Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور Published: April 20, 2015 doi: 10.3791/52369
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

Introduction

في اثنين العقود الماضية القدرة على بإفراط وتنقية البروتينات النقل الغشاء قد زاد بشكل كبير: القنوات الأيونية، والآن تنقيته النقل الابتدائية والثانوية بشكل روتيني من النظم التعبير مغاير وكذلك المصادر الطبيعية. ويجري باستمرار تطوير مناهج جديدة لمراقبة التعبير، وتحسين وتسهيل استخراج وتعزيز الاستقرار من هذه البروتينات 1-5. وكانت هذه الاختراقات التكنولوجية دورا أساسيا في إحداث انفجار المعلومات الهيكلية المستوى الذري على بروتينات الغشاء الذي، بدوره، وتعزيز فهمنا للقواعد الهيكلية وظيفتها. في المقابل، فإن قدرتنا على تحقيق في الخصائص الوظيفية لبروتينات المنقى لا تزيد بنفس المعدل، حتى أنه في بعض الحالات ويرافق المعلومات الهيكلية عالية الدقة من خلال بيانات وظيفية نوعية، مما يحد من قدرتنا على اختبار كميا التنبؤات القائمة على بنية. وبالتالي، فإن التنطن من المقايسات الفنية الكمية وتعميم هو خطوة رئيسية نحو استجلاء هذه الأسس الميكانيكية للوظيفة البروتين الغشاء.

نحن هنا وصف مقايسة هروب رأس المال التي يمكن استخدامها لتحديد كميا الخصائص الفنية الرئيسية لتنقية وإعادة تشكيل الكلور - القنوات والنقل. المبادئ الأساسية للمقايسة يمكن تعميمها على مجموعة متنوعة من أنظمة النقل، فضلا عن البروتينات غير نقل أيون. وأعيد الجسيمات الشحمية مع تنقية الكلور - قناة / النقل في وجود الكلور كبير - التدرج (الشكل 1A، B). CL - يبدأ هروب رأس المال من خلال إضافة لحامل الأيون للسماح لتدفق مكافحة أيون، في حالتنا K + حامل الأيون valinomycin، الذي إنتقل الجهد الذي أنشأه الكلور - التدرج وتعيين غشاء المحتملة الأولية إلى إمكانية التوازن K + 6،7. دون رانه حامل الأيون لا صافي الكلور كبير - يحدث هروب رأس المال، كما منعت من قبل جيل من إمكانات عبر الغشاء. وكميا وصف البيانات بواسطة معلمتين قابلة للقياس (الشكل 1C): τ، ثابت وقت الكلور - هروب رأس المال، وو 0، وجزء من الجسيمات الشحمية لا تحتوي على البروتين النشط. من τ وو 0 من الكلور الوحدوي - معدل النقل، وجزء من البروتينات النشطة والكتلة الجزيئية للمجمع نشط يمكن أن تستمد 8. ويتضح هنا باستخدام تقنية proteoliposomes تشكيلها مع CLC-EC1، وتتميز كذلك CLC من نوع H + / CL - مبادل من هيكل معروف وظيفة. وتعميم هذا الاختبار بسهولة إلى قنوات أو النقل مع مختلف الانتقائية الأيونية أو التي تعتمد على وجود التيار الكهربائي و / أو بروابط النشاط. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد ما إذا جزيئات صغيرة تؤثر بشكل مباشر على البروتين المعاد،ل quantitate آثار هذه المركبات وكيفية تكوين غشاء أو الكواشف-تعديل المادة الدهنية تؤثر على وظيفة من القنوات وشركات النقل تشكيلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الدهون

  1. قسامة الدهون المبلغ المطلوب في أنبوب الزجاج واضحة. أنت ترى. القولونية استخراج الدهون القطبي، ولكن معظم التراكيب الدهون يمكن استخدامها. إذا كانت الدهون هي في شكل مسحوق، و resuspend لهم في الكلوروفورم إلى تركيز من 20 ملغ / مل. تجفيف الدهون في RT تحت N 2 الغاز حتى يتبخر كل المذيبات.
  2. Resuspend والدهون في البنتان وجففها مرة أخرى وجود تدفق مستمر من الغاز N 2 لإزالة بقايا آثار من الكلوروفورم. الجاف حتى تبخرت كل المذيبات. بينما التجفيف، وتناوب بلطف الأنبوب بحيث يتم توزيع الدهون في فيلم موحدة تغطي ثلث السفلي من أنبوب بدلا من تشكيل كتلة كثيفة في الجزء السفلي.
  3. إضافة المخزن المؤقت إعادة تحتوي المنظفات (300 ملي بوكل، 50 ملي حمض الستريك، 25 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 4.5، 35 ملي CHAPS) لإذابة الدهون. استخدام المنظفات معتدل الأخرى لهذه الخطوة إذا كان البروتين هو متسامح سيئة لCHAPS.
  4. Resuspenد الدهون إلى الوضوح باستخدام sonicator حمام الماء. تزج الأنبوب في وسط sonicator باث الماء في أقصى قدر من السلطة وباختصار (30 ثانية-1 دقيقة) نبضات قصيرة (30 ثانية-1 دقيقة) مؤقتا. وينبغي أن تصبح الحل واضح.
    ملاحظة: درجة النهائية من الوضوح حققت تعتمد على تكوين الدهون المحددة المستخدمة. بعض الاختلاف دفعة إلى دفعة في هذه الخطوة، حتى بين الدهون متطابقة اسميا، ممكن أيضا. ومن المقرر أن تشتت الضوء من قبل الجزيئات الكبيرة في التعليق، والتي يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي الضباب المتبقية.
  5. احتضان الدهون معلق في RT 20-60 دقيقة.

2. تشكيل Proteoliposome

ملاحظة: العديد من الاستراتيجيات التي يمكن أن تستخدم لادخال البروتين المنظفات تذوب في الجسيمات الشحمية. لCLC-EC1 غسيل الكلى يعمل بشكل جيد وبالتالي فهي طريقة اختيار 6،9،10.

  1. إضافة البروتين النقي إلى المطلوب البروتين إلى الدهون (P / L) نسبة (معبرا عنها ميكروغرام س و البروتين / ملغ الدهون). اختيار نسبة P / L يعتمد على الغرض من التجربة.
    1. إذا كان الهدف هو تقييم النشاط من البروتين من الفائدة، وإعادة تشكيل في ارتفاع P / L'الصورة لتعظيم إشارة، حيث أن كل الحويصلية تحتوي على نسخ متعددة من البروتين. لقياس النشاط و / أو معدل النقل الوحدوي من البروتين، وإعادة تشكيل في نظام التخفيف بواسون في انخفاض P / L'الصورة، بحيث يكون لكل حويصلة تحتوي في المتوسط ​​1 البروتين. راجع الخطوة 7 و مناقشة لأكثر في عمق تحليل متى تستخدم كل نظام.
  2. لتحديد القيم المثلى P / L لمختلف الأنظمة، إجراء المعايرة كاملة من النشاط بوصفها وظيفة من تركيز البروتين 8،11-13. ومع ذلك، لأي البروتين التي الوزن الجزيئي (MW، أعرب في كيلو دالتون) وحدة نشطة هو معروف يمكن استخدام القيم L P / التالية كما تخمينات أولية:
    خريج "/>
    المعادلة 2
  3. تحميل البروتين والدهون الخليط في أنبوب غسيل الكلى قبل المبللة أو الكاسيت. وضع الجهاز غسيل الكلى في دورق يحتوي على 500-1،000x حجم المخزن المؤقت الدهون إعادة (أي 1 L عازلة لل1 مل من الدهون إعادة تعليق) تحت التحريك لطيف.
    1. تغيير عازلة 3-4 مرات على فترات> 3 ساعة. في كل تغيير الحل، وغسل كاسيت / أنابيب والكأس مع الماء المقطر وملء كوب مع العازلة إعادة الطازجة. تشمل 1-2 O / N فترات لتغيير الحل. يعتمد العدد الدقيق ومدة التغيرات حل على الدهون الدقيق والمنظفات المستخدمة.
  4. بعد الخطوة الأخيرة هي كاملة، وإزالة الجسيمات الشحمية من السفينة غسيل الكلى، وقسامة لهم في أنابيب وفلاش تجميد لهم في السائل N 2 أو التجميد في -80 ° C.

3. تسجيل مجموعة المتابعة

<ص الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: تسجيل انشاء (الشكل 2A) ويتكون من مجلسين (اسطوانات مسطحة القاع، ~ 3-4 حجم مل)، والكلور - (انظر أدناه) الكهربائي، ودرجة الحموضة متر مع التناظرية أو الإخراج الرقمي الكهربائية، والتحويل الرقمي، وجهاز كمبيوتر مع برنامج الحصول المناسب.

  1. ربط الكلور - القطب إلى متر الرقم الهيدروجيني، والإخراج للمتر الرقم الهيدروجيني إلى التحويل الرقمي التي يتم توصيلها إلى الكمبيوتر. وضع القطب المرجع في غرفة واحدة وسلك إعادة ترميز في الآخرين (الشكل 2B).
    ملاحظة: قطبية من الأسلاك هو الصحيح إذا ΔV كال (انظر الخطوة 6.4 و 7.2) موجبة.
  2. ضع غرف على طبق من ذهب ضجة مع بقضيب في تسجيل غرفة (الشكل 1B). تأكد من أن بقضيب لا تلمس القطب.
  3. ربط الدوائر باستخدام جسر أجار (الشكل 2B) (100 ملي بوكل و 2٪ الاغاروز). تخزين الجسور أجار في 100 ملي بوكل.

    4. إعداد الكلور - الكهربائي

    1. خذ غير عاملة القطب درجة الحموضة القديم و-possibly-. كسر طلاء الزجاج لتكشف تماما أسلاك الفضة.
    2. إزالة بعناية طلاء من الأسلاك الفضة باستخدام شفرة المشرط. تنظيف الأسلاك باستخدام كميات وفيرة من H 2 O وETOH.
    3. يتم تغطية مكان في محلول مشبع من FeCl 3 (أو التبييض) حتى الأسلاك مع معطف الظلام موحد للأجكل.

    5. إعداد Unilamellar الحويصلات

    1. في الليلة التي سبقت التجارب، تنتفخ 1 غرام من باستخدام Sephadex-50 حبات في 15 مل من العازلة الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) مع طيف والهز (لا يحرك) ل على الأقل 3 ساعة على RT قبل الاستخدام. كل تجربة تتطلب ~ 3 مل من الخرز منتفخة. الحفاظ على حبات منتفخة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أيام على الأكثر.
    2. في حين أن الجسيمات الشحمية والذوبان في RT، صب في كل عمود ~ 3 ملتر من تورم G-50 الخرز. السماح لهم الجافة قبل تدفق الجاذبية في RT. هذا عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة.
    3. إعداد الحويصلات unilamellar بواسطة البثق في proteoliposomes 11 مرة من خلال ميني الطارد باستخدام قطع 0.4 م تفلون.
    4. وضع عمود في أنبوب الجولة القاع من البلاستيك. تدور الأعمدة لإزالة حل الزائد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20-30 ثانية في 1،400 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
    5. تجاهل التدفق من خلال عمود مكان في 13 × 100 مم أنبوب زجاجي وإضافة 100 ميكرولتر من الحويصلات مقذوف إلى العمود. تدور العمود لمدة 1 دقيقة في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
    6. جمع ~ 200 ميكرولتر من التدفق من خلال التي ستضاف إلى غرفة تسجيل في الخطوة 6.5.

    6. الدفق القياس

    1. ضع 2 مل من 100 ملي بوكل في إشارة الغرفة (الأرض) و 1.8 مل من المخزن المؤقت الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) إلى غرفة تسجيل. عدم التوازن الاسموزي طفيف بين الداخليةوالحلول الخارجية لا يؤثر
    2. بدء تشغيل البرنامج الاستحواذ. السماح للخط الأساس تتوازن، وهذا قد يستغرق بضع دقائق.
    3. وبمجرد وصول إشارة خط الأساس مستقرة (والجسيمات الشحمية جاهزة والأعمدة الجافة)، بدء التسجيل (الشكل 3A).
    4. إضافة 15 ميكرولتر من 10 ملي بوكل حل لمعايرة نظام (الشكل 2A).
    5. إضافة الجسيمات الشحمية. قفزة صغيرة قد تكون واضحة بسبب إزالة كاملة من الكلور خارجي - من proteoliposomes (الشكل 3A). الانتظار حتى تستقر خط الأساس.
    6. إضافة Valinomycin (1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل في ETOH) لبدء هروب رأس المال (الشكل 3A).
    7. السماح للهروب رأس المال مجراها وقته حتى أنه الهضاب (الشكل 3A).
    8. إضافة 40 ميكرولتر من 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) التي أعدت في المخزن المؤقت الخارجي على حل جميع الجسيمات الشحمية (الشكل 3A). إنهاء التسجيل.

    7. البيانات Analysis

    1. تصدير ملف التتبع من في شكل ASCII أو النص واستيراده إلى برنامج تحليل الاختيار.
    2. قياس الجهد في النقاط التالية (الشكل 3A):
      في بداية التسجيل (V 0)؛
      بعد إضافة نبض معايرة (V كال)؛
      بعد إضافة الجسيمات الشحمية (V يبو)؛
      في نهاية هروب رأس المال (V زعنفة)؛
      بعد إضافة المنظفات (V TOT)؛
      خط الأساس الفولتية بحيث V 0 = 0.
    3. استخدام معادلة نرنست-بلانك لتحديد القيمة التجريبية ل المعادلة 3 عن طريق قياس
      المعادلة 4
      حيث المجلد كال هو حجم نبض المعايرة في ميكرولتر، 1،800 وحجم الغرفة في بداية أعربت التجربة في1؛ ل، [الكلور] كال / في هم الكلور - تركيزات نبض المعايرة والمخزن المؤقت الخارجي في ملي وΔV كال هو قفزة في بالسيارات قياسها بعد نبض المعايرة.
      ملاحظة: هذا التحديد التجريبي للα يخدم ثلاثة أغراض: أنه يضمن أن النظام يستجيب بشكل صحيح، ويقدم مقياسا لاتساق استجابة الصك بين التجارب وكذلك للتأكد من أن تم إجراء أية أخطاء في صنع الحل.
    4. حساب تركيزات الكلور بعد كل خطوة على النحو التالي:
      المعادلة 5
      المعادلة 6
      المعادلة 7
      عامل 3/400 يأتي من التخفيف من 15 ميكرولتر معايرة النبض في الحجم النهائي 2،000 ميكرولتر.
    5. CALCULيأكل من التغيرات في [الكلور] في كل خطوة، ΔCl يبو / الزعانف / طفل.
    6. تحويل V (ر) في الكلورين (ر) مع
      المعادلة 8
      تحديد مباشرة [الكلور] القيم في النقاط الحرجة ومقارنتها مع القيم المحسوبة باعتبارها الرقابة الداخلية.
    7. تطبيع التتبع بحيث يبو الكلور يختلط = 0 و الكلور يختلط TOT = 1
      المعادلة 9
    8. تناسب دوام هروب رأس المال إلى المعادلة التالية:
      المعادلة 10
      حيث L هو معدل الكلور - تسرب أن يتم تحديد تجريبيا من خلال قياس الكلور - هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية خالية من البروتين أعدت في نفس الظروف وτ هو ثابت وقت العملية.
    9. حساب الخامس، سرعة الأولية:
      حيث يتم التعبير عن ΔCl زعنفة في millimolar وV هو حجم الغرفة في ميكرولتر.
    10. حساب معدل النقل / تصرف
      المعادلة 12
      حيث p هو P / L، MW هو الوزن الجزيئي للمجمع نشط أعرب في كيلو دالتون

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وصفنا بروتوكول مفصلة وقوية لقياس الكلور - النقل بوساطة النقى CLC-EC1، وبدائيات النواة من نوع CLC H + / CL - مبادل، تشكيلها في الجسيمات الشحمية. ويرد التمثيل التخطيطي للتجربة في الشكل 3 Proteoliposomes تشكيلها مع النقى CLC-EC1 والتي تحتوي على الكلور عالية الداخلي - مغمورة في محلول يحتوي على حمام منخفض الكلور -. في ظل هذه الظروف صافي الكلور - يتم منع هروب رأس المال من تراكم الشحنة الموجبة في الحويصلية (الشكل 3A). إضافة Valinomycin تسمح K + للتحرك في جميع أنحاء بالتالي غشاء تحويلة الجهد الكهربائي والشروع الكلور - هروب رأس المال (الشكل 3B). يتم مراقبة دوام تدفق باستخدام الكلور - يتم قياس الواردة في الحويصلات مباشرة على الانحلال لهم باستخدام المنظفات - القطب -selective والمبلغ الإجمالي من الكلور. من هذهتجارب السائبة فمن الممكن لتحديد خصائص البروتينات واحدة المعاد، مثل معدل دوران، رياضيات الكيمياء من مجمع نشط وجزء من البروتين النشط. باستخدام المعادلات 7-9 لتناسب دوام هروب رأس المال وتقدير معدل النقل الوحدوي من CLC-EC1 نجد أن τ (0.2 ميكروغرام / ملغ) = 41 ثانية و f 0 (0.2 ميكروغرام / ملغ) = 0.31، مشيرا إلى أن ~ 1 / 3 من الجسيمات الشحمية يحتوي على 0 البروتينات النشطة. من هذه القيم نحسب أن معدل النقل الوحدوي هو γ ~ 2،500 الكلور - ثانية -1، في اتفاق جيد مع القيم المنشورة 8،14.

الشكل (1)
الشكل 1: الكلور - فحص هروب رأس المال (A - B) تمثيل تخطيطي من الكلور - فحص -efflux عن الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (A) أو CLC-EC1.الحويصلات المعاد (B). (C) دوام مقلد من CL-بدأت حامل الأيون - هروب رأس المال من proteoliposomes (أسود) أو الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (خط متقطع الرمادي). يبدأ هروب رأس المال عن طريق إضافة حامل الأيون (*) وإنهاء بإضافة المنظفات لإذابة الجسيمات الشحمية (^). متقطع الأحمر الخط هو نوبة الأسي لتحديد وقت ثابت، τ، من الكلور - هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على ما لا يقل عن 1 نسخة نشطة من CLC-EC1 وو 0 هو جزء من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على البروتينات النشطة 0 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تسجيل اقامة (A) تحدد وتسجيل ما يصل. (B) عن قرب دائرة من الدوائر. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): أثر عينة وتحليلها (A) V النموذجية (ر) آثار التجارب هروب رأس المال من proteoliposomes تشكيلها مع WT CLC-EC1 عند 0.2 ميكروغرام / ملغ P / L. السهام تشير إلى أوقات إضافة بوكل معايرة النبض، والجسيمات الشحمية، valinomycin وβ-OG. الخطوط المتقطعة تشير القيم ΔV في مراحل مختلفة. يتم تحويل (B) والخامس (ر) أثر في الكلورين (ر) باستخدام المعادلة 5، تطبيع باستخدام المعادلة 6 والوقت هروب رأس المال بالطبع يصلح للمعادلة 7 (خط متقطع أحمر). (C) تطبيع الوقت دورات هروب رأس المال من proteoliposomes تشكيلها مع WT CLC-EC1 عند 0.2 ميكروغرام / ملغ P / L (أسود) أو في 5 ميكروغرام / ملغ P / L (الرمادي). خط متقطعالصورة هي أفضل نوبات من الدورات الوقت هروب رأس المال للمعادلة 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها بروتوكول مفصلة لقياس الكلور - النقل بوساطة قنوات أنيون انتقائية المنقى أو النقل تشكيلها في الجسيمات الشحمية. كان المثال المستخدم في بدائيات النواة H + / CL - مبادل CLC-EC1. ومع ذلك، فإن منهجية يمكن تكييفه بسهولة لدراسة قنوات بوابات بواسطة بروابط 12،13،15، 11،12 الجهد، أو الرياضية المختلفة الانتقائية أنيوني 15،16 بالاستعاضة عن حج: القطب أجكل مع واحد مناسب للأيون قيد النظر. أقطاب انتقائية لأيونات أخرى من الكلورين - مثل H +، I - وF -، متاحة تجاريا.

مناقشة لبعض الخطوات الحاسمة والافتراضات تتبع.

حدود تخفيف افتراض بواسون

اشتقاق معدل الوحدوي (المعادلة 7-9) صالحا فقط في نظام التخفيف بواسون، عندما معظم الجسيمات الشحمية تابععين واحدة فقط من البروتين نشطة حتى أن احتمال وجود نسخ متعددة في حويصلة نظرا منخفض وثابت العيانية الوقت هروب رأس المال من السكان حويصلة ويقترب بشكل جيد من قبل أن من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على بروتين واحد. والواقع أن المقارنة بين الكلور - دوام هروب رأس المال بوساطة الجسيمات الشحمية تشكيلها مع CLC-EC1 في انخفاض (أسود، 0.2 ميكروغرام / ملغ) وعالية P / L (الرمادي، 5 ميكروغرام / ملغ) (الشكل 3C) يدل على أنه في الحالة الأخيرة حركية هروب رأس المال تصبح أسرع وو 0 النقصان، مما يدل على أن جزء أصغر من مجموع الجسيمات الشحمية يحتوي على 0 البروتينات. كان الواردة في كل من عينات حويصلة قابلة للمقارنة، ~ و ~ 0.7 0.55 μmoles على التوالي، مشيرا إلى أن إجمالي حجم الداخلية من الحويصلات في العينتين كانت متشابهة وأن كمية البروتين أعيد تشكيلها لا يؤثر على حجم - المبلغ الإجمالي للالكلورين الحويصلات. تركيب P / L هروب رأس المال بالطبع ارتفاع الوقت للمعادلة 7 تنتج قيم τ . (5 ميكروغرام / ملغ) = 8.8 ثانية وو 0 (5 ميكروغرام / ملغ) = 0.06، مشيرا إلى أن فقط ~ 6٪ من الحويصلات لا تحتوي على dimers CLC-EC1 نشطة على النقيض من ~ 31٪ جدت عندما P / L = 0.2 ميكروغرام / ملغ. وهكذا، فإن تقدير معدل دوران الوحدوي في ارتفاع P / L هو γ ~ 450 الكلور - ثانية -1، ما يقرب من 6 أضعاف أقل من واحد حصلت في انخفاض P / L والبيانات المنشورة 8،14. ولذلك، تحليل الوقت دورات هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية أعيد تشكيلها في ارتفاع P / L'الصورة سوف نقلل من معدل النقل الوحدوي من البروتين المعاد. وهكذا، إلى تحديد دقيق لمعدل النقل الوحدوي من بروتين رواية فإنه من الأهمية الأساسية لتحديد بالضبط كمية البروتين أعيد تشكيلها والعمل في انخفاض P / L'الصورة، في نظام التخفيف بواسون. ويتحقق ذلك من الناحية المثالية من خلال تحديد وتحليل البروتين المعايرة الكامل لتحديد النظام الأمثل للعمل في.

تقرير من كتلة مجمع نشط

خيمة "> التحليل المذكورة أعلاه يفترض أن رياضيات الكيمياء من مجمع نشط يعرف والبروتين أعيد نشط بشكل كامل. ومع ذلك، لمستحضرات جديدة قد لا يكون معروفا هذه الكميات بداهة، وفي هذه الحالة من الممكن تحديد هذه المعايير مباشرة عن طريق قياس و 0 الصورة في بروتين مختلف لنسب الدهون
المعادلة 13

حيث p هي كثافة البروتين، المعادلة 14 ، ρ هو عدد الجسيمات الشحمية في كتلة الدهون، N A هو عدد أفوجادرو، M P هي كتلة من مجمع القناة وظيفية وφ هو جزء من البروتينات النشطة. عن طريق تركيب تصميما تجريبيا و 0 الصورة في مختلف البروتين لنسب الدهون هو نقاط البيعالمنال لتحديد ص 0، وبالتالي M P وφ.

وهناك جزء محدود من الجسيمات الشحمية هو صهر إلى التأسيس

اشتقاق معدل نقل الوحدوي يفترض أنه في عالية P / L'الصورة كل الجسيمات الشحمية سوف تحتوي على البروتين واحد على الأقل النقل النشط. ومع ذلك، في بعض الحالات وقد وجد هذا لا يكون الحال: في عالية P / L'الصورة جزء كبير من الجسيمات الشحمية يبقى الحرارية إلى إعادة تشكيل بعض البروتينات 11-13،17. في حين أن أصل هذه الظاهرة ليست واضحة فمن المتصور أن البروتينات أكبر قد استبعدت من الحويصلات مع أنصاف الأقطار أصغر مما يقلل من عدد من الجسيمات الشحمية المتاحة.

في هذه الحالة معادلة 10 يحتاج إلى تعديل ل:
المعادلة 15

حيث θ هي جزء من الجسيمات الشحمية الحرارية من البروتين لن التأسيس. الأهم من ذلك، تتأثر ρ وφ أيضا طريقة إعادة منذ إجراءات مختلفة سيكون لها المبالغ المستردة مختلفة للالدهون والبروتينات خلال إعادة تشكيل الحويصلية و. وعلى افتراض 100٪ العائد لكلا يؤدي إلى سوء تقدير γ. لذلك، للحصول على الكميات الدقيقة للالوحدوي دوران / تصرف من المهم تحديد تجريبيا جزء من الدهن والبروتين المفقود خلال إعادة 8،11.

التوجه من البروتينات تشكيلها

واحدة من الافتراضات التي قدمت خلال التحليل هو أن جميع البروتينات أعيد تعادل وظيفيا. ومع ذلك، العديد من القنوات والناقلين كان يفضل اتجاهات وسائل النقل، وهي ظاهرة تعرف باسم التصحيح. هذا التباين وظيفي قد يؤدي إلى خطأ في تقدير معدل دوران. وعلاوة على ذلك، توجه البروتينات تشكيلها هو بداهة + التدرجات، للقنوات أو النقل التي هي ligand- أو التي تعتمد على التيار الكهربائي.

الاعتبارات على تشكيل الجسيمات الشحمية ضيقة

واحدة من العوامل الرئيسية مما يساعد على استخدام سو الفحص هروب رأس المال الموصوفة هنا هو تشكيل الجسيمات الشحمية ضيقة. ثلاثة متغيرات الهامة التي يجب مراعاتها لتحقيق هذه الغاية هي اختيار المنظفات المستخدمة لذوبان البروتين، واستراتيجية المنظفات التنظيف واختيار تكوين الدهون من الجسيمات الشحمية. في بروتوكول المعروضة هنا، يذوب CLC-EC1 في ديكل-Maltopyranoside (DM)، والمنظفات مع تركيز مذيلة (CMC) القيمة الحرجة العالية التي بالتالي إزالتها بسهولة. ومع ذلك، فقد تم استخدام مجموعة متنوعة من المنظفات الصناعية والتي تحدث بشكل طبيعي لتنقية البروتينات التي تم تشكيلها في وقت لاحق في الجسيمات الشحمية ضيقة مع أي آثار على ضيق من الحويصلات. هذه المنظفات لديها مجموعة واسعة من المجالس البلدية للأطفال، وارتفاع قدر millimolar (مثل DM أو ديجيتونين) ومنخفضة كما مكرومولي (مثل Dodecyl- Maltopyranoside (DDM) أو dioctylpropane مكرر-maltopyranoside (DMNG)). ومن المهم أن نلاحظ مع ذلك، أن الدهون المستخدمة لتشكيل ويذوب الجسيمات الشحمية باستخدام CHAPS، أو معتدل المنظفات أخرى، وبالتالي فإن المذيلات الهجينة الناتجة عن خليط من البروتين والدهون قد يكون-CHEMICO البدني خصائص مختلفة عن تلك التي المنظفات الأم. ولذلك فمن الممكن أنه في بعض الحالات إزالة المنظفات المتبقية التي يمكن أن زعزعة استقرار الجسيمات الشحمية مما يؤدي إلى تسرب أكثر وضوحا. للتحايل على هذه المشكلة فإنه من المستحسن للتحقيق استراتيجيات إزالة المنظفات البديلة، مثل biobeads 12،13، والأعمدة تدور 15 أو هلام الترشيح 18. وأخيرا، وتكوين الدهون من الحويصلات هو معلمة أهمية عن مخاليط محددة قد يكون المتسرب إلى أيونات مختلفة في ظروف معينة. على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية تشكلت من E. القولونية القطبي استخراج الدهون وضيق لCL - في ودرجة الحموضة الحمضية ولكن تصبح تدريجيا أكثر راشح مثل درجة الحموضة تزيد 19 أو الجسيمات الشحمية تشكلت من 3: خليط 1 من 1-بالميتويل-2-oleoyl الفوسفاتيديل-إيثانولامين (البابا) و1-palmitoyl- 2-oleoyl phosphatidylglycerol (POPG) عرض نفاذية أقل من ذلك بكثير لH + من تلك التي تشكلت من E. الدهون القطبي القولونية استخراج 20. ومن المهم أن نلاحظ مع ذلك أن تكوين الدهون من الحويصلات قد تؤثر أيضا على نشاط البروتين 13،21،22 تشكيلها. وبالتالي، فمن المهم أن تحدد بدقة خصائص الحويصلات خالية من البروتين أعدت في كل حالة ومن ثم لتقييم كيف أن هذا يؤثر على خصائص البروتين المعاد.

تعميم إلى قنوات غير CLC من نوع والناقلين

الفحص هروب رأس المال، كما هو موضح هنا، يمكن استخدامها مباشرة لتحديد خصائص جزيء واحد من أي الكلور - قناة -selective أو نقل، وعلى سبيل المثال استخدمت لتوصيف خصائص الكالسيوم 2+ -activated الكلور - قناة TMEM16A 12 . نحن نناقش الآن كيفية التكيف مع الفحص هروب رأس المال للتحقيق في خصائص النقل أو channإلس التي لا الكلور - انتقائية و / أو لدينا أسعار النقل وحدوية التي تختلف كثيرا عن ~ 10 3 أيون ثانية -1 من CLC-EC1.

أبسط الحالات هي أن بروتين قيد الدراسة هو أنيون انتقائي. في هذه الحالة التعديل اللازم الوحيد هو استبدال حج: القطب أجكل مع متوفرة تجاريا واحدة من الانتقائية المناسبة، كما حدث لF - Flucs -selective والمواطنين المحليين المهتمين 16،23،24 أو I - قنوات قابلة للاختراق مثل CFTR 15 . إذا، من ناحية أخرى، فإن البروتين أعيد انتقائي لالكاتيونات، وهو حامل الأيون غير valinomycin لابد من استخدامها لبدء هروب رأس المال. ونظرا لندرة التحقق من صحة الكلور - ionophores بديلا مفيدا هو H + حامل الأيون، مثل الكربونيل السيانيد 4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP). في هذه الحالة فمن المهم للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني intravesicular هو الحفاظ المستمر، على سبيل المثال عن طريق زيادة المخزن المؤقتقدرة حل داخلي جي. استراتيجية بديلة هي اتباع الموجبة هروب رأس المال من خلال قناة أعيد أو نقل باستخدام البروتونات على أنها counterion ومراقبة H + النقل باستخدام الرقم الهيدروجيني متر 25 أو الحساسة درجة الحموضة التحقيق ratiometric 26. ومع ذلك، فإن طبيعة غير المباشرة لهذه القياسات يجعل القياس الكمي لخصائص النقل من البروتين أعيد صعبا. وأخيرا، أقطاب انتقائية لعدد من الكاتيونات موجودة ومتاحة تجاريا. والسيناريو الثالث هو أن البروتين قيد الدراسة هو منفذ إلى كل من الأنيونات والكاتيونات، على سبيل المثال قناة سيئة انتقائية 13 أو الموجبة / CL - cotransporter. في هذه الحالة، فإن الجسيمات الشحمية تشكيلها لا تحتفظ التدرج بوكل خلال عملية التبادل الحل (الخطوات 5،4-5،5) بحيث أنها تفقد محتوى الملح بهم. لذلك في هذه الحالة يتم فقدان كافة المعلومات الحركية. ومع ذلك، فإن جزء من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على البروتوكول الاضافي نشط واحد على الأقلعين، و 0، لا يزال من الممكن تحديدها عن طريق إضافة المنظفات وقياس المتبقية محاصرين الكلور - المحتوى (الخطوة 6.8). وهذا يسمح لتحديد الكتلة الجزيئية من البروتين من خلال تنفيذ المعايرة البروتين وباستخدام المعادلة 10.

وثمة جانب آخر للنظر هو احتمال أن معدل النقل الوحدوي من البروتين المعاد هو أوامر من حجم مختلفة عن تلك التي CLC-EC1. على سبيل المثال، معظم شركات النقل ومعدلات دوران من 1-10 ثانية -1، 2-3 أوامر من حجم أقل من CLC-EC1، في حين أن معظم القنوات سلوك الأيونات في 10 6 -10 7 ثانية -1، 3-4،000 أضعاف أسرع من CLC -ec1. لنقل بطيئة معدل الكلور - التسرب من الجسيمات الشحمية خالية من البروتين يمكن أن تصبح الحد، والوزن النسبي في زيادة عملية هروب رأس المال كما انخفاض معدل النقل البروتين. في تجربتنا يختلف معدل تسرب إلى حد ما بين التحضيرات وعادة ما يكون في أمر منقليل من أيون ثانية -1. ولذلك، عند العمل مع شركات النقل بطيئة فإنه من المستحسن لإعداد خالية من البروتين الجسيمات الشحمية جنبا إلى جنب لإعادة كل لقياس دقيق لتسرب المقابلة لكل دفعة من الحويصلات. وقد استخدمت مقايسة هروب رأس المال بنجاح لتحديد سعر موحد للنقل بطيئة مع معدلات دوران حول 1-10 أيون ثانية -1، مثل السيانوبكتيريا CLC 27. يحدث الوضع العكس عندما يكون البروتين أعيد تشكيلها لديه تصرف عالية، وعلى سبيل المثال قناة أيون. في هذه الحالة حركية هروب رأس المال سريعة جدا بحيث لا يمكن حلها عن الوقت الاختلاط (~ 1-2 ثانية) وزمن الاستجابة لا يتجزأ من القطب تسجيل يصبح معدل الحد. في هذه الحالة، يتم فقدان المعلومات الحركية ولكن كتلة من مجمع نشط لا يزال من الممكن تحدد 24. ومن الجدير بالذكر أن المناهج الأخرى، مثل التسجيلات مستو الدهون طبقة ثنائية أو الجسيمات الشحمية لقط التصحيح هي أكثر مناسبة لدراسة القنوات الأيونية المنقى حيث أن هذه الشركة المصرية للاتصالاتchniques الشركة تقديم المعلومات مباشرة جزيء واحد مع قرار الأوان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.  Avanti Polar Lipids Inc. 610200
IEC Centra CL2 Benchtop Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter These can be found on Ebay.
Non-functional pH probe Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.
DI-710 Data Logger DATAQ instruments
WinDAQ acquisition software DATAQ instruments
Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml Pierce (Thermo Scientific) 29922
KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass Kimble Chase 73500-13100
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids Inc. 610000
Computer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
  3. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  4. Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
  5. Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
  6. Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
  7. Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
  8. Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
  9. Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
  10. Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
  11. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
  12. Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
  13. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
  14. Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
  15. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
  16. Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
  17. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
  18. Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
  19. Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
  20. Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
  21. Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
  22. Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
  23. Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
  24. Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
  25. Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
  26. Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
  27. Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 98، بروتين الغشاء، وتنقية، إعادة والإحصاءات بواسون، CLC، ومعدل دوران
وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور<sup&gt; -</sup&gt; القنوات وأنظمة نقل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basilio, D., Accardi, A. A… More

Basilio, D., Accardi, A. A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters. J. Vis. Exp. (98), e52369, doi:10.3791/52369 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter