Introduction
בשני עשורים האחרונים את יכולת ביטוי יתר ולטהר חלבוני קרום תחבורה גדלה באופן דרמטי: תעלות יונים, מובילים ראשיים ומשניים כעת מטוהרים באופן שיגרתי ממערכות ביטוי Heterologous כמו גם מקורות טבעיים. גישות חדשות כדי לפקח על ביטוי, לשפר ולהקל על החילוץ ולשפר את היציבות של חלבונים אלו נמצאות בעיצומה פיתחו 1-5. פריצות דרך טכנולוגיות אלה כבר סייעו במפעילים הפיצוץ של מידע מבני ברמה האטומית על חלבוני קרום ש, בתורו, העמיקו את ההבנה של הבסיסים המבניים של תפקידם שלנו. בניגוד לכך, היכולת שלנו לחקור את התכונות פונקציונליות של החלבונים המטוהרים לא גדלה באותו קצב, כך שבמקרים מסוימים מידע מבני ברזולוציה גבוהה מלווה בנתונים פונקציונליים איכותיים, הגבלת היכולת שלנו לבדוק כמותית תחזיות המבוסס על מבנה וכך. לפיכך, development של מבחני פונקציונליים כמותי ולהכליל הוא צעד מפתח כלפי הבהרת היסודות מכניסטית של תפקוד חלבון קרום.
כאן אנו מתארים assay זרימה שיכול לשמש כדי לקבוע כמותית תכונות פעילות מרכזית של Cl מטוהר ומחדש - ערוצים ומובילים. העקרונות שבבסיס assay ניתן להכליל את מגוון רחב של מערכות תחבורה, כמו גם לחלבוני הובלת יון שאינו. ליפוזומים מחדש עם Cl מטוהרים - ערוץ / מובילים בנוכחות Cl גדול - שיפוע (איור 1 א ', ב'). Cl - זרימה היא ביוזמת התוספת של ionophore כדי לאפשר לשטף דלפק-יון, במקרה שלנו K + ionophore valinomycin, אשר לדחוק את המתח שהוקם על ידי Cl - השיפוע ולהגדיר את פוטנציאל הקרום הראשוני לפוטנציאל שיווי המשקל של K + 6,7. ללא tהוא ionophore לא Cl נטו משמעותי - בזרימת מתרחשת, כפי שהוא מונע על ידי הדור של פוטנציאל הטרנסממברני. הנתונים מתואר כמותית על ידי שני פרמטרים הניתנים למדידה (איור 1 ג): τ, מתמיד של Cl זמן - בזרימת, וf 0, את החלק היחסי של יפוזומים לא מכילים חלבון פעיל. מτ וf 0 Cl יחידתי - שיעור תחבורה, את החלק היחסי של חלבונים פעילים והמסה המולקולרית של המתחם הפעיל ניתן לגזור 8. הטכניקה מודגמת כאן על ידי שימוש proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1, H CLC-סוג מאופיין היטב + / Cl - מחליף של מבנה ותפקוד ידועים. assay זה להכליל בקלות לערוצים או מובילים עם הסלקטיביות יונית שונה או שפעילותם תלויה בנוכחות של מתח ו / או ligands. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי לקבוע אם מולקולות קטנות משפיעות ישירות על החלבון מחדש,כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות וכיצד הרכב קרום או חומרים כימיים המשנה את שומנים בדם משפיעים על התפקוד של הערוצים ומובילים מחדש אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ליפידים
- Aliquot שומני כמות הרצויה לתוך צינור זכוכית שקוף. השימוש E. תמצית coli קוטב שומנים בדם, אבל רוב יצירות שומנים ניתן להשתמש. אם השומנים הם בצורת אבקה, resuspend אותם בכלורופורם לריכוז של 20 מ"ג / מיליליטר. ייבש את השומנים בRT תחת N 2 גז עד שכל הממס התאדה.
- Resuspend השומנים בפנטן ולייבש אותו שוב זרם יציב של הגז N 2 כדי להסיר עקבות שאריות של כלורופורם. יבש עד שכל הממס התאדה. בעוד ייבוש, בעדינות לסובב את הצינור כך שהשומנים מופץ בסרט אחיד המכסה את השליש התחתון של הצינור ולא מסה צפופה ויוצרת בתחתית.
- הוסף את חומר הניקוי המכיל חיץ הכינון מחדש (300 מ"מ KCl, 50 חומצת לימון מ"מ, 25 מ"מ K 2 4 HPO, pH 4.5, 35 מ"מ בחורים) לפזר את השומנים. להשתמש בחומרי ניקוי עדינים אחרים בשלב זה אם החלבון הוא גרוע סובלני לבחורים.
- Resuspenד השומנים לבהירות באמצעות sonicator אמבט מים. לטבול את הצינור במרכז האמבטיה sonicator מים בכוח מרבי בפולסים קצרים (30 דקות שניות-1) עם (דקות שניות-1 30) קצרות עוצר. הפתרון צריך להיות ברור.
הערה: התואר האחרון של בהירות השיג תלויה בהרכב השומנים הספציפי בשימוש. איזו וריאציה בשלב זה, אצווה לתצווה אפילו בין שומנים להלכה זהים, הוא גם אפשרית. האובך שיורית הוא עקב פיזור אור על ידי חלקיקים גדולים בהשעיה, אשר ניתן להסירו על ידי צנטריפוגה. - דגירה שומני resuspended ב RT עבור 20-60 דקות.
2. כינונה Proteoliposome
הערה: מספר אסטרטגיות יכולה להיות מועסקות על מנת להכניס את חלבון אבקת-solubilized ליפוזומים. לCLC-ec1 דיאליזה עובדת היטב, ולכן השיטה של בחירה 6,9,10.
- הוסף את החלבון המטוהר לחלבון הרצוי לשומנים בדם (P / L) יחס (באו לידי ביטוי במיקרוגרם o f חלבון / מ"ג שומנים בדם). הבחירה של יחס P / L תלויה במטרת הניסוי.
- אם המטרה היא להעריך את הפעילות של החלבון של עניין, מחדש בP הגבוה L's על מנת למקסם את / האות, כמו כל liposome מכיל מספר עותקים של החלבון. כדי לכמת את הפעילות ו / או שיעור תחבורה אחיד של החלבון, מחדש במשטר דילול Poisson בP הנמוך / L's, כך שכל שלפוחית מכילה חלבון על 1 ממוצע. ראה שלב 7 ודיון ליותר בניתוח המעמיק של מתי להשתמש בכל משטר.
- כדי לקבוע את ערכי P / L אופטימליים למשטרים השונים, לבצע טיטרציה של הפעילות מלאה כפונקציה של ריכוז חלבון 8,11-13. עם זאת, לכל חלבון שהמשקל המולקולרי (MW, בא לידי ביטוי בKDA) של היחידה הפעילה ידוע ערכי L / P הבאים יכולים לשמש כguesstimates ראשוני:
pg "/>
- טען את החלבון ותערובת שומנים בצינור דיאליזה טרום רטוב או קלטת. מניחים את מכשיר הדיאליזה בכוס המכילה 500-1,000x היקף חיץ הכינון מחדש שומנים (כלומר, חיץ L 1 ל1 מיליליטר של resuspension שומנים בדם) תחת ערבוב עדין.
- חיץ שינוי 3-4 פעמים במרווחים> 3 שעות. בכל החלפת פתרון, לשטוף את הקלטת / צינורות ואת הכוס עם מים מזוקקים ולמלא את הכוס עם חיץ הכינון מחדש טרי. כולל 1-2 O מרווחי N / לשינוי הפתרון. המספר ומשך הזמן המדויק של שינויי הפתרון תלוי בשומנים המדויקים וחומרי הניקוי המשמשים.
- לאחר השלב האחרון הוא מלא, להסיר את יפוזומים מספינת הדיאליזה, aliquot אותם בצינורות ופלאש להקפיא אותם בנוזל N 2 או הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.
3. הקלטת Set-up
<p class = "jove_content"> הערה: הגדרת הקלטה (איור 2 א) מורכב משני תאים (צילינדרי תחתית שטוחה, ~ 3-4 מיליליטר נפח), Cl - (ראה להלן) אלקטרודה, מטר pH עם אנלוגי או פלט דיגיטלי חשמל, digitizer, ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה.- חבר את Cl - אלקטרודה למטר pH, הפלט של מטר pH לdigitizer אשר מחובר למחשב. מניחים את האלקטרודה ההתייחסות בחדר אחד וחוט הקידוד מחדש באחר (איור 2).
הערה: הקוטביות של החוטים נכונה אם ΔV קאל (ראה שלב 6.4 ו -7.2) הוא חיובי. - מניחים את התאים על צלחת ומערבבים עם בר ומערבב בחדר ההקלטה (איור 1). ודא שהבר והמערבב לא נוגע באלקטרודה.
- חבר את התאים באמצעות גשר אגר (איור 2) (100 מ"מ KCl ו -2% Agarose). אחסן את הגשרים אגר ב100 מ"מ KCl.
4. הכנת Cl - אלקטרודה
- קח אלקטרודת תפקוד שאינו ישנה ו-possibly-. לשבור את ציפוי הזכוכית כדי לחשוף את חוטי הכסף לחלוטין.
- מוציא בזהירות את הציפוי מחוטי הכסף באמצעות להב סכין מנתחים. נקה את החוטים באמצעות כמויות עצומות של H 2 O וEtOH.
- מקום בתמיסה רוויה של FeCl 3 (או אקונומיקה) עד חוטים מכוסה במעיל כהה אחיד של AgCl.
5. הכנת Unilamellar שלפוחית
- בלילה שלפני הניסויים, להתנפח 1 גרם של Sephadex G-50 חרוזים ב 15 מיליליטר של חיץ חיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K 2 SO 4, חומצת לימון 25 מ"מ, pH 4.5) עם רעד עדין (לא לעורר) ל לפחות 3 שעות בRT לפני השימוש. כל ניסוי דורש ~ 3 מיליליטר של חרוזים נפוחים. שמור את חרוזים הנפוחים על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לכל היותר.
- , בעוד ליפוזומים הם מפשירים בRT לשפוך בכל עמודה ~ 3 מ 'l של G-50 חרוזים נפוחים. לתת להם להתייבש על ידי זרימת כוח הכבידה בRT; זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות.
- הכן שלפוחית unilamellar באמצעות משייכת proteoliposomes 11 פעמים באמצעות מיני-Extruder באמצעות חתך 0.4 מ 'טפלון.
- מניחים את הטור בצינור עגול תחתית פלסטיק. ספין העמודות כדי להסיר פתרון עודף. צנטריפוגה למשך 20-30 שניות ב1,400 XG בצנטריפוגה קלינית.
- זורק זרימת דרך, עמודת מקום בצינור זכוכית 13 x 100 מ"מ ולהוסיף של שלפוחית extruded 100 μl לעמודה. ספין עמודת דקות 1 ב XG 500 בצנטריפוגה קלינית.
- לאסוף ~ 200 μl של זרימה דרך שיתווסף לתא ההקלטה בשלב 6.5.
6. בזרימת מדידה
- מקום 2 מיליליטר של 100 מ"מ KCl בהתייחסות הקאמרית (קרקע) ו -1.8 מיליליטר של החיץ החיצוני (1 מ"מ KCl, 150 מ"מ K 2 SO 4, 25 חומצת לימון מ"מ, pH 4.5) לתא ההקלטה. חוסר האיזון האוסמוטי הקל בין הפנימיופתרונות חיצוניים אינו משפיעים על
- הפעל את תכנית הרכישה. בואו הבסיס לאזן, זה עלול לקחת כמה דקות.
- ברגע שהאות מגיעה לבסיס יציב (ליפוזומים מוכנים ועמודות ייבוש), להתחיל בהקלטה (איור 3 א).
- הוסף 15 μl של פתרון מ"מ KCl 10 לכייל את המערכת (איור 2 א).
- הוסף ליפוזומים. קפיצה קטנה עשויה להיות גלויה בשל ההסרה חלקית של Cl החיצוני - מproteoliposomes (איור 3 א). חכה עד תחילת המחקר מייצב.
- להוסיף Valinomycin (1 μl ב1 מ"ג / מיליליטר בEtOH) ליזום בזרימת (איור 3 א).
- בואו הזרימה מיצתה את עצמו הזמן עד שהוא מישורים (איור 3 א).
- הוסף 40 μl 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) שהוכן במאגר החיצוני לפזר כל יפוזומים (איור 3 א). לסיים את ההקלטה.
7. נתוניםnalysis
- לייצא את קובץ זכר בפורמט ASCII או טקסט ולייבא אותו לתכנית הניתוח של בחירה.
- מדוד את מתח בנקודות הבאות (איור 3 א):
בתחילת ההקלטה (V 0);
לאחר תוספת של דופק הכיול (V cal);
לאחר תוספת של יפוזומים (שאיבת V);
בסופו של הזרימה (סנפיר V);
לאחר תוספת של חומרי ניקוי (tot V);
Baseline המתחים כך שV 0 = 0. - השתמש במשוואת נרנסט-פלאנק כדי לקבוע את הערך הניסיוני של
על ידי מדידה 
איפה כרך קאל הוא הנפח של דופק הכיול בμl, 1,800 הוא קאמרי הנפח בתחילת הניסוי בא לידי ביטוי ב1; l, [Cl] קאל / בהוא Cl - ריכוזים של דופק הכיול ולמאגר החיצוני במ"מ וΔV cal הוא הקפיצה בmV נמדדה לאחר דופק הכיול.
הערה: קביעה אמפירית זה של α משרתת שלוש מטרות: הוא מבטיח כי המערכת מגיבה כראוי, מציעה מידה מסוימת של העקביות של התגובה של המכשיר בין ניסויים, כמו גם לבדוק שאין טעויות נעשו בהתהוות הפתרון. - חשב את ריכוזי Cl לאחר כל שלב באופן הבא:
הגורם 3/400 מגיע מהירידה בשיעור דופק כיול 15 μl לתוך הנפח הסופי 2,000 μl. - Calculאכלתי את השינויים ב[ Cl] בכל שלב, שאיבת ΔCl / סנפיר / tot.
- המרת V (t) בCl (t) עם
ישירות לקבוע את הערכים [Cl] בנקודות הקריטיות ולהשוות אותם לערכים מחושבים כבקרה פנימית. - לנרמל את העקבות כך ששאיבת rel = 0 Cl וCl rel tot = 1
- להתאים את מהלך הזמן בזרימת למשוואה הבאה:
כאשר L הוא שיעור Cl - הדליפה שנקבע באופן ניסיוני על ידי מדידת Cl - זרימה מיפוזומים ללא חלבון מוכן באותם תנאים וτ הוא מתמיד של התהליך הזמן. - לחשב v, המהירות ההתחלתית:
איפה סנפיר ΔCl בא לידי הביטוי בmillimolar וV הוא הנפח של החדר בμl. - לחשב את שיעור תחבורה / מוליכות
איפה p הוא P / L, MW הוא המשקל המולקולרי של המתחם הפעיל בא לידי ביטוי בkDa
על ידי מדידה 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים פרוטוקול מפורט וחזק כדי למדוד Cl - תחבורה בתיווכו של CLC-ec1 המטוהר, H פרוקריוטים CLC הסוג + / Cl - מחליף, מחדש ביפוזומים. ייצוג סכמטי של הניסוי מוצג באיור 3 Proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1 מטוהר ומכיל Cl הפנימי גבוה -. שקוע בפתרון אמבטיה המכיל Cl הנמוך -. תחת Cl תנאים אלה נטו - בזרימת נמנעת על ידי ההצטברות של מטען החיובי ביפוזום (איור 3 א). תוספת של Valinomycin מאפשרת K + לנוע על פני הקרום וכך הסטת הפוטנציאל החשמלי וייזום Cl - זרימה (איור 3). כמובן זמן השטף מנוטר באמצעות Cl - אלקטרודה -selective והסכום הכולל של Cl - הכלול בשלפוחית נמדדות ישירות על ידי solubilizing שימוש בחומר ניקוי. מאלהניסויים בתפזורת ניתן לקבוע מאפיינים של חלבונים בודדים מחדש, כגון תחלופה, הרכב של מורכב וחלקם הפעילים של חלבון פעיל. שימוש במשוואות 7-9 להתאים את מהלך הזמן בזרימת ולהעריך את שיעור התחבורה האחיד של CLC-ec1 אנו מוצאים כי τ (0.2 מיקרוגרם / מ"ג) = 41 שניות וf 0 (0.2 מיקרוגרם / מ"ג) = 0.31, מצביעים על כך ש~ 1 / 3 ליפוזומים מכיל 0 חלבונים פעילים. מהערכים אלה אנו מחשבים כי שיעור התחבורה האחיד הוא γ ~ 2500 Cl - שניות -1, בהסכם טוב עם ערכים שפורסמו 8,14.
ייצוג סכמטי של Cl - assay -efflux ליפוזומים ללא חלבון (A) או CLC-ec1 Cl - - assay הזרימה (B): איור 1.שלפוחית מחדש (B). בזרימת מproteoliposomes (שחור) או ליפוזומים ללא חלבון (קו מקווקו אפור) - כמובן זמן סימולציה של Cl ביוזמת ionophore (C). הזרימה היא שיזמה תוספת של ionophore (*) והופסקה על ידי התוספת של חומר ניקוי לפזר יפוזומים (^). Red קו מקווקו הוא בכושר מעריכי לקבוע הזמן קבוע, τ, של Cl -. בזרימת מיפוזומים המכילים לפחות 1 עותק פעיל של CLC-ec1 וf 0 הוא שבריר של יפוזומים המכילים 0 חלבונים פעילים אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ההקלטה להגדיר () ההקלטה להגדיר.. תקריב של התאים (B). <href = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: עקבות לדוגמא וניתוח () עקבות V אופייני (t) של ניסויים בזרימת מproteoliposomes מחדש עם WT CLC-ec1 בP / L / מ"ג 0.2 מיקרוגרם.. חצים מצביעים על הזמנים של תוספת של דופק KCl כיול, ליפוזומים, valinomycin וβ-OG. קווים מקווקווים מציינים את ערכי ΔV בשלבים שונים. V העקבות (B) (t) מומרת לCl (t) באמצעות משוואה 5, משוואה באמצעות מנורמלת 6 ואת הזמן בזרימת כמובן הוא לנכון משוואת 7 (קו אדום מקווקו). (ג) קורסי זמן בזרימת מנורמלים מproteoliposomes מחדש עם WT CLC-ec1 על 0.2 מיקרוגרם / מ"ג L / P (שחור) או בשעה 5 מיקרוגרם P / mg / L (אפור). קַו רְסִיקים הוא מתאים ביותר של קורסי זמן בזרימת למשוואת 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תיארנו פרוטוקול מפורט למדידת Cl - תחבורה בתיווכו של ערוצי אניון סלקטיבי מטוהרים או מובילים מחדש ביפוזומים. הדוגמא בה השתמשה הייתה H + / Cl פרוקריוטים - מחליף CLC-ec1. עם זאת, מתודולוגיה ניתן להתאים בקלות ללמוד ערוצים מגודר על ידי ligands 12,13,15, מתח 11,12, או ספורטיבי סלקטיביות anionic שונה 15,16 על ידי החלפת Ag: אלקטרודה AgCl עם אחד מתאים ליונים תחת שיקול. אלקטרודות סלקטיבית ליונים אחרים מאשר Cl -, כגון + H, I - וF -, זמינים מסחרי.
דיון בחלק מהשלבים וההנחות הקריטיים מעקב.
גבולות ההנחה דילול פואסון
הגזירה של השיעור האחיד (משוואת 7-9) תקפה רק במשטר דילול פואסון, כאשר המשך ביותר ליפוזומיםעין חלבון פעיל אחד בלבד, כך שההסתברות שיש עותקים מרובים בשלפוחית נתון היא נמוכה וקבועת זמן בזרימת מקרוסקופית של אוכלוסיית השלפוחית מקורבת היטב על ידי זה של יפוזומים המכילים חלבון יחיד. ואכן, השוואה של Cl - כמובן זמן בזרימת בתיווכו של יפוזומים מחדש עם CLC-ec1 בנמוך (שחור, 0.2 מיקרוגרם / מ"ג) וגבוה P L / (, 5 מיקרוגרם / מ"ג האפור) (איור 3 ג) מראה כי ב המקרה האחרון קינטיקה הזרימה להיות מהיר יותר וירידות 0 f, מצביע על כך שחלק קטן יותר של יפוזומים הכולל מכיל 0 חלבונים. הסכום הכולל של Cl - הכלול בשתי דגימות השלפוחית היה דומה, ~ 0.7 ו~ 0.55 μmoles בהתאמה, המצביע על כך הכרכים הפנימיים המוחלט של שלפוחית בשתי הדגימות היו דומים, וכי כמות החלבון מחדש אינה משפיעה על הגודל של שלפוחית. התאמה כמובן הגבוהה P / L בזרימת זמן משוואת 7 מייצרת ערכים של τ ; (5 מיקרוגרם / מ"ג) = 8.8 שניות וf 0 (מיקרוגרם 5 / מ"ג) = 0.06, מצביע על כך שרק ~ 6% מהשלפוחית אינה מכילים הדימרים CLC-ec1 פעילים בניגוד ל~ 31% נמצאים כאשר P / L = 0.2 מיקרוגרם / מ"ג. לפיכך, אומדן שיעור התחלופה האחיד בL / P גבוה הוא Cl γ ~ 450 - שניות -1, כמעט פי 6 נמוכים מזו המתקבלת בP / L נמוך ושל נתונים שפורסמו 8,14. לכן, ניתוח של קורסי זמן בזרימת מיפוזומים מחדש בגבוה P / L's יהיה לזלזל בשיעור האחיד של תחבורת החלבון מחדש. לכן, כדי לקבוע במדויק את שיעור התחבורה האחיד של חלבון חדש זה הוא בעל חשיבות המרכזית כדי לקבוע את כמות החלבון מחדש בדיוק ולעבוד בP הנמוך / L's, במשטר דילול פואסון. זו מושגת באופן אידיאלי על ידי קביעת ניתוח טיטרציה חלבון מלא כדי לזהות את המשטר האופטימלי לעבודה ב.
קביעת המסה של המתחם הפעיל
אוהל "> הניתוח שתואר לעיל מניח כי ההרכב של המתחם הפעיל ידוע והחלבון מחדש הוא פעיל באופן מלא. ואולם, להכנות חדשות כמויות אלה עלולים שלא להיות ידועים מראש. במקרה זה ניתן לקבוע ישירות פרמטרים אלה על ידי מדידת f 0 s 'בחלבון שונה ליחסי שומנים
כאשר p היא צפיפות החלבון, 
, Ρ הוא מספר ליפוזומים למסה של שומנים בדם, N הוא מספר אבוגדרו, M P הוא המסה של מתחם הערוץ הפונקציונלי וφ הוא את החלק היחסי של חלבונים פעילים. על ידי התאמה הנחושה בניסוי f 0 s 'בחלבון שונים ליחסי שומנים זה possible לקבוע p 0, ולכן M P וφ.
חלק סופי של יפוזומים הוא עקשן להתאגדות
הגזירה של שיעור התחבורה האחיד מניחה כי בגבוה P / s L'כל יפוזומים יכילו חלבון תחבורה פעיל אחד לפחות. עם זאת, בחלק ממקרים זה כבר מצא לא להיות המקרה: בגבוה P / חלק משמעותי של L'של יפוזומים נותר עקשן לכינון מחדש של חלבונים מסוימים 11-13,17. בעוד המקור של תופעה זו אינו ברור ניתן לשער כי חלבונים גדולים יותר עשויים להיות מחוץ שלפוחית עם רדיוסים קטנים יותר וכך להקטין את מספר יפוזומים הזמינים.
במקרה זה משוואת 10 צריך להיות שונה כדי: 
שבו θ הוא שבריר של יפוזומים עקשן לproteiהתאגדות n. חשוב לציין, ρ וφ מושפע גם משיטת הכינון מחדש מאז נהלים השונים יהיו החלמה שונה לשומנים וחלבונים בכינון מחדש liposome והיווצרות. בהנחת תשואה של 100% לשני תוביל לאי-הערכה של γ. לכן, כדי לקבל quantitation מדויק של מחזור / מוליכות האחידה חשוב לקבוע באופן ניסיוני את החלק היחסי של שומנים וחלבונים שאבדו במהלך הכינון מחדש 8,11.
אוריינטציה של החלבונים מחדש
אחת מהנחות שנעשו במהלך הניתוח הוא שכל החלבונים מחדש הם ביצועים מקבילים. עם זאת, ערוצים ומובילים רבים מעדיפים כיוונים של משלוחים, תופעה הידועה בתיקון. א-סימטריה תפקודית זה עלולה להוביל לשגיאת הערכה בתחלופה. יתר על כן, את הכיוון של החלבונים מחדש הוא אפריורי + הדרגתיים, לערוצים או מובילים שligand- או מתח תלוי.
שיקולים בהקמתה של יפוזומים הדוקים
אחד מגורמי המפתח המאפשרים o השימושf assay הזרימה המתוארת כאן הוא ההיווצרות של יפוזומים הדוקים. שלושה משתנים חשובים כדי להיחשב למטרה זו הם הבחירה של חומר ניקוי המשמשת לsolubilize החלבון, אסטרטגית חומר ניקוי להסרה והבחירה של הרכב שומנים של יפוזומים. בפרוטוקול המובא כאן, CLC-ec1 הוא solubilized בDecyl-Maltopyranoside (DM), אבקת כביסה עם ערך קריטי ריכוז גבוה micelle (CMC) אשר על כן יוסר בקלות. עם זאת, מגוון רחב של חומרי ניקוי סינטטיים וטבעי שנוצלו כדי לטהר את החלבונים שמחדש לאחר מכן ביפוזומים הדוקים ללא תופעות על האטימות של שלפוחית. יש חומרי ניקוי אלה מגוון רחב של CMCs, גבוה ככל millimolar (כגון DM או digitonin) ונמוך כמו מייקרו (כגון Dodecyl- Maltopyranoside (DDM) או dioctylpropane-bis-maltopyranoside (DMNG)). חשוב לציין, עם זאת, כי השומנים משמשים ליצירת ליפוזומים הם solubilized באמצעות בחורים, או אחר חומר ניקוי עדין, ולכן מיצלות ההיברידית הנובעת מהתערובת של חלבונים ושומנים עשויה להיות בעלי תכונות chemico-פיזי שונות מאלו של חומרי ניקוי ההורה. ניתן, אפוא, כי במקרים מסוימים להסרת חומר הניקוי שיורית שיכולים לערער את יציבות ליפוזומים מובילים להדלפות בולטות יותר. כדי לעקוף בעיה זו מומלץ לחקור אסטרטגיות הסרת חומר ניקוי חלופיות, כגון biobeads 12,13, עמודות ספין סינון 15 או 18 ג '. לבסוף, הרכב השומנים של שלפוחית הוא פרמטר חשוב כתערובות ספציפיות עשויות להיות דולפות ליונים שונים בתנאים מסוימים. לדוגמא, ליפוזומים נוצר מE. תמצית שומנים קוטבית coli הן הדוקות לCL - ב- pH של חומצי אבל הפך יותר ויותר דולף כמו pH מגדיל 19 או יפוזומים נוצרו מ3: תערובת 1 של phosphatidyl-ethanolamine 1-palmitoyl-2-oleoyl (אפיפיור) ו1-palmitoyl- 2-oleoyl phosphatidylglycerol (POPG) להציג חדירות נמוכות בהרבה לH + מאלה שנוצרו מE. שומנים קוטביים coli לחלץ 20. חשוב לציין, עם זאת, כי בהרכב השומנים בדם של שלפוחית עלול להשפיע גם על הפעילות של 13,21,22 חלבון מחדש. לפיכך, חשוב לקבוע באופן מדויק את המאפיינים של שלפוחית ללא חלבון מוכן בכל מצב ולאחר מכן להעריך כיצד זה משפיע על המאפיינים של החלבון מחדש.
הכללה לערוצי CLC סוג הלא ומובילים
Assay הזרימה, כפי שתואר כאן, יכול להיות מנוצל באופן ישיר כדי לקבוע את תכונות מולקולה בודדות של כל Cl - ערוץ או טרנספורטר -selective, ולמשל נעשה שימוש כדי לאפיין את התכונות של Ca 2 + Cl -activated - ערוץ 12 TMEM16A . עכשיו אנחנו דנים איך להתאים את assay הזרימה לחקור את המאפיינים של מובילים או channאלס שאינם Cl - סלקטיבית ו / או שיש לי שיעורי תחבורה יחידתי, כי הם שונים באופן משמעותי מהשניות ~ 10 3 יון -1 של CLC-ec1.
המקרה הפשוט ביותר הוא שהחלבון הנחקר הוא אניון סלקטיבי. במקרה זה יש צורך ההתאמה היחידה היא להחליף את Ag: אלקטרודה AgCl עם זמין מסחרי אחד סלקטיביות מתאימה, כפי שנעשה לF - Flucs -selective וCLCs 16,23,24 או אני - ערוצים חדירים כגון 15 CFTR . אם, לעומת זאת, החלבון מחדש הוא סלקטיבי לקטיונים, יש ionophore אחר מאשר valinomycin לשמש כדי ליזום בזרימת. בהתחשב במחסור בCl תוקף - יונופורים תחליף שימושי הוא H + ionophore, כגון 4 phenylhydrazone קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy) (FCCP). במקרה זה חשוב לוודא שpH intravesicular נשמר קבוע, למשל על ידי הגדלת המאגרing קיבולת של הפתרון הפנימי. אסטרטגיה חלופית היא לעקוב בזרימת קטיון דרך ערוץ או טרנספורטר מחדש באמצעות פרוטונים כcounterion וניטור H + הובלה באמצעות מד pH 25 או בדיקה pH רגיש ratiometric 26. עם זאת, הטבע העקיף של מדידות אלה הופך כימות של מאפייני התחבורה של החלבון מחדש קשה. לבסוף, אלקטרודות סלקטיבית למספר קטיונים הקיימים וזמינים באופן מסחרי. תרחיש שלישי הוא שהחלבון הנחקר הוא חדיר לשני אניוני וקטיוני, למשל ערוץ גרוע סלקטיבית 13 או קטיון / Cl - cotransporter. במקרה זה, ליפוזומים מחדש לא לשמור על שיפוע KCl במהלך תהליך החלפת פתרון (שלבים 5.4-5.5), כך שהם מאבדים את תוכן מלחם. לכן במקרה זה כל המידע הקינטית הולך לאיבוד. עם זאת, את החלק היחסי של יפוזומים המכיל prot לפחות אחד פעילעין, f 0, עדיין יכול להיקבע על ידי הוספת חומר ניקוי ומדידת השייר לכוד Cl - התוכן (שלב 6.8). זה מאפשר לקביעת המסה המולקולרית של החלבון על ידי ביצוע טיטרציה חלבון ובאמצעות משוואה 10.
היבט נוסף שיש לשקול הוא את האפשרות ששיעור תחבורה אחידה של החלבון מחדש הוא סדרי הגודל שונים מזה של CLC-ec1. לדוגמא, יש לי ביותר המובילים שיעורי מחזור של 1-10 שניות -1, 2-3 סדרי גודל נמוך מCLC-ec1, ואילו יוני התנהלות ביותר הערוצים ב 10 6 -10 7 שניות -1, 3-4,000 פי מהר יותר מאשר CLC -ec1. למובילים איטיים השיעור של Cl - דליפה מיפוזומים ללא חלבון יכול להיות מגביל, כמשקלו היחסי בעליות תהליך הזרימה בירידת שיעור תחבורה של החלבון. מניסיוננו שיעור הדליפה משתנה במידה מסוימת בין הכנות והוא בדרך כלל בסדר הגודל שלכמה שניות יון -1. לכן, כאשר עובדים עם מובילים איטיים רצוי להכין צד יפוזומים ללא חלבון על ידי צד אחד לכינון מחדש כדי למדוד את הדליפה המתאימה לכל מנה של שלפוחית בצורה מדויקת. Assay הזרימה שמש בהצלחה כדי לקבוע את השיעור האחיד של מובילים איטיים עם שיעורי תחלופה סביב 1-10 שניות יון -1, כגון CLC cyanobacterial 27. המצב ההפוך מתרחש כאשר החלבון מחדש יש מוליכות גבוהות, לדוגמא ערוץ יון. במקרה זה קינטיקה בזרימת מהירה מדי להיפתר כזמן ערבוב (~ 1-2 שניות) ואת זמן תגובה הפנימי של האלקטרודה ההקלטה הפכה שיעור הגבלה. במקרה זה, המידע הקינטית איבד אבל המסה של המתחם הפעיל עדיין יכולה להיקבע 24. ראוי לציין כי גישות אחרות, כגון הקלטות bilayer שומנים מישוריים או ליפוזומים הידוק התיקון מתאימים יותר ללמוד תעלות יונים מטוהרים כte אלהchniques ישירות לספק מידע מולקולה בודד עם רזולוציה זמן גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
