Introduction
I de to siste tiårene har evnen til å overuttrykker og rense membrantransportproteiner har dramatisk økt: ionekanaler, grunnskoler og videregående transportører er nå rutinemessig renset fra heterologe ekspresjonssystemer samt naturlige kilder. Nye metoder for å overvåke uttrykk, forbedre og legge til rette for utvinning og forbedre stabiliteten av disse proteinene utvikles stadig 1-5. Disse teknologiske gjennombrudd har vært medvirkende i å utløse eksplosjonen av atom-nivå strukturell informasjon på membran proteiner som i sin tur, forbedret vår forståelse av de strukturelle grunnlaget for deres funksjon. I motsetning til vår evne undersøke de funksjonelle egenskaper av de rensede proteiner ikke øke i samme takt, slik at i noen tilfeller med høy oppløsning strukturell informasjon er ledsaget av kvalitative funksjonelle data, og dermed begrense vår evne til kvantitativt å teste strukturbaserte prediksjoner. Derav, development av kvantitative og generaliseres funksjonelle analyser er et viktig skritt mot klarlegging av de mekanistiske fundamentet for membran protein funksjon.
Her beskriver vi en utstrømning assay som kan brukes til å kvantitativt bestemme viktige funksjonelle egenskaper av renset og rekonstituert Cl - kanalene og transportører. Prinsippene som ligger til grunn for analysen kan generaliseres til en rekke transportsystemene, så vel som til ikke-ion-transport av proteiner. Liposomer blir rekonstituert med rensede Cl - kanal / transportører i nærvær av et stort Cl - gradient (figur 1A, B). Cl - utstrømning blir initiert ved tilsetning av en ionofor for å tillate motion fluks, i vårt tilfelle er K + ionofor valinomycin, som shunt spenningen etablert av Cl - gradient og sette den første membranpotensialet til likevektspotensialet i K + 6,7. Uten tHan ionofor ingen vesentlig netto Cl - utstrømning oppstår, da det er hindret ved generering av et transmembranpotensialet. Dataene er kvantitativt beskrevet av to målbare parametere (Figur 1c): τ, er tidskonstanten av Cl - dyseutstrømningen, og f 0, en fraksjon av liposomer som ikke inneholder et aktivt protein. Fra τ og f 0 den enhetlige Cl - ransporthastighet, kan fraksjonen av aktive proteiner, og den molekylære massen av den aktive komplekse utledes 8. Den teknikk som er illustrert her ved hjelp av proteoliposomes rekonstituert med CLC-EC1, et godt karakterisert CLC-type H + / Cl - varmeveksler av kjent oppbygning og funksjon. Denne analysen er lett generaliseres til kanaler eller transportører med forskjellige ioniske selektivitet eller hvis virksomhet er avhengig av nærvær av spenning og / eller ligander. Videre kan denne analysen anvendes for å bestemme om små molekyler direkte påvirke den rekonstituerte protein,for å kvantifisere effekten av disse forbindelsene og hvordan membran sammensetning eller lipid modifiser reagenser påvirke funksjonen av de rekonstituerte kanaler og transportører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipid Forberedelse
- Delmengde ønsket mengde lipider i et klart glass tube. Bruk E. coli polar lipidekstrakt, men de fleste lipid-blandinger kan anvendes. Hvis lipidene er i pulverform, resuspendere dem i kloroform til en konsentrasjon på 20 mg / ml. Tørk lipidene ved RT under N2 gass inntil alt løsningsmidlet er fordampet.
- Resuspender lipidene i pentan og tørker det igjen en jevn strøm av gass N2 for å fjerne restene spor av kloroform. Tørke til alle løsemidler har fordampet. Mens tørking, forsiktig rotere røret slik at lipidet er fordelt i en jevn film som dekker den nedre delen av røret i stedet for en dannelse av en tett masse i bunnen.
- Legg til tilberedning buffer som inneholder vaskemiddel (300 mM KCl, 50 mM sitronsyre, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) å oppløse lipider. Bruk andre milde vaskemidler for dette trinnet dersom proteinet er lite tolerante for CHAPS.
- Resuspend lipidene til klarhet ved hjelp av et vannbad sonikator. Fordyp røret i midten av vannet sonicator bad på maksimal effekt i kort (30 sek-1 min) pulser med kort (30 sek-1 min) pauser. Løsningen skulle bli klart.
MERK: Den endelige grad av klarhet oppnås, avhenger av den spesifikke lipidsammensetningen brukt. Noen batch-til-batch variasjon i dette trinnet, selv blant nominelt identiske lipider, er også mulig. Residual dis skyldes lysspredning av store partikler i suspensjonen, som kan fjernes ved sentrifugering. - Inkuber de resuspenderte lipider ved romtemperatur i 20-60 min.
2. Proteoliposome Formation
MERK: Flere strategier kan anvendes for å sette detergent-solubiliserte protein i liposomer. For CLC-EC1 dialyse fungerer bra og er derfor metoden for valg 6,9,10.
- Legg det rensede protein til det ønskede protein til lipid (P / L) forholdet (uttrykt i ug o f Protein / mg Lipid). Valget av P / L-forhold avhenger av hensikten med forsøket.
- Hvis målet er å vurdere aktiviteten av proteinet av interesse, rekonstitueres ved høyt P / L's for å maksimalisere signal, som hvert liposom inneholder flere kopier av proteinet. For å kvantifisere aktivitet og / eller enhetlig transporthastighet av proteinet, rekonstitueres i en Poisson fortynning regime ved lave P / L's, slik at hver vesikkel inneholder i gjennomsnitt en protein. Se trinn 7 og diskusjon for en mer dyptgående analyse av når du skal bruke hver regime.
- Å bestemme optimale P / L verdier for de ulike regimer, utføre en fullstendig titrering av aktiviteten som en funksjon av protein konsentrasjon 8,11-13. Imidlertid, for en hvilken som helst protein som molekylvekten (MW, uttrykt i kDa) av den aktive enhet er kjent følgende P / L verdier kan benyttes som innledende guesstimates:
pg "/>
- Installering av protein og lipid-blanding i en pre-fuktet dialyserør eller en kassett. Plasser dialyseanordning i et begerglass inneholdende 500-1,000x volumet av lipidet rekonstituering buffer (dvs. en L-buffer i 1 ml av lipid resuspensjon) under forsiktig omrøring.
- Endre buffer 3-4 ganger med intervaller> 3 hr. Ved hver endring løsning, vaske kassetten / røret og begeret med destillert vann og fylle begeret med frisk buffer rekonstituering. Inkluder 1-2 O / N intervaller for løsningen endring. Det nøyaktige antall og varighet av løsningen endringer avhenger av den eksakte lipid og vaskemidler brukes.
- Etter siste trinnet er fullført, fjerner liposomene fra dialyse fartøyet, delmengde dem i rør og flash fryse dem i flytende N2 eller fryse ved -80 ° C.
3. Opptak Set-up
<p class = "jove_content"> MERK: Innspillingen oppsett (Figur 2A) består av to kamre (flatbunnede sylindere, ~ 3-4 ml volum), en Cl - (se nedenfor) elektrode, en pH-meter med en analog eller digital el-effekt, en digitaliserer, og en datamaskin med en passende oppkjøp programvare.- Koble Cl - elektroden til pH-meter, utgangssignalet fra pH-meter til digitaliseringskretsen som er koblet til datamaskinen. Plassere referanseelektroden i et kammer og omkoding wire i den andre (figur 2B).
MERK: polariteten til ledningene er riktig hvis ΔV Cal (se trinn 6.4 og 7.2) er positiv. - Plasser kamrene på oppsikt plate med en rørepinne i innspillingen kammeret (figur 1B). Kontroller at oppsikt bar ikke berører elektroden.
- Forbinde kamrene ved hjelp av en agar broen (figur 2B) (100 mM KCl, 2% agarose). Oppbevar Agar broer i 100 mM KCl.
4. Klargjøring av Cl - elektrode
- Ta en gammel og -possibly- ikke-fungerende pH-elektrode. Knuse glasset belegg for å helt avsløre sølvtråder.
- Fjern forsiktig belegget fra sølvtråder ved hjelp av et skalpellblad. Rengjør ledningene ved hjelp av store mengder H 2 O og EtOH.
- Plasser i en mettet oppløsning av FeCl3 (eller blekemiddel) inntil trådene er dekket med et jevnt lag med mørk AgCl.
5. Fremstilling av unilamellære vesikler
- Natten før forsøkene, hovne opp 1 g av Sephadex G-50 perler i 15 ml ekstern buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM sitronsyre, pH 4,5) med forsiktig risting (ikke røre) for på minst 3 timer ved romtemperatur før bruk. Hvert eksperiment krever ~ 3 ml svellede perler. Hold hovne perler ved 4 ° C i noen dager på det meste.
- Mens liposomene tining ved RT, hell i kolonne ~ 3 m hverl av hovne G-50 perler. La dem tørke av tyngdekraften flyt ved RT; Dette tar vanligvis 1-2 minutter.
- Forbered unilamellære vesikler ved ekstrudering de proteoliposomes 11 ganger gjennom en Mini-Extruder ved hjelp av en 0,4 m Teflon cutoff.
- Plasser kolonnen i en plastrundbunnet rør. Spinne kolonnene for å fjerne overflødig løsning. Sentrifuger i 20 til 30 sek ved 1.400 x g i en klinisk sentrifuge.
- Kast gjennomstrømning, sted kolonne i en 13 x 100 mm glassrør og tilsett 100 ul av de ekstruderte vesikler til kolonnen. Spin-kolonne i 1 min ved 500 x g i en klinisk sentrifuge.
- Samle ~ 200 ul av gjennomstrømning som vil bli lagt til opptakskammeret i trinn 6.5.
6. utstrømning Måling
- Plassere 2 ml av 100 mM KCl i referanse (jord) kammer og 1,8 ml av den ytre buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM sitronsyre, pH 4.5) til opptakskammeret. Den liten osmotisk ubalanse mellom det indreog eksterne løsninger påvirker ikke
- Starte kjøp program. La baseline likevekt, dette kan ta noen minutter.
- Når signalet når en stabil baseline (liposomene er klare og kolonnene tørke), starte opptak (figur 3A).
- Tilsett 15 pl av en 10 mM KCl-oppløsning for å kalibrere systemet (figur 2A).
- Legg liposomer. Et lite hopp kan være synlig på grunn av ufullstendig fjerning av ekstern Cl - fra proteoliposomes (figur 3A). Vent til baseline stabiliseres.
- Legg valinomycin (1 ul 1 mg / ml i EtOH) for å initiere dyseutstrømningen (figur 3A).
- La utstrømming gå sin gang kurs till det platåer (figur 3A).
- Legg 40 ul 1,5 M β-oktylglukosid (β-OG) fremstilt i den ytre buffer for å oppløse alle liposomer (figur 3a). Avslutte innspillingen.
7. Data Analysis
- Eksportere sporingsfilen fra i en ascii eller tekst format og importere den til analyse program av valget.
- Mål spenningen på følgende punkter (figur 3A):
Ved begynnelsen av opptaket (V 0);
Etter tilsetning av kalibreringspulsen (V kal);
Etter tilsetning av liposomene (V lipo);
Ved slutten av den sekretoriske (V fin);
Etter tilsetting av vaskemiddel (V tot);
Baseline spenningene slik at V 0 = 0. - Bruk av Nernst-ligningen for å bestemme Plank den eksperimentelle verdi av
ved å måle 
Hvor Vol Cal er volumet av kalibreringspulsen i ul, 1,800 er kammervolumet ved begynnelsen av forsøket uttrykt i1; l, [Cl] cal / i er den Cl - konsentrasjoner av kalibrerings puls og av den eksterne buffer i mM og ΔV cal er jump i mV målt etter kalibreringen puls.
MERK: Dette empirisk bestemmelse av α har tre hensikter: det sikrer at systemet reagerer slik den skal, og tilbyr et mål på konsistensen av instrumentets respons mellom eksperimenter, samt å kontrollere at ingen feil ble gjort i løsningen gjør. - Beregn Cl konsentrasjoner etter hvert trinn som følger:
Faktoren 3/400 kommer fra fortynning av 15 ul kalibreringspuls inn i 2000 ul sluttvolum. - Calculspiste endringene i [Cl] på hvert trinn, ΔCl lipo / fin / tot.
- Konverter V (t) i Cl (t) med
Direkte bestemme [Cl] verdier på de kritiske punktene og sammenligne dem med de beregnede verdier som en intern kontroll. - Normalisere spor slik at Cl rel lipo = 0 og Cl rel tot = 1
- Monter efflux tidsforløpet til følgende ligning:
Hvor L er frekvensen av Cl - lekkasje som er eksperimentelt bestemt ved å måle Cl - utstrømning fra proteinfrie liposomer fremstilt under de samme betingelser og τ er tidskonstanten for prosessen. - Beregn v, den innledende hastighet:
Hvor ΔCl finnen er uttrykt i millimolar og V er volumet av kammeret i ul. - Beregne transport hastighet / ledningsevne
Hvor p er P / L, er MW molekylvekten til den aktive kompleks uttrykt i kDa
ved å måle 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en detaljert og robust protokoll for å måle Cl - transport mediert av renset CLC-EC1, en prokaryote CLC-type H + / Cl - leren, rekonstruert i liposomer. En skjematisk fremstilling av forsøket er vist i figur 3 Proteoliposomes rekonstituert med renset CLC-EC1 og inneholder høy intern Cl -. Er nedsenket i et bad oppløsning inneholdende lav Cl -. Under disse betingelser net Cl - utstrømning hindres ved oppbygging av positiv ladning i liposomen (figur 3A). Tilsetting av valinomycin gjør K + for å flytte over membranen dermed skifte det elektriske potensialet og initiere Cl - utstrømming (Figur 3B). Fluksen tidsforløp ble overvåket ved bruk av en Cl - selektiv elektrode og den totale mengden av Cl - som inneholdes i vesiklene er direkte målt ved oppløsning av dem ved hjelp av detergent. Fra dissebulk eksperimenter er det mulig å bestemme egenskapene til de enkelt rekonstituerte proteiner, slik som omløpshastighet, støkiometri av den aktive komplekse og brøkdel av aktivt protein. Ved hjelp av ligninger 7-9 å passe effluks tidsforløp og anslå enhetlig transporthastighet for CLC-EC1 vi finner ut at τ (0,2 mikrogram / mg) = 41 sek og f 0 (0,2 mikrogram / mg) = 0,31, noe som indikerer at ~ 1 / 3 av liposomene inneholder 0 aktive proteiner. Fra disse verdier beregner vi at den enhetlige transportraten er γ ~ 2500 Cl - sek -1, i god overensstemmelse med publiserte verdier 8,14.
Figur 1: Cl - utstrømming analysen (A - B) Skjematisk fremstilling av Cl - -efflux analyse for proteinfrie liposomer (A) eller CLC-EC1.rekonstituert vesikler (b). (C) Simulert tid løpet av ionofor initiert Cl - utstrømming fra proteoliposomes (svarte) eller proteinfrie liposomer (grå stiplet linje). Effluks blir initiert ved tilsetning av ionofor (*) og avsluttet ved tilsetning av detergent å oppløse liposomene (^). Rød stiplet linje er en eksponentiell skikket til å bestemme tidspunktet konstant, τ, Cl -. Utstrømming fra liposomer som inneholder minst en aktiv kopi av CLC-EC1 og f 0 er brøkdel av liposomer som inneholder 0 aktive proteiner Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Innspilling satt opp (A) Innspillingen satt opp.. (B) Nærbilde av kamrene. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempel på spor og analyse (A) Typisk V (t) spor av utstrømningshastigheter eksperimenter fra proteoliposomes rekonstituert med WT CLC-EC1 på 0,2 mikrogram / mg P / l.. Piler angir tidspunktene for tilsetning av KCl kalibreringspulsen, liposomer, valinomycin og β-OG. Stiplede linjer angir de ΔV verdier på ulike stadier. (B) V (t) spor omdannes til Cl (t) ved bruk av ligning 5, normalisert ved bruk av ligning 6 og utstrømningen tidsforløpet er skikket til ligning 7 (rød stiplet linje). (C) Normalisert utstrømningshastigheter gang kurs fra proteoliposomes rekonstituert med WT CLC-EC1 på 0,2 mikrogram / mg P / L (svart) eller på 5 mikrogram / mg P / L (grå). Stiplet linjes er best passer for de utstrømming gang kurs til ligning 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en detaljert protokoll for å måle Cl - transport mediert av rensede anion-selektiv kanaler eller transportører rekonstituert i liposomer. Eksempelet som ble brukt var prokaryote H + / Cl - veksler CLC-EC1. Imidlertid kan metoden lett tilpasses for å studere kanaler styrt av ligander 12,13,15, 11,12 spenning, eller sports forskjellige anioniske selektivitet 15,16 ved å erstatte Ag: AgCl-elektrode med en egnet for det ion som betraktes. Elektroder selektiv for ioner andre enn Cl -, såsom H +, I - og F -, er kommersielt tilgjengelige.
En diskusjon av noen av de kritiske trinn og forutsetninger følge.
Grensene for Poisson fortynning antakelsen
Avledning av enhetlig sats (ligning 7-9) er bare gyldig i en Poisson fortynning regime, når de fleste liposomer fortsain bare ett aktivt protein, slik at sannsynligheten for å ha flere kopier i en gitt vesikkel er lav og det makroskopiske effluks tidskonstanten til vesikkel populasjonen er godt tilnærmet ved at av liposomer inneholdende et enkelt protein. Faktisk er en sammenligning av Cl - dyseutstrømningen tidsforløpet mediert av liposomer rekonstituert med CLC-EC1 ved lave (svart, 0,2 ug / mg) og høyt P / L (grå, 5 ug / mg) (figur 3C) viser at i det sistnevnte tilfelle i dyseutstrømningen kinetikk blir raskere og f 0 avtar, noe som indikerer at en mindre del av de totale liposomer inneholder 0 proteiner. Den totale mengden av Cl - som inneholdes i begge vesikkel prøvene var sammenlignbare, ~ 0,7 og ~ 0,55 pmol svis, noe som indikerer at den totale innvendige volum av vesiklene i de to prøvene var lik, og at mengden av protein rekonstituert ikke påvirker størrelsen vesikler. Montering av høy P / L utstrømning tidsforløpet til ligning 7 produserer verdier av τ , (5 ug / mg) = 8,8 sek og f 0 (5 ug / mg) = 0,06, noe som indikerer at bare ~ 6% av vesiklene inneholde noen aktive CLC-EC1 dimerer, i motsetning til ~ 31% funnet når P / L = 0,2 mikrogram / mg. Således er anslaget på den enhetlige omsetningshastighet ved høye P / L γ ~ 450 Cl - sek -1, nesten seks ganger lavere enn den som oppnås ved lave P / L og av publiserte data 8,14. Derfor analyse av utstrømningshastigheter gang kurs fra liposomer rekonstituert med høy P / L's vil undervurdere den enhetlige transporthastighet for rekonstituert protein. Derfor, for å nøyaktig bestemme den enhetlige transporthastighet for et nytt protein det er av avgjørende betydning for nøyaktig å bestemme mengden av protein og rekonstituert til å arbeide ved lave P / L's, i en Poisson fortynning regime. Dette er ideelt oppnås ved å bestemme en full protein titrering analyse for å identifisere den optimale regime for å arbeide ved.
Bestemmelse av massen av den aktive komplekse
telt "> Analysen som er beskrevet ovenfor forutsetter at støkiometrien av det aktive komplekset er kjent, og det rekonstituerte protein er fullt aktiv. Men for nye preparater slike mengder at de ikke kan være kjent a priori. I dette tilfelle er det mulig å direkte bestemme disse parameterne ved å måle f 0 's ved forskjellig protein til lipidforhold
der p er tettheten protein, 
Er ρ antall liposomer pr massen av lipid, er N A Avogadros tall, M P er massen av den funksjonelle kanalkomplekset og φ er andelen av aktive proteiner. Ved å montere den eksperimentelt bestemte f 0 's på ulike protein til lipidforhold er det poslig å bestemme p 0, og derfor M P og φ.
Et endelig fraksjon av liposomer ikke kan behandles med inkorporering
Avledning av den enhetlige transporthastighet forutsetter at ved høye P / L's alle liposomer vil inneholde minst ett aktivt transportprotein. Men i noen tilfeller har dette vist seg ikke å være tilfelle: ved høy P / L's en betydelig andel av liposomer forblir ildfast til tilberedning av noen proteiner 11-13,17. Mens opprinnelsen til dette fenomenet er ikke klart det kan tenkes at større proteiner kan bli ekskludert fra vesikler med mindre radier og dermed redusere antall tilgjengelige liposomer.
I dette tilfelle ligning 10 må modifiseres til: 
hvor θ er brøkdel av liposomer ildfaste å Proteinkonn innlemmelse. Viktigere, ρ og φ er også påvirket av tilberedning metoden siden ulike prosedyrer vil ha ulike inngang for lipider og proteiner i løpet av liposomer rekonstitusjon og dannelse. Forutsatt 100% utbytte for begge vil føre til en feilvurdering av γ. Derfor, for å oppnå en nøyaktig kvantifisering av den enhetlige omsetningen / konduktans er det viktig å eksperimentelt bestemme den brøkdel av lipid og protein tapt under rekonstituering 8,11.
Orientering av de rekonstituerte proteiner
En av forutsetningene i analysen er at alle rekonstituert proteiner er tilsvarende funksjonalitet. Imidlertid har mange kanaler og transportører foretrukne retninger av transporter, et fenomen kjent som utbedring. Dette funksjonelle asymmetri kan føre til en estimering feil i omløpshastighet. Videre er retningen av de rekonstituerte proteiner a priori + graderinger, for kanaler eller transportører som er ligand- eller spenningsavhengig.
Betraktninger om dannelsen av trange liposomer
En av de viktigste faktorene som muliggjør bruken of effluks analysen beskrevet her, er dannelsen av tette liposomer. Tre viktige variabler som må vurderes for å oppnå dette er valget av vaskemiddel som brukes for å oppløse proteinet, detergent-fjernelse strategi og valget av lipid-sammensetningen av liposomene. I protokollen som presenteres her, er CLC-EC1 oppløst i Decyl-maltopyranosid (DM), et vaskemiddel med en høy kritiske micellekonsentrasjon (CMC) verdi som er derfor lett å fjerne. Imidlertid har en rekke syntetiske og naturlig forekommende vaskemidler blitt brukt til å rense proteiner som senere ble rekonstituert i trange liposomer uten effekter på tetthet av blemmer. Disse vaskemidler har et bredt spekter av CMC, så høyt som millimolar (for eksempel DM eller Digitonin) og så lavt som mikromolar (slik som dodecyl- maltopyranosid (DDM) eller dioctylpropane-bis-maltopyranosid (DMNG)). Det er viktig å merke seg at lipidene anvendt for å danne liposomene blir løst ved hjelp av CHAPS, eller et annet mildt vaskemiddel, Og derfor de hybride miceller som stammer fra blanding av protein og lipider kan ha fysikalsk-kjemiske egenskaper som er forskjellige fra de av de overordnede vaskemidler. Det er derfor mulig at i noen tilfeller den resterende fjerning av vaskemiddel som kunne destabilisere liposomene som fører til mer uttalt lekkasjer. For å omgå dette problemet er det tilrådelig å undersøke alternative fjerning vaskemiddel strategier, for eksempel biobeads 12,13, spin kolonner 15 eller gel filtrering 18. Endelig er lipid-sammensetningen av vesikler en viktig parameter som spesifikke blandinger kan være utett til forskjellige ioner i visse forhold. For eksempel er liposomer dannet fra E. coli polar lipidekstrakt er stramme til cl - ved sure pH-verdier, men blir progressivt mer utett når pH øker 19 eller liposomer dannet fra en 3: 1 blanding av 1-palmitoyl-2-oleoyl fosfatidyl-etanolamin (POPE) og 1-palmitoyl 2-oleoyl fosfatidylglycerol (POPG) Viser en mye lavere permeabilitet til H + enn de som er dannet fra E. coli polar Lipidekstrakt 20. Det er viktig å merke seg imidlertid at det lipid-sammensetningen av vesiklene kan også påvirke aktiviteten av det rekonstituerte protein 13,21,22. Således er det viktig å nøyaktig bestemme egenskapene til de proteinfrie vesikler fremstilt i hver tilstand og deretter å vurdere hvordan dette påvirker egenskapene til det rekonstituerte protein.
Generalisering til ikke CLC-typen kanaler og transportører
Effluks assay, som beskrevet her, kan bli direkte benyttet for å bestemme de enkelt molekyl egenskaper av ethvert Cl - selektiv kanal eller transportør, og for eksempel er brukt for å karakterisere egenskapene til Ca2 + -aktiverte Cl - kanal TMEM16A 12 . Vi nå diskutere hvordan vi skal tilpasse utstrømming analyse for å undersøke egenskapene til transportører eller flaels som ikke Cl - selektiv og / eller har enhetlige transport priser som er vesentlig forskjellig fra den ~ 10 3 ion sek -1 av CLC-EC1.
Det enkleste tilfelle er at proteinet som studeres er anion-selektiv. I dette tilfelle er det bare nødvendig tilpasning for å erstatte Ag: AgCl-elektrode med et kommersielt tilgjengelig et av passende selektivitet, slik det ble gjort for F - selektive Flucs og CLCs 16,23,24 eller I - gjennomtrengelige kanaler som CFTR 15 . Dersom, på den annen side, er selektive for kationer det rekonstituerte protein, har en ionofor enn valinomycin som skal brukes for å initiere effluks. Gitt mangelen på validert Cl - ionoforer en nyttig erstatning er en H + ionofor, for eksempel Carbonyl cyanid 4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone (FCCP). I dette tilfellet er det viktig å sikre at intravesikulær pH holdes konstant, for eksempel ved å øke buffering kapasiteten av den interne oppløsning. En alternativ strategi er å følge kation utstrømning gjennom en rekonstituert kanal eller transporter ved hjelp av protoner som et motion og overvåking H + transport ved hjelp av et pH-meter 25 eller en proporsjonal pH-sensitive sonde 26. Imidlertid er naturen av disse indirekte målinger gjengir kvantifisering av transportegenskapene til det rekonstituerte protein vanskelig. Til slutt, elektroder som er selektive for en rekke kationer eksisterer og er kommersielt tilgjengelige. En tredje situasjon er at proteinet som studeres er gjennomtrengelig for både anioner og kationer, for eksempel en dårlig selektiv kanal 13 eller et kation / Cl - kotransporter. I dette tilfelle har de rekonstituerte liposomer ikke opprettholde en KCl-gradient i løpet av løsningen vekslingsprosess (trinn 5.4 til 5.5), slik at de mister sin saltinnhold. Derfor all kinetisk informasjon går tapt i dette tilfellet. Imidlertid brøkdel av liposomer inneholdende minst ett aktivt protein, f 0, kan fortsatt bli bestemt ved tilsetning av detergent og måling av den gjenværende fanget Cl - innhold (trinn 6.8). Dette gir mulighet for bestemmelse av molekylvekt av proteinet ved å utføre en protein-titrering og ved å bruke ligning 10.
Et annet aspekt å vurdere er muligheten for at enhetlig transporthastighet for rekonstituert protein er størrelsesordener forskjellige fra det av CLC-EC1. For eksempel, de fleste transportører har omsetning priser av 1-10 sek -1, 2-3 størrelsesordener lavere enn CLC-EC1, mens de fleste kanaler gjennomføre ioner ved 10 6 -10 7 sek -1, 3-4,000 ganger raskere enn CLC -ec1. For treg transportører hastigheten av Cl - lekkasje fra proteinfrie liposomer kan bli begrensende, som sin relative vekt i utstrømming prosessen øker som protein transport rate avtar. I vår erfaring lekkasjerate varierer noe mellom forberedelser og er vanligvis i størrelsesorden enfå ion sek -1. Derfor, når man arbeider med langsomme transportører er det tilrådelig å fremstille proteinfritt liposomer ved siden av hverandre til hver rekonstituering å måle lekkasjen svarende til hvert parti av vesikler. Effluks analysen har blitt brukt til å bestemme enhetlig sats på langsomme transportører med omsetning priser rundt 1-10 ion sek -1, for eksempel en cyanobacterial CLC 27. Den omvendte situasjon oppstår når det rekonstituerte protein har en høy ledningsevne, for eksempel en ione-kanal. I dette tilfellet i dyseutstrømningen kinetikken er for hurtig til å bli løst som blandetiden (~ 1-2 sek), og den indre reaksjonstiden for opptak elektroden blir hastighetsbegrensende. I dette tilfellet blir den kinetiske informasjon tapt, men massen av det aktive komplekset kan fortsatt bli bestemt 24. Det er verdt å merke seg at andre tilnærminger, som planar lipidbllag opptak eller patch klem liposomer er mer egnet til å studere rensede ionekanaler som disse techniques direkte gi enkelt molekyl informasjon med høy tidsoppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
