el dispositivo de diálisis en un vaso de precipitados que contiene 500-1,000x el volumen del tampón de reconstitución de lípidos (es decir, 1 L de tampón de 1 ml de la resuspensión de lípidos) bajo agitación suave.
- Cambio búfer 3-4 veces a intervalos de> 3 horas. En cada cambio de solución, lavar la casete / tubo y el vaso de precipitados con agua destilada y llenar el vaso de precipitados con tampón de reconstitución fresco. Incluya 2.1 O / N intervalos para el cambio de solución. El número exacto y la duración de los cambios solución depende de la exacta de lípidos y detergentes utilizados.
- Después de la última etapa, retire los liposomas de la vasija de diálisis, alícuota en tubos y flash les congele en N2 líquido o congelación a -80 ° C.
3. Registro de Configuración
<p class = "jove_content"> NOTA: La grabación de configuración (Figura 2A) se compone de dos cámaras (cilindros de fondo plano, ~ volumen 3-4 ml), un Cl - (ver más abajo) de electrodo, un medidor de pH con un análogo o salida digital eléctrica, un digitalizador, y un ordenador con un software de adquisición correspondiente.- Conectar el Cl - electrodo al medidor de pH, la salida del medidor de pH para el digitalizador que está conectado a la computadora. Coloque el electrodo de referencia en una cámara y el cable de recodificación en la otra (Figura 2B).
NOTA: La polaridad de los cables es correcta si? V Cal (ver Paso 6.4 y 7.2) es positiva. - Coloque las cámaras en una placa de agitación con una barra de agitación en la cámara de grabación (Figura 1B). Asegúrese de que la barra de agitación no toque el electrodo.
- Conectar las cámaras utilizando un puente de agar (Figura 2B) (100 mM KCl y 2% de agarosa). Guarde los puentes de agar en 100 mM KCl.
4. Preparación de la Cl - Electrodo
- Tome un electrodo de edad y -eventualmente- que no funciona pH. Romper el recubrimiento de vidrio para revelar completamente los cables de plata.
- Retire cuidadosamente el recubrimiento de los cables de plata usando una hoja de bisturí. Limpie los cables usando copiosas cantidades de H 2 O y EtOH.
- Colocar en una solución saturada de FeCl 3 (o lejía) hasta que los cables están cubiertos con una capa oscura uniforme de AgCl.
5. Preparación de vesículas unilamelares
- La noche antes de los experimentos, se hinchan 1 g de Sephadex G-50 bolas en 15 ml de tampón externo (1 mM KCl, 150 mM de K 2 SO 4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) con agitación suave (no revuelva) para al menos 3 horas a RT antes de su uso. Cada experimento requiere ~ 3 ml de perlas hinchadas. Mantenga las perlas hinchadas a 4 ° C durante unos días como máximo.
- Mientras que los liposomas están descongelando a temperatura ambiente, se vierte en cada columna ~ 3 ml de hinchadas G-50 perlas. Deje que se sequen por gravedad a RT; esto por lo general toma 1-2 min.
- Preparar vesículas unilamelares por extrusión de los proteoliposomas 11 veces a través de un Mini-Extrusora utilizando un punto de corte 0,4 m de teflón.
- Colocar la columna en un tubo de fondo redondo de plástico. Haga girar las columnas para eliminar el exceso de solución. Centrifugar durante 20-30 segundos a 1400 xg en una centrífuga clínica.
- Desechar el flujo a través, la columna de lugar en un tubo de vidrio de 13 x 100 mm y añadir 100 l de las vesículas extruidos a la columna. Girar la columna durante 1 min a 500 xg en una centrífuga clínica.
- Recoger ~ 200 l de flujo a través que se añadirán a la cámara de grabación en el paso 6.5.
6. Eflujo Medición
- Coloque 2 ml de KCl 100 mM en la cámara (tierra) de referencia y 1,8 ml del tampón externo (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, ácido cítrico 25 mM, pH 4,5) a la cámara de grabación. El desequilibrio leve osmótico entre el interiory soluciones externas no afecta
- Inicie el programa de adquisición. Deje que la línea de base se equilibre, esto puede tardar unos minutos.
- Una vez que la señal llega a una línea de base estable (los liposomas están listos y las columnas seco), iniciar la grabación (Figura 3A).
- Añadir 15 l de una solución 10 mM KCl para calibrar el sistema (Figura 2A).
- Añadir liposomas. Un pequeño salto podría ser visible debido a la eliminación incompleta de Cl externa - a partir de los proteoliposomas (Figura 3A). Espere hasta que se estabilice la línea de base.
- Añadir valinomicina (1 l de 1 mg / ml en EtOH) para iniciar el eflujo (Figura 3A).
- Deje que el flujo de salida siga su curso temporal hasta que mesetas (Figura 3A).
- Añadir 40 l de 1,5 M β-octilglucósido (β-OG) preparado en el tampón externo para disolver todos los liposomas (figura 3A). Termine la grabación.
7. Datos Análisis
- Exportar el archivo de rastreo de en un formato ASCII o texto e importarlo al programa de análisis de la elección.
- Mida la tensión en los siguientes puntos (Figura 3A):
Al comienzo de la grabación (V 0);
Después de la adición del pulso de calibración (V cal);
Después de la adición de los liposomas (V lipo);
Al final de el flujo de salida (V fin);
Después de la adición de detergente (V tot);
Los voltajes de línea de base de manera que V 0 = 0. - Use la ecuación de Nernst-Plank para determinar el valor experimental de
midiendo 
Cuando Vol Cal es el volumen del impulso de calibración en l, 1,800 es el volumen de cámara en el comienzo del experimento se expresa en1; l, [Cl] cal / en son el Cl - concentraciones del impulso de calibración y de la memoria intermedia externa en mM y cal? V es el salto en mV medido después del pulso de calibración.
NOTA: Esta determinación empírica de α sirve para tres propósitos: asegura que el sistema responde correctamente, ofrece una medida de la consistencia de la respuesta del instrumento entre los experimentos, así como para comprobar que no se han cometido errores en la fabricación solución. - Calcular las concentraciones de Cl después de cada paso de la siguiente manera:
El factor de 3/400 proviene de la dilución del impulso de calibración 15 l en el volumen final de 2.000 l. - Calculcomieron los cambios en [Cl] en cada paso, ΔCl lipo / def / tot.
- Convertir V (t) en Cl (t) con
Determinar directamente los valores [CL] en los puntos críticos y compararlos con los valores calculados como un control interno. - Normalizar la traza para que la lipo Cl rel = 0 y Cl tot rel = 1
- Montar el supuesto tiempo de flujo a la siguiente ecuación:
Donde L es la tasa de Cl - fuga que se determina experimentalmente mediante la medición de Cl - flujo de salida a partir de liposomas libres de proteínas preparados en las mismas condiciones y τ es la constante de tiempo del proceso. - Calcular v, la velocidad inicial:
Cuando ΔCl aleta se expresa en milimolar y V es el volumen de la cámara en l. - Calcular la tasa de transporte / conductancia
Donde p es el P / L, MW es el peso molecular del complejo activo expresada en kDa
midiendo 
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Representative Results
Se describe un protocolo detallado y robusto para medir Cl - transporte mediado por purificada CLC-ec1, un procariota tipo CLC H + / Cl - intercambiador, reconstituido en liposomas. Una representación esquemática del experimento se muestra en la Figura 3 proteoliposomas reconstituidos con purificada CLC-ec1 y contiene alta Cl interna -. Se sumergen en un baño de solución que contiene bajo Cl -. Bajo estas condiciones netas Cl - flujo de salida se impide por la acumulación de carga positiva en el liposoma (Figura 3A). La adición de valinomicina permite K + para moverse a través de la membrana de maniobras así el potencial eléctrico y el inicio de Cl - flujo de salida (Figura 3B). La evolución en el tiempo de flujo se controlará mediante un Cl - electrodo selectivo y la cantidad total de Cl - contenido en las vesículas se mide directamente mediante la solubilización usando detergente. A partir de estosexperimentos a granel es posible determinar las propiedades de las proteínas individuales reconstituidas, tales como la tasa de rotación, la estequiometría del complejo activo y fracción de proteína activa. Usando las ecuaciones 7-9 para adaptarse a la evolución en el tiempo de flujo de salida y estimar la velocidad de transporte unitario de CLC-ec1 encontramos que τ (0,2 mg / mg) = 41 seg y f 0 (0.2 mg / mg) = 0,31, lo que indica que ~ 1 / 3 de los liposomas contiene 0 proteínas activas. A partir de estos valores se calcula que la velocidad de transporte unitario es γ ~ 2500 Cl - sec -1, en buen acuerdo con los valores publicados 8,14.
Figura 1: El Cl - ensayo de eflujo (A - B) Representación esquemática de la Cl - ensayo -efflux para liposomas libres de proteínas (A) o CLC-ec1.vesículas reconstituidas (B). (C) transcurso de tiempo simulado de ionóforo iniciada por Cl - flujo de salida de proteoliposomas (negro) o liposomas libres de proteínas (línea de trazos de color gris). Flujo de salida se inicia mediante la adición de ionóforo (*) y se terminó por la adición de detergente para disolver los liposomas (^). Línea discontinua roja es un ajuste exponencial para determinar la constante de tiempo, τ, de Cl -. Eflujo de liposomas que contienen al menos 1 copia activa de CLC-ec1 y f 0 es la fracción de liposomas que contienen 0 proteínas activas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2: Grabación estableció (A) La grabación configurado.. (B) Primer plano de las cámaras. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: trace de muestras y análisis (A) típica V (t) trazas de experimentos de flujo de salida de proteoliposomas reconstituidos con WT CLC-EC1 a 0,2 g / mg P / L.. Las flechas indican los tiempos de adición de KCl el pulso de calibración, liposomas, valinomicina y β-OG. Las líneas discontinuas indican los valores de? V en varias etapas. (B) El V (t) de traza se convierte en Cl (t) utilizando la Ecuación 5, normalizado usando la Ecuación 6 y el tiempo de eflujo curso es ajuste a la ecuación 7 (línea roja punteada). (C) Cursos de tiempo de flujo normalizadas de proteoliposomas reconstituidos con WT CLC-ec1 a 0,2 mg / mg P / L (negro) o en 5 mg / mg P / L (gris). Linea discontinuas son mejores ataques de la evolución temporal de flujo de salida a la ecuación 7.
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Discussion
Hemos descrito un protocolo detallado para medir la Cl - transporte mediado por canales o transportadores reconstituidas en liposomas aniones selectiva purificados. El ejemplo utilizado fue el procariota H + / Cl - Intercambiador CLC-ec1. Sin embargo, la metodología se puede adaptar fácilmente para estudiar canales cerrados por ligandos 12,13,15, 11,12 tensión, o deportivo selectividad diferente aniónico 15,16 sustituyendo el Ag: electrodo AgCl con uno adecuado para el ion bajo consideración. Electrodos selectivos de iones distintos de Cl -, tales como H +, I - y F -, están disponibles comercialmente.
Una discusión de algunos de los pasos críticos y suposiciones siguen.
Límites de la dilución supuesto de Poisson
La derivación de la tasa unitaria (Ecuación 07.09) es válida sólo en un régimen dilución Poisson, cuando la mayoría de los liposomas contain sólo una proteína activa de manera que la probabilidad de tener múltiples copias en una vesícula dada es baja y el macroscópico constante de tiempo de eflujo de la población de vesículas es bien aproximada por la de los liposomas que contienen una sola proteína. De hecho, una comparación de la Cl - transcurso de tiempo de eflujo mediado por liposomas reconstituidos con CLC-EC1 a baja (negro, 0,2 g / mg) y alta P / L (gris, 5 g / mg) (Figura 3C) muestra que en la este último caso la cinética de flujo de salida sea más rápido y f 0 disminuye, lo que indica que una fracción más pequeña de los liposomas totales contiene 0 proteínas. La cantidad total de Cl - contenida en ambas muestras de vesículas era comparable, ~ 0,7 y ~ 0,55 moles, respectivamente, lo que indica que el total de los volúmenes internos de las vesículas en las dos muestras fue similar y que la cantidad de proteína reconstituida no afecta el tamaño de las vesículas. Montaje de la evolución en el tiempo de alto P / L de flujo de salida a la Ecuación 7 produce valores de τ ; (5 g / mg) = 8,8 s y f 0 (5 g / mg) = 0,06, lo que indica que sólo ~ 6% de las vesículas no contienen dímeros CLC-EC1 activos en contraste con el ~ 31% encontrado cuando P / L = 0,2 g / mg. Por lo tanto, la estimación de la tasa de rotación unitaria a alta P / L es γ ~ 450 Cl - sec -1, casi 6 veces menor que la obtenida a baja P / L y de los datos publicados 8,14. Por lo tanto, el análisis de la evolución temporal de flujo de salida de los liposomas reconstituidos en alto P / L's se subestime la velocidad de transporte unitario de la proteína reconstituida. Por lo tanto, para determinar con precisión la velocidad de transporte unitario de una nueva proteína es de importancia clave para determinar con precisión la cantidad de proteína reconstituida y trabajar a baja P / L's, en un régimen de dilución de Poisson. Esto se logra idealmente mediante la determinación de un análisis completo de titulación de proteína para identificar el régimen óptimo para trabajar.
Determinación de la masa del complejo activo
tienda "> El análisis descrito anteriormente asume que la estequiometría del complejo activo es conocida y la proteína reconstituida es completamente activo. Sin embargo, para nuevas preparaciones estas cantidades no pueden ser conocidos a priori. En este caso, es posible determinar directamente estos parámetros midiendo la f 0 's en diferentes proporciones de proteína a lípidos
donde p es la densidad de proteína, 
, Ρ es el número de liposomas por masa de lípido, N A es el número de Avogadro, M P es la masa del complejo de canal funcional y φ es la fracción de proteínas activas. Montando el determinado experimentalmente f 0 's en diversos proteína a lıpido es posble para determinar p 0, y por lo tanto M P y φ.
Una fracción finita de liposomas es refractario a la incorporación
La derivación de la velocidad de transporte unitario asume que a alta P / L's todos los liposomas contienen al menos una proteína de transporte activo. Sin embargo, en algunos casos se ha encontrado no ser el caso: a alta P / L's una fracción significativa de los liposomas permanece refractaria a la reconstitución de algunas proteínas 11-13,17. Aunque el origen de este fenómeno no son claras, es concebible que las proteínas más grandes podrían ser excluidos de vesículas con radios más pequeños, reduciendo así el número de liposomas disponibles.
En este caso la ecuación 10 debe ser modificado a: 
donde θ es la fracción de liposomas refractarios a Protein incorporación. Es importante destacar que, ρ y φ también se ven afectados por el método de reconstitución desde diferentes procedimientos tendrán diferentes recuperaciones de lípidos y proteínas durante la reconstitución de liposomas y la formación. Suponiendo un rendimiento del 100% para ambos dará lugar a una mala estimación de γ. Por lo tanto, para obtener una cuantificación precisa de la rotación unitaria / conductancia es importante para determinar experimentalmente la fracción de lípidos y proteínas perdido durante la reconstitución 8,11.
La orientación de las proteínas reconstituidos
Una de las hipótesis establecidas durante el análisis es que todas las proteínas reconstituidos son funcionalmente equivalentes. Sin embargo, muchos canales y transportadores han preferido direcciones de transportes, un fenómeno conocido como rectificación. Esta asimetría funcional podría conducir a un error de estimación de la tasa de rotación. Además, la orientación de las proteínas reconstituida es a priori + gradientes, para los canales o transportadores que son ligando o dependiente de la tensión.
Consideraciones sobre la formación de liposomas apretados
Uno de los factores clave que permiten el uso of el ensayo de flujo de salida se describe aquí es la formación de liposomas reducidos. Tres variables importantes a tener en cuenta para este fin son la elección de detergente utilizado para solubilizar la proteína, la estrategia de detergente del desmontaje y la elección de la composición lipídica de los liposomas. En el protocolo presentado aquí, CLC-EC1 se solubiliza en decil-maltopiranósido (DM), un detergente con un alto valor de concentración micelar crítica (CMC), por tanto, que se elimina fácilmente. Sin embargo, una variedad de detergentes sintéticos y de origen natural se han usado para purificar proteínas que se reconstituyeron posteriormente en liposomas apretada sin efectos sobre la estanqueidad de las vesículas. Estos detergentes tienen una amplia gama de CMC, tan alto como milimolar (tales como DM o digitonina) y tan bajo como micromolar (tales como dodecil maltopiranósido (DDM) o dioctylpropane-bis-maltopiranósido (DMNG)). Es importante señalar, sin embargo, que los lípidos usados para formar los liposomas se solubilizan utilizando CHAPS, u otro detergente suave, Y por lo tanto las micelas híbridos resultantes de la mezcla de proteínas y lípidos pueden tener propiedades físico-químicas diferentes de las de los detergentes de los padres. Por tanto, es posible que en algunos casos la eliminación del detergente residual que podría desestabilizar los liposomas que conducen a fugas más pronunciados. Para evitar este problema, es aconsejable para investigar las estrategias de eliminación del detergente alternativos, tales como Biobeads 12,13, columnas de centrifugación de filtración de 15 o 18 gel. Finalmente, la composición lipídica de las vesículas es un parámetro importante como mezclas específicas podrían ser permeable a diferentes iones en ciertas condiciones. Por ejemplo, los liposomas formados a partir de E. extracto lipídico polar coli están apretados a la CL - a pH ácido, pero a ser progresivamente más permeable que el pH aumenta 19 o liposomas formados a partir de una mezcla 3: 1 de 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil-etanolamina (PAPA) y 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilglicerol (POPG) Mostrar una permeabilidad muy inferior a H + que los formados a partir de E. lípido polar coli extraer 20. Es importante tener en cuenta sin embargo, que la composición lipídica de las vesículas también puede afectar a la actividad de la proteína reconstituida 13,21,22. Por lo tanto, es importante determinar con precisión las propiedades de las vesículas libres de proteínas preparados en cada condición y luego para evaluar cómo esto afecta a las propiedades de la proteína reconstituida.
Generalización a los canales de tipo no CLC y transportistas
El ensayo de flujo de salida, como se describe aquí, puede ser utilizada directamente para determinar las propiedades de una sola molécula de cualquier Cl - canal selectivo o transportador, y por ejemplo se ha utilizado para caracterizar las propiedades de la Ca 2 + activado por Cl - canal TMEM16A 12 . Ahora discutimos cómo adaptar el ensayo de flujo de salida para investigar las propiedades de los transportistas o de alamels que no son Cl - selectiva y / o tienen precios de transporte unitarios que son significativamente diferentes del ~ 10 3 iones seg -1 de CLC-ec1.
El caso más simple es que la proteína en estudio es selectiva para los aniones. En este caso, el único ajuste necesario es reemplazar el Ag: electrodo AgCl con un comercialmente disponible uno de selectividad apropiada, como se hizo para el F - Flucs selectivos y CLC 16,23,24 o I - canales permeables tales como CFTR 15 . Si, por otro lado, la proteína reconstituida es selectiva para cationes, un ionóforo distinto de valinomicina tiene que ser utilizado para iniciar el eflujo. Dada la escasez de validado Cl - ionóforos sustituto útil es un H + ionóforo, tales como cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP). En este caso es importante para asegurar que el pH intravesicular se mantiene constante, por ejemplo, aumentando el tampóning capacidad de la solución interna. Una estrategia alternativa es seguir eflujo de cationes a través de un canal o transportador reconstituido mediante el uso de protones como un contraión y el seguimiento de H + de transporte utilizando un medidor de pH 25 o una sonda radiométrica sensible al pH 26. Sin embargo, el carácter indirecto de estas mediciones hace que la cuantificación de las propiedades de transporte de la proteína reconstituida difícil. Por último, electrodos selectivos para un número de cationes existen y están disponibles comercialmente. Un tercer escenario es que la proteína en estudio es permeable tanto a aniones y cationes, por ejemplo un canal poco selectiva 13 o un catión / Cl - cotransportador. En este caso, los liposomas reconstituidos no mantienen un gradiente de KCl durante el proceso de intercambio de solución (pasos 5.4 a 5.5) de manera que pierden su contenido en sal. Por lo tanto en este caso, se pierde toda la información cinética. Sin embargo, la fracción de liposomas que contienen al menos un prot activoein, f 0, puede todavía ser determinada mediante la adición de detergente y medir el residual atrapado Cl - contenido (paso 6.8). Esto permite la determinación de la masa molecular de la proteína mediante la realización de una valoración de proteínas y utilizando la Ecuación 10.
Otro aspecto a tener en cuenta es la posibilidad de que la velocidad de transporte unitario de la proteína reconstituida es órdenes de magnitud diferente de la de CLC-EC1. Por ejemplo, la mayoría de los transportistas tienen tasas de rotación de 1 a 10 seg-1, 2-3 órdenes de magnitud inferior a la CLC-ec1, mientras que la mayoría de los canales de iones de conducta en 10 6 -10 7 seg -1, 3-4.000 veces más rápido que la CVX -ec1. Para los transportistas reducir la tasa de Cl - fuga de liposomas libres de proteínas puede llegar a ser limitante, ya que su peso relativo en el proceso de flujo de salida aumenta a medida que disminuye la velocidad de transporte de la proteína. En nuestra experiencia, la tasa de fuga varía algo entre las preparaciones y es por lo general en el orden de unapocos sec ion -1. Por lo tanto, cuando se trabaja con transportadores lentas, es aconsejable preparar liposomas lado libre de proteína por cada lado a la reconstitución de medir con precisión la fuga correspondiente a cada lote de vesículas. El ensayo de flujo de salida ha sido utilizada con éxito para determinar la tasa unitaria de los transportadores lentos con tasas de rotación alrededor de 1-10 ion seg -1, tales como un CLC 27 cianobacterias. La situación inversa se produce cuando la proteína reconstituida tiene una alta conductividad, por ejemplo un canal de iones. En este caso la cinética de flujo de salida son demasiado rápido para ser resuelto como el tiempo de mezcla (~ 1-2 seg) y el tiempo de respuesta intrínseca del electrodo de registro convertirse en limitante de la velocidad. En este caso, la información cinética se pierde, pero la masa del complejo activo todavía se puede determinar 24. Vale la pena señalar que otros enfoques, tales como grabaciones de bicapa lipídica planar o liposomas de sujeción parche son más adecuados para estudiar canales iónicos purificados como estos techniques proporcionar directamente la información de una sola molécula con alta resolución temporal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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