Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten die Fähigkeit, Überexpression und Reinigung von Membrantransportproteine hat sich dramatisch erhöht: Ionenkanäle, primäre und sekundäre Transporter werden nun routinemäßig von heterologen Expressionssystemen sowie natürlichen Quellen gereinigt. Neue Wege in der Ausdrucks überwachen, zu verbessern und die Extraktion und erhöhen die Stabilität dieser Proteine werden ständig weiterentwickelt 1-5. Diese technologischen Durchbrüche haben dazu beigetragen, das Auslösen der Explosion der Atomebene Informationen über die Struktur von Membranproteinen, die wiederum verbessert das Verständnis der strukturellen Grundlagen ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu können wir auch die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Proteine Sonde nicht mit der gleichen Geschwindigkeit zu erhöhen, so dass in einigen Fällen hochauflösende Strukturinformation durch qualitative Funktionsdaten begleitet, wodurch die Fähigkeit zur quantitativen Test strukturbasierte Prognosen einschränkend. Daher ist die development quantitativer und verallgemeinerbare funktionellen Tests ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der mechanistischen Grundlagen von Membranproteinfunktion.
Hier beschreiben wir eine Auslauf Assay, der verwendet werden kann, wichtige Funktionseigenschaften gereinigt und wiederhergestellt Cl quantitativ zu bestimmen - Kanäle und Transporter. Die Prinzipien des Assays Basiswert kann auf eine Vielzahl von Transportsystemen, sowie auf nichtIonenTransportProteine verallgemeinern. Kanal / Transporter in Gegenwart eines großen Cl - - Liposomen werden mit gereinigtem Cl rekonstituiert Gradienten (1A, B). Cl - Ausfluß wird durch die Zugabe eines Ionophors initiiert, um für Gegenionenfluss zu ermöglichen, in unserem Fall der K + Ionophor Valinomycin, der die Spannung von der etablierten Cl Shunt - Gradienten und den ursprünglichen Membranpotential auf das Gleichgewichtspotential von K + 6,7. Ohne ter Ionophor keine signifikante Netto Cl - Efflux auftritt, wie es durch die Erzeugung eines Transmembranpotentials verhindert. - Efflux und f 0, die Fraktion von Liposomen keine aktive Protein enthaltenden τ die Zeitkonstante von Cl: Die Daten werden quantitativ durch zwei messbare Parameter (Abbildung 1C) beschrieben. Von τ und f 0 die unitäre Cl - Transportgeschwindigkeit kann der Anteil von aktiven Proteinen und die Molekularmasse des aktiven Komplexes 8 abgeleitet werden. Tauscher bekannter Struktur und Funktion - Die Technik wird hier mit Proteo mit CLC-ec1, einem gut charakterisierten CLC-Typ H + / Cl wiederhergestellt dargestellt. Dieser Assay wird leicht um Kanäle oder Transporteure mit unterschiedlicher Ionenselektivität, oder deren Aktivität von der Anwesenheit von Spannung und / oder Liganden verallgemeinert. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um zu bestimmen, ob kleine Moleküle unmittelbar auf die rekonstituierte Protein,um die Wirkungen dieser Verbindungen und wie die Zusammensetzung der Membran oder Lipidmodifizierungsreagenzien auf die Funktion der rekonstituierten Kanäle und Transporter zu quantifizieren.
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Protocol
1. Lipid Vorbereitung
- Aliquot die gewünschte Menge Lipide in eine klare Glasröhre. Du Siehst. coli polaren Lipidextrakt, aber die meisten Lipidzusammensetzungen verwendet werden. Wenn die Lipide in Form von Pulver, resuspendieren sie in Chloroform bis zu einer Konzentration von 20 mg / ml. Trocknen der Lipide bei RT unter N 2 -Gas, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist.
- Resuspendieren der Lipide in Pentan und trocknen Sie es wieder einen stetigen Strom von Gas N 2 zu übrig gebliebenen Spuren von Chloroform zu entfernen. Trocken, bis alle Lösungsmittel verdampft. Während des Trocknens, stark drehen das Rohr, so dass das Lipid in einer gleichförmigen Film, der die untere Drittel des Rohres anstelle einer Bildung einer dichten Masse am Boden verteilt.
- Hinzufügen der Rekonstitutionspuffer enthält Detergens (300 mM KCl, 50 mM Zitronensäure, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS), um die Lipide zu lösen. Benutzen Sie anderen milden Reinigungsmitteln für diesen Schritt, wenn das Protein ist schlecht, tolerant zu CHAPS.
- Resuspend die Lipide zur Klarheit mit einem Wasserbad Sonicator. Tauchen Sie den Schlauch in der Mitte des Wassers Ultraschallbad bei maximaler Leistung in kurzen (30 sec-1 min) mit kurzen Impulsen (30 sec-1 min) unterbricht. Die Lösung sollte klar sein.
HINWEIS: Die endgültige Grad an Klarheit erreicht, hängt von der spezifischen verwendeten Lipid-Zusammensetzung. Einige von Charge zu Charge Variation in diesem Schritt auch bei nominell identischen Lipiden ist ebenfalls möglich. Resttrübung aufgrund der Lichtstreuung durch große Partikel in der Suspension, welche durch Zentrifugation entfernt werden kann. - Inkubieren der resuspendierten Lipide bei RT für 20-60 min.
2. Proteoliposom Bildung
HINWEIS: Verschiedene Strategien können verwendet werden, um das Detergens-solubilisierten Protein in Liposomen einfügen. Für CLC-ec1 Dialyse funktioniert gut und ist daher das Mittel der Wahl 6,9,10.
- Füge das gereinigte Protein, das gewünschte Protein-zu-Lipid (P / L) Verhältnis (in ug o ausgedrückt f Protein / mg Lipid). Die Wahl von P / L-Verhältnis hängt von dem Zweck des Experiments.
- Wenn es das Ziel ist es, die Aktivität des Proteins von Interesse zu bewerten, zu rekonstituieren bei hohen P / L's, um das Signal zu maximieren, da jedes Liposom mehrere Kopien des Proteins enthält. Um die Aktivität und / oder einheitlichen Transportrate des Proteins zu quantifizieren, zu rekonstituieren in einer Poisson Verdünnungsregelung bei niedrigen P / L's, so daß jedes Vesikel enthalten durchschnittlich 1 Protein. Siehe Schritt 7 und Diskussion für eine tiefergehende Analyse, wann die einzelnen Regime zu nutzen.
- Um die optimale P / L-Werte für die verschiedenen Schemata zu bestimmen, führen eine vollständige Titration der Aktivität als Funktion der Proteinkonzentration 8,11-13. Jedoch für jedes Protein, für das das Molekulargewicht (MW, in kDa exprimiert) der aktiven Einheit ist bekannt folgende P / L-Werte als Anfangs guesstimates verwendet werden:
pg "/>
- Geladen, die das Protein und Lipidgemisch in eine vorbefeuchtete Dialyserohr oder eine Kassette. Platzieren der Dialyseeinrichtung in einem Becherglas mit 500-1,000x das Volumen der Lipid Rekonstitutionspuffer (dh 1 l Puffer für 1 ml Lipid Resuspension) unter vorsichtigem Rühren.
- Ändern Puffer 3-4 mal im Abstand> 3 Std. Bei jeder Lösung Wechsel, waschen Sie die Kassette / Schläuche und das Becherglas mit destilliertem Wasser und füllen Sie den Becher mit frischem Rekonstitutionspuffer. Fügen Sie 1-2 O / N Intervalle für die Lösung zu ändern. Die genaue Anzahl und die Dauer der Lösung ändert sich abhängig von der genauen Lipid und Detergentien verwendet.
- Nachdem der letzte Schritt ist, entfernen Sie die Liposomen aus dem Dialysegefäß, aliquotieren sie in Rohre und Flash frieren sie in flüssigem N 2 oder Einfrieren bei -80 ° C.
3. Aufnahme Set-up
<p class = "jove_content"> Hinweis: Die Aufnahme-Setup (Abbildung 2A) besteht aus zwei Kammern (Flachboden-Zylinder, ~ 3-4 ml Volumen), eine Cl - (siehe unten) Elektrode, einem pH-Meter mit einem Analog- oder digitale elektrische Ausgang, einen Digitalisierer und einen Computer mit einem entsprechenden Erfassungssoftware.- Verbinden der Cl - Elektrode mit dem pH-Meter, das Ausgangssignal des pH-Meter auf dem Digitalisierer die an den Computer angeschlossen ist. Legen Sie die Referenzelektrode in einer Kammer und die Umkodierung Draht in die andere (2B).
HINWEIS: Die Polarität der Leitungen ist korrekt, wenn AV Cal (siehe Schritt 6.4 und 7.2) ist positiv. - Legen Sie die Kammern auf einer Rührplatte mit einem Rührstäbchen in den Aufnahmeraum (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, der Rührstab nicht die Elektrode berühren.
- Schließen der Kammern mit einem Agarbrücke (2B) (100 mM KCl und 2% Agarose). Bewahren Sie die Agar-Brücken in 100 mM KCl.
4. Vorbereitung der Cl - Elektroden
- Nehmen Sie einen alten und -possibly- nicht funktionierende pH-Elektrode. Brechen Sie die Glas-Beschichtung, um die Silberdrähte vollständig offenbaren.
- Die Beschichtung vorsichtig aus der Silberdrähte mit einem Skalpell. Reinigen Sie die Drähte mit reichlich H 2 O und EtOH.
- Platz in einer gesättigten Lösung von FeCl 3 (oder Bleichmittel), bis Drähte mit einem einheitlichen dunklen Mantel AgCl bedeckt.
5. Herstellung von unilamellaren Vesikeln
- In der Nacht vor den Experimenten, schwellen 1 g Sephadex G-50-Perlen in 15 ml externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM Zitronensäure, pH 4,5) unter leichtem Schütteln (nicht rühren) für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Jedes Experiment erfordert ~ 3 ml geschwollene Perlen. Halten Sie die geschwollenen Perlen bei 4 ° C für ein paar Tage in den meisten.
- Während die Liposomen bei RT aufgetaut, gießen Sie in jeder Spalte ~ 3 ml geschwollene G-50-Perlen. Lassen Sie sie trocknen durch Schwerkraft bei RT; Dies dauert in der Regel 1-2 min.
- Bereiten unilamellare Vesikel durch Extrudieren des Proteo 11 Mal durch ein Mini-Extruder mit einer 0,4 m Teflon-Cutoff.
- Die Säule in einem Kunststoffrundrohr. Drehen Sie die Spalten, um überschüssige Lösung zu entfernen. Zentrifugieren Sie für 20 bis 30 s bei 1400 x g in einer klinischen Zentrifuge.
- Durchfluss verwerfen, statt Spalte in einer 13 x 100 mm Glasröhrchen und fügen Sie 100 ul der extrudierte Vesikel an der Säule. Spin Säule für 1 min bei 500 xg in einer klinischen Zentrifuge.
- Sammeln ~ 200 ul Durchströmung zu dem Aufzeichnungskammer in Schritt 6.5 hinzugefügt wird.
6. Efflux Mess
- Je 2 ml 100 mM KCl in der Referenz (Masse) Kammer und 1,8 ml der externen Puffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM Citronensäure, pH 4.5) zur Aufnahme Kammer. Der leichte osmotischen Ungleichgewicht zwischen der internenund externe Lösungen wirkt sich nicht auf
- Starten Sie die Aufnahme-Programm. Lassen Sie die Grundlinie ins Gleichgewicht kommen, dies kann einige Minuten dauern.
- Sobald das Signal eine stabile Basislinie (die Liposomen bereit sind und die Spalten trocknen) erreicht, startet die Aufnahme (3A).
- Werden 15 ul einer 10 mM KCl-Lösung, um das System (2A) zu kalibrieren.
- In Liposomen. Von Proteoliposomen (3A) - ein kleiner Sprung vielleicht aufgrund einer unvollständigen Entfernung der externen Cl sichtbar. Warten Sie, bis die Grundlinie stabilisiert.
- Hinzufügen Valinomycin (1 ul 1 mg / ml in EtOH) zum Ausströmen (3A) zu initiieren.
- Lassen Sie die Auslauf laufen ihr zeitlicher Verlauf, bis es Plateaus (3A).
- Hinzufügen von 40 ul von 1,5 M β-Octylglucosid (β-OG) in dem externen Puffer alle Liposomen (3A) zu lösen, hergestellt. Beenden Sie die Aufnahme.
7. Daten Analyse
- Exportieren Sie die Trace-Datei von der im ASCII- oder Text-Format und importieren Sie sie in die Analyse-Programm der Wahl.
- Messen Sie die Spannung an den folgenden Punkten (3A):
Zu Beginn der Aufnahme (V 0);
Nach Zugabe des Eichpulses (V cal);
Nach der Zugabe der Liposomen (V lipo);
Am Ende des Auslauf (V fin);
Nach Zugabe von Reinigungsmittel (V ges);
Grundlinie die Spannungen so dass V 0 = 0 ist. - Verwenden Sie die Nernst-Planck-Gleichung, um den experimentellen Wert bestimmen
durch Messung 
Wo Vol Cal ist das Volumen der Kalibrierungspuls in ul, 1.800 wird das Kammervolumen zu Beginn des Experiments in exprimiert1, l, [Cl] cal / in sind die Cl - Konzentrationen der Kalibrierungsimpuls und der externen Puffer in mM und AV cal ist der Sprung in mV nach dem Kalibrierungsimpuls gemessen.
ANMERKUNG: Diese empirische Bestimmung α dient drei Zwecken: sie gewährleistet, dass das System korrekt reagiert, bietet ein Maß für die Konsistenz der Reaktion des Instruments zwischen den Experimenten als auch zu prüfen, dass keine Fehler in der Lösung Herstellung hergestellt. - Berechnen Sie die Cl-Konzentrationen nach jedem Schritt wie folgt:
Der Faktor 3/400 kommt von der Verdünnung der 15 & mgr; l Kalibrierungspuls in die 2.000 & mgr; l Endvolumen. - Calculaßen die Veränderungen in [Cl] bei jedem Schritt, ΔCl Lipo / end / ges.
- Konvertieren V (t) in Cl (t) mit
Die [Cl] Werte direkt zu bestimmen, an den kritischen Punkten und vergleicht sie mit den berechneten Werten als eine interne Kontrolle. - Normalisieren der Spur, so dass das Cl rel Lipo = 0 und Cl rel tot = 1
- Den Auslaufzeit natürlich der folgenden Gleichung:
Wobei L die Rate der Cl - Leck, die experimentell durch Messung bestimmt wird Cl - Efflux aus proteinfreien Liposomen unter den gleichen Bedingungen und τ hergestellt wird die Zeitkonstante des Prozesses. - Berechnen v, die Anfangsgeschwindigkeit:
Wo ΔCl Rippe in millimolaren ausgedrückt und V das Volumen der Kammer in ul. - Berechnen Sie die Transportgeschwindigkeit / Leitwert
Wobei p der P / L, MW das Molekulargewicht des aktiven Komplexes, ausgedrückt in kDa
durch Messung 
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Representative Results
Wir beschreiben eine detaillierte und robuste Protokoll zu messen Cl - Transport von gereinigtem CLC-ec1, einem prokaryontischen CLC-Typ H + / Cl vermittelt - Tauscher, in Liposomen rekonstituiert. Eine schematische Darstellung des Experiments ist in Abbildung 3 dargestellt Proteoliposomen mit gereinigtem CLC-EC1 und mit hohen internen Cl rekonstituiert. - In einer Badlösung, die geringe Cl taucht -. Unter diesen Bedingungen net Cl - Ausfluß wird durch den Aufbau der positiven Ladung im Liposom (3A) verhindert. Die Zugabe von Valinomycin erlaubt K + durch die Membran so Rangieren das elektrische Potential und die Einleitung Cl bewegen - Efflux (3B). Das Flusszeitverlauf wird mit einem Cl überwacht - -selektiven Elektrode und der Gesamtbetrag der Cl - in den Vesikeln enthalten ist direkt durch das Lösen Sie diese mit Reinigungsmittel gemessen. Aus diesenLösungsexperimenten ist es möglich, Eigenschaften der Einzel rekonstituierten Proteine wie Umsatzrate Stöchiometrie des aktiven Komplexes und Fraktion des aktiven Proteins zu bestimmen. Unter Verwendung der Gleichungen 7-9 die Auslaufzeit natürlich anzubringen und zu schätzen die einheitliche Transportgeschwindigkeit von CLC-ec1 finden wir, dass τ (0,2 ug / mg) = 41 s und f 0 (0,2 ug / mg) = 0,31, was darauf hinweist, dass ~ 1 / 3 der Liposomen enthält 0 aktive Proteine. Aus diesen Werten berechnen wir, dass die einheitliche Transportrate γ ~ 2500 Cl - sec -1, in guter Übereinstimmung mit veröffentlichten Werten 8,14.
Abbildung 1: Die Cl - Efflux-Assay (A - B) Schematische Darstellung des Cl - -efflux Assay für proteinfreie Liposomen (A) oder CLC-ec1.rekonstituiert Vesikel (B). (C) Simulierte Zeitverlauf der Ionophor initiierte Cl - Ausstrom von Proteo (schwarz) oder proteinfreien Liposomen (grau gestrichelte Linie). Efflux wird durch Zugabe von Ionophor (*) initiiert und durch die Zugabe von Waschmittel beendet wird, um Liposomen zu lösen (^). Red gestrichelte Linie ist eine exponentielle Anpassung zu bestimmen, wird die Zeitkonstante, τ, der Cl -. Efflux von Liposomen, die mindestens 1 aktive Kopie der CLC-ec1 und f 0 ist der Anteil der Liposomen, die 0 aktive Proteine Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.
Abbildung 2: Aufzeichnung einzurichten (A) Die Aufnahme einrichten.. (B), Close-up der Kammern. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiel-Trace und Analyse (A) Typische V (t) Spuren von Ausfluss Experimente von Proteo mit WT CLC-ec1 Rekonstitution mit 0,2 g / mg P / L.. Die Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Zugabe der KCl Kalibrierungspuls, Liposomen, Valinomycin und β-OG. Gestrichelte Linien zeigen die & Dgr; V-Werte in verschiedenen Stadien. (B) Die V (t) Spur wird unter Verwendung von Gleichung 5, normalisiert mit Gleichung 6 und die Auslaufzeit ist natürlich fit zu Gleichung 7 (rot gestrichelte Linie) in Cl (t) umgewandelt. (C) normalisierte Auslaufzeit Kurse von Proteo mit WT CLC-ec1 Rekonstitution mit 0,2 g / mg P / L (schwarz) oder bei 5 ug / mg P / L (grau). Gestrichelte Linies sind am besten passt der Auslaufzeit Kurse auf Gleichung 7.
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Discussion
Transport von gereinigtem anionenselektive Kanäle oder Transporter in Liposomen rekonstituiert vermittelt - haben wir ein ausführliches Protokoll zu messen Cl beschrieben. Das verwendete Beispiel war der prokaryotischen H + / Cl - Tauscher CLC-ec1. Jedoch kann die Methodik leicht angepasst, um Kanäle durch Liganden 12,13,15, 11,12 Spannung oder sportlich verschiedenen anionischen Selektivität 15,16 durch Ersetzen des Ag gated untersuchen: AgCl-Elektrode mit einem für den Ionen erwogen. Elektroden selektiv für andere als Cl - Ionen, wie H +, I - und F -, sind im Handel erhältlich.
Eine Diskussion über einige der wichtigsten Schritte und Annahmen zu folgen.
Grenzen der Poisson-Verdünnung davon
Die Ableitung des unitären Rate (Gleichung 7-9) ist nur in einer Poisson Verdünnungsregelung, wenn die meisten Liposomen contain nur ein aktives Protein, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Kopien in einer gegebenen Vesikel niedrig ist und die makroskopische Efflux Zeitkonstante des Vesikels Bevölkerung ist gut mit der von Liposomen ein einzelnes Protein, enthaltend angenähert. Tatsächlich zeigt ein Vergleich der Cl - Auslaufzeit natürlich von Liposomen mit CLC-ec1 rekonstituiert bei niedrigen (schwarz, 0,2 ug / mg) und hohe P / L (grau, 5 & mgr; g / mg) vermittelt (3C) zeigt, dass in der letzteren Fall die Ausfluss Kinetik schneller und f 0 abnimmt, was anzeigt, dass eine kleinere Fraktion der gesamten Liposomen enthält 0 Proteinen. Die Gesamtmenge an Cl - in beiden Proben enthielten Vesikel vergleichbar war, ~ 0,7 und ~ 0,55 umol was anzeigt, dass die gesamten Innenvolumen der Vesikel in den beiden Proben ähnlich war, und dass die Menge des Proteins hergestellt wurden, nicht auf die Größe die Vesikel. Montage des hohen P / L-Auslaufzeit natürlich auf Gleichung 7 erzeugt Werte τ ; (5 & mgr; g / mg) = 8,8 s und f 0 (5 ug / mg) = 0,06, was anzeigt, dass nur ~ 6% der Vesikel enthalten keine aktiven CLC-ec1 Dimere im Gegensatz zu der ~ 31% gefunden, wenn P / L = 0,2 ug / mg. Somit ist die Schätzung der einheitlichen Fluktuationsrate bei hohen P / L ist γ ~ 450 Cl - sec -1, fast 6-fach niedriger als die, die bei niedrigen P / L erhalten und der veröffentlichten Daten 8,14. Daher Analyse der Auslaufzeit Kurse von Liposomen bei hohen P rekonstituierte / L's die einheitliche Transportrate des rekonstituierten Protein unterschätzen. So, genau zu bestimmen, die einheitliche Transportgeschwindigkeit einer neuen Protein es von entscheidender Bedeutung ist, um genau die Menge an Protein rekonstituiert zu bestimmen und bei niedrigen P / L's arbeiten, in einer Poisson Verdünnungs Regimes. Dies ist ideal, indem eine vollständige Protein Titrationsanalyse die optimale Regime zu arbeiten, zu identifizieren erreicht.
Bestimmung der Masse des aktiven Komplexes
Zelt "> Das oben beschriebene Analyse geht davon aus, dass die Stöchiometrie der aktiven Komplex bekannt ist und die rekonstituierte Protein voll aktiv ist. Doch für neue Präparate hätten diese Mengen nicht a priori bekannt sein. In diesem Fall ist es möglich, diese Parameter direkt zu bestimmen, Durch die Messung der f 0 ist an verschiedenen Protein Lipid-Verhältnissen
wobei p die Proteindichte, 
Ist ρ die Anzahl von Liposomen pro Masse an Lipid, N A die Avogadro-Konstante, M P ist die Masse des Funktionskanals komplex und φ ist der Anteil an aktiven Proteinen. Durch den Einbau der experimentell bestimmte f 0 ist an verschiedenen Protein: Lipid-Verhältnissen ist es poslich, p 0 zu bestimmen, und damit M P und φ.
Eine endliche Fraktion von Liposomen ist refraktär Einbindung
Die Ableitung des einheitlichen Transportrate unterstellt, dass bei hohen P / L's alle Liposomen mindestens einen aktiven Transportprotein enthalten. Jedoch kann in einigen Fällen wurde festgestellt, nicht der Fall zu sein: bei hohen P / L's ist ein großer Anteil der Liposomen bleibt refraktär Rekonstitution einiger Proteine 11-13,17. Während die Ursache dieses Phänomens sind nicht klar ist es denkbar, dass größere Proteine könnten von Vesikeln mit kleineren Radien so die Anzahl der verfügbaren Liposomen Reduktions ausgeschlossen.
In diesem Fall wird Gleichung 10 muss modifiziert werden: 
wobei θ der Anteil der Liposomen refraktär Protein Einarbeitung. Wichtig ist, ρ und φ werden auch durch die Rekonstitution Verfahren betroffen, da verschiedene Verfahren werden unterschiedliche Wiederfindungsraten für Lipide und Proteine während der Liposomen Rekonstitution und Bildung haben. Unter der Annahme, 100% Ausbeute für beide würde zu einer Fehlschätzung der γ führen. Deshalb, um eine genaue Quantifizierung der unitären Umsatz / Leitfähigkeit erreichen, ist es wichtig, den Anteil von Lipid und Protein verloren experimentell während der Rekonstitution 8,11.
Orientierung der rekonstituierten Proteine
Eine der Annahmen bei der Analyse vorgenommen wird, dass alle rekonstituierten Proteine funktionell äquivalent. Allerdings haben viele Kanäle und Transporter Richtungen Transporte, ein Phänomen, das als Gleichrichtung bekannt bevorzugt. Diese funktionelle Asymmetrie könnte zu einem Schätzfehler in der Fluktuationsrate führen. Weiterhin ist die Orientierung der rekonstituierten Proteine a priori + Umgehung Farbverläufe, für Kanäle oder Transporter, der Ligand oder spannungsabhängig sind.
Überlegungen zur Bildung von dichten Liposomen
Einer der wichtigsten Faktoren, die den Einsatz of den hier beschriebenen Efflux Assay ist die Bildung von eng Liposomen. Drei wichtigen Variablen, die zu diesem Zweck in Betracht gezogen werden, sind die Wahl des Detergens verwendet werden, um das Protein, das Detergens-Entfernungsstrategie und die Auswahl der Lipidzusammensetzung der Liposome solubilisieren. In der hier vorgestellten Protokoll wird CLC-ec1 in Decyl-maltopyranosid (DM), einem Reinigungsmittel mit einem hohen kritischen Micellenkonzentration (CMC) Wert, der leicht entfernt wird gelöst. Jedoch kann eine Vielzahl von synthetischen und natürlich vorkommenden Waschmitteln verwendet worden, um Proteine, die nachfolgend in engen Liposomen ohne Auswirkungen auf die Dichtheit der Vesikel rekonstituiert wurden reinigen. Diese Reinigungsmittel haben eine breite Palette von CMCs, so hoch wie millimolaren (wie DM oder Digitonin) und so günstig wie mikromolaren (wie Dodecyl- maltopyranosid (DDM) oder dioctylpropane-bis-maltopyranosid (DMNG)). Es ist wichtig, jedoch beachten, dass die Lipide, die zur Bildung der Liposomen werden mit CHAPS solubilisiert, oder anderen milden ReinigungsUnd damit die Hybrid Mizellen aus dem Gemisch aus Protein und Lipiden erhaltene haben könnten chemisch-physikalischen Eigenschaften verschieden von denen der Stamm Waschmitteln. Es ist daher möglich, dass in einigen Fällen die Rest Detergensentfemung dass die Liposomen führt zu ausgeprägter Lecks destabilisieren. Um dieses Problem zu umgehen, ist es ratsam, alternative Detergensentfemung Strategien wie Biobeads 12,13, Spin-Säulen 15 oder Gelfiltration untersuchen 18. Schließlich wird die Lipidzusammensetzung der Vesikel ist ein wichtiger Parameter, wie bestimmte Mischungen könnten undicht verschiedenen Ionen in bestimmten Bedingungen. Beispielsweise Liposomen aus E. gebildet coli polaren Lipidextrakt sind dicht an Cl - bei sauren pH-Werten, werden aber zunehmend leaky steigendem pH-Wert 19 oder Liposomen, die aus einer 3: 1-Gemisch von 1-Palmitoyl-2-oleoyl Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl- 2-Oleoyl Phosphatidylglycerin (POPG) Zeigen eine viel geringere Permeabilität für H +, als jene aus E. gebildet coli polares Lipid extrahieren 20. Es ist wichtig zu beachten, dass jedoch die Lipidzusammensetzung der Vesikel kann auch die Aktivität des rekonstituierten Protein 13,21,22 beeinflussen. Somit ist es wichtig, genau die Eigenschaften der proteinfreien Vesikel in jeder Bedingung hergestellt bestimmen und dann zu prüfen, wie sich dies auf die Eigenschaften des rekonstituierten Protein.
Verallgemeinerung auf nicht CLC-Typ-Kanäle und Transporter
Die Auslaufassay, wie hier beschrieben, können direkt verwendet werden, um die molekularen Eigenschaften jeder Cl bestimmen - -selektiven Kanal oder Transporter, und beispielsweise verwendet worden, um die Eigenschaften des Ca 2+ -aktivierten Cl charakterisieren - Kanal TMEM16A 12 . Wir besprechen nun, wie man die Auslauf Test anzupassen, um die Eigenschaften von Transportern oder chann untersuchenels, die keine Cl - selektive und / oder einheitliche Transportraten, die deutlich von der ~ 10 3 sec -1 Ionen von CLC-ec1 sind.
Der einfachste Fall ist, dass die untersuchte Protein ist anionenselektiven. In diesem Fall ist die einzige notwendige Einstellung ist, die Ag ersetzt werden: AgCl-Elektrode mit einem im Handel erhältlichen ein geeigneter Selektivität, wie sie für die F getan - -selektiven Flucs und CLCs 16,23,24 oder I - permeable Kanäle wie CFTR 15 . Wenn auf der anderen Seite ist die rekonstituierte Protein selektiv für Kationen, hat ein von Valinomycin Ionophor zu verwenden, um Ausfluß initiieren. Angesichts der Knappheit der validierten Cl - Ionophore ein nützlicher Ersatz ist ein H + Ionophors wie Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP). In diesem Fall ist es wichtig, durch Erhöhung der Puffer dass intravesikulären pH konstant gehalten wird, beispielsweiseing Kapazität des internen Lösung. Eine alternative Strategie ist die Kationen Efflux durch eine rekonstituierte Kanal oder Transporter indem Protonen als Gegenion und Überwachungs H + -Transport mit einem pH-Messgerät 25 oder ein ratiometrisches pH-empfindliche Sonde 26 zu folgen. Der indirekte Art dieser Messungen macht jedoch die Quantifizierung der Transporteigenschaften der rekonstituierten Protein schwierig. Schließlich selektiven Elektroden für eine Reihe von Kationen vorhanden sind und sind kommerziell erhältlich. Ein drittes Szenario ist, dass das untersuchte Protein durchlässig ist sowohl Anionen als auch Kationen, beispielsweise ein wenig selektiven Kanal 13 oder ein Kation / Cl - Cotransporter. In diesem Fall müssen die rekonstituierten Liposomen kein KCl Gradienten während der Lösungsaustauschprozesses beibehalten (Schritte 5,4-5,5), so dass sie deren Salzgehalt zu verlieren. Also in diesem Fall alle kinetische Information verloren. Jedoch beträgt der Anteil von Liposomen, die mindestens ein aktives protInhalt (Schritt 6.8) - ein, f 0, kann immer noch durch Zugabe von Reinigungsmittel und die Messung der Rest gefangen Cl bestimmt werden. Dies ermöglicht die Bestimmung der Molekularmasse des Proteins, das durch die Durchführung einer Protein-Titration unter Verwendung von Gleichung 10.
Ein weiterer Aspekt ist die Möglichkeit, dass einheitliche Transportrate des rekonstituierten Protein ist um Größenordnungen verschieden von der CLC-ec1. Zum Beispiel, die meisten Transporteure haben Fluktuationsraten von 1-10 sec -1, 2-3 Größenordnungen niedriger als CLC-ec1, während die meisten Kanäle Verhalten Ionen bei 10 6 bis 10 7 s -1, 3-4000 fach schneller als CLC -ec1. Für langsame Transport die Rate der Cl - Leckage aus proteinfreien Liposomen zu begrenzen, da seine relative Gewicht in den Auslaufprozess erhöht sich Transportgeschwindigkeit abnimmt des Proteins. Nach unserer Erfahrung variiert die Leckrate etwas zwischen Zubereitungen und ist normalerweise in der Größenordnung vonwenige Ionen sec -1. Daher wird, wenn die Arbeit mit langsam Transport ist es ratsam, proteinfreien Liposomen nebeneinander auf jede Rekonstitution herzustellen, um das Leck entspricht jede Charge von Vesikeln genau zu messen. Die Auslauf Assay wurde erfolgreich verwendet, um die einheitliche Geschwindigkeit des langsamen Transporter mit Umsatzraten von etwa 1-10 Ionen sec -1, wie einem cyanobakteriellen CLC 27 bestimmen. Die umgekehrte Situation tritt auf, wenn die rekonstituierte Protein hat eine hohe Leitfähigkeit, zum Beispiel ein Ionenkanal. In diesem Fall sind die Ausfluss Kinetik zu schnell sind, als die Mischzeit (~ 1-2 sec) und die intrinsische Reaktionszeit von der Aufzeichnungselektrode werden geschwindigkeitsbegrenzende gelöst werden. In diesem Fall wird die kinetische Information verloren, aber die Masse des aktiven Komplexes noch bestimmt werden 24. Es ist erwähnenswert, dass andere Ansätze, wie planare Lipiddoppelaufzeichnungen oder Patch-Clamp-Liposomen sind besser geeignet, um gereinigtes Ionenkanälen, da diese te studierenchniques direkt liefern Einzelmolekül Informationen mit hoher Zeitauflösung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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