Introduction
В последние два десятилетия способность сверхэкспрессировать и очистить мембранные транспортные белки, резко возросло: ионных каналов, первичные и вторичные транспортеры настоящее время регулярно очищается от гетерологичных системах экспрессии, а также природных источников. Новые подходы к мониторингу выражение, улучшить и облегчить добычу и повышают устойчивость этих белков постоянно разрабатываются 1-5. Эти технологические прорывы сыграли важную роль в инициировании взрыва структурной информации атомного уровня на мембранных белков, которые, в свою очередь, усилили нашу понимания структурных основ их функции. В отличие от этого, наша способность исследовать функциональные свойства очищенных белков не увеличится с той же скоростью, так что в некоторых случаях структурная информация высокого разрешения сопровождается качественными функциональных данных, тем самым ограничивая нашу способность количественно тестовой структуры на основе прогнозов. Таким образом, РАЗРАБОТКАт количественных и обобщению функциональных анализов является важным шагом на пути к выяснению механистических основ функции мембранных белков.
Здесь мы описываем оттока анализа, который может использоваться для количественного определения ключевых функциональные свойства очищенной и восстановленных Cl - каналов и транспортеров. Принципы, лежащие в основе анализа могут быть обобщены на различных транспортных систем, а также лицам, не являющимся ионно-транспортировки белков. Липосомы восстанавливали с очищенными Cl - канал / Транспортировка в присутствии большого Cl - градиента (рис 1а, б). Cl - истечение инициируется добавлением ионофора, чтобы обеспечить поток контр-ионов, в нашем случае К + ионофор валиномицина, которые шунта напряжение, установленную Cl - градиент и установить начальный мембранный потенциал к равновесному потенциалу К + 6,7. Без тон не ионофором никакого существенного чистый Cl - истечение происходит, как это предотвратить генерации трансмембранного потенциала. Данные количественно описывается двумя измеряемых параметров (Рисунок 1С): τ, постоянная времени Cl - истечение, и F 0, фракции липосом, не содержащих активный белок. С τ и F 0 унитарное Cl - транспорт скоростью, доля активных белков и молекулярная масса активного комплекса может быть получена 8. Способ показан здесь с помощью Протеолипосомы восстановленные с CLC-EC1, хорошо охарактеризованной CLC-типа Н + / Cl - теплообменник известной структуры и функции. Этот анализ легко обобщается на каналы или транспортеры с разной ионной избирательности и чья деятельность зависит от наличия напряжения и / или лигандов. Кроме того, этот анализ может быть использован, чтобы определить, является ли малые молекулы, непосредственно влияет на восстановленный белок,Для количественной оценки влияния этих соединений и, как состав мембраны или липидные модификации реагенты влияют на функцию восстановленных каналов и транспортеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. липидов Подготовка
- Алиготе требуемое количество липидов в прозрачной стеклянной трубки. Ты Видишь. палочка полярный липидный экстракт, но большинство липидов композиции могут быть использованы. Если липиды в форме порошка, ресуспендируют их в хлороформе до концентрации 20 мг / мл. Высушите липидов при комнатной температуре под N 2 газа, пока все растворитель испаряется.
- Ресуспендируют липидов в пентана и сушат его снова постоянный поток газа N 2 для удаления оставшихся следов хлороформа. Сухая, пока весь растворитель не испарится. В то время как сушка, осторожно повернуть трубку таким образом, что липидный распространяется в однородной пленки, покрывающей нижнюю треть трубки, а не образующего плотную массу в нижней части.
- Добавить восстановление буфера, содержащего моющее средство (300 мМ KCl, 50 мМ лимонной кислоты, 25 мМ K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 мМ CHAPS), чтобы растворить липиды. Используйте другие мягкие моющие средства для этого шага, если белок плохо терпимо к гл.
- ResuspenD липиды ясности с использованием водяной бани ультразвукового. Погрузить трубку в центре обработки ультразвуком воды бане при максимальной мощности короче (30 сек-1 мин) импульсы с короткой (30 сек-1 мин) паузы. Решение должно стать ясно.
ПРИМЕЧАНИЕ: конечная степень ясности достигнуто, зависит от конкретного состава липидов используется. Некоторые вариации от партии к партии на этой стадии, даже среди номинально идентичных липидов, также возможно. Остаточный мутности из-за рассеяния света крупными частицами в суспензии, которые могут быть удалены путем центрифугирования. - Инкубируйте ресуспендировали липидов при комнатной температуре в течение 20-60 мин.
2. Proteoliposome Формирование
Примечание: несколько стратегий можно использовать для вставки моющего средства, солюбилизированного белка в липосомы. Для CLC-EC1 диализ работает хорошо и поэтому методом выбора 6,9,10.
- Добавить очищенный белок нужный белок-чтобы-липида (P / L) соотношение (выраженное в мкг O F белок / мг липида). Выбор коэффициента P / L зависит от целей эксперимента.
- Если цель состоит в том, чтобы оценить активность белка, представляющего интерес, восстановить при высокой P / L с максимально сигнал, так как каждый липосом содержит несколько копий белка. Для количественной оценки активности и / или унитарную скорость транспортного белка, восстановить в разведении режима Пуассона при низких P / единиц, так что каждый пузырек содержит в среднем 1 белка. См Шаг 7 и обсуждение на более глубокий анализ, когда использовать каждый режим.
- Для определения оптимальных значений P / L для различных режимов, выполнить полную титрование деятельности в зависимости от концентрации белка 8,11-13. Тем не менее, для любого белка, для которых молекулярная масса (MW, выраженного в кДа) активного блока известны следующие значения P / L могут быть использованы в качестве исходных guesstimates:
PG "/>
- Загрузка белок и липидной смеси в предварительно увлажненной диализа трубки или кассеты. Поместите диализа устройство в химический стакан, содержащий 500-1,000x объем буфера липидов восстанавливающей (т.е. 1 л буфера для 1 мл липидной ресуспендирования) при осторожном перемешивании.
- Изменить буфер 3-4 раза с интервалом в> 3 ч. В каждой смене раствора, промойте кассета / трубки и стакан с дистиллированной водой и заполнить стакан со свежим буфером восстановления. Включить 1-2 O / N интервалов для решения меняются. Точное количество и продолжительность раствора изменяется в зависимости от конкретного липида и моющих средств, используемых.
- После последнего шага завершена, удалите липосом из диализной судна, аликвоту их в трубах и флэш заморозить их в жидком N 2 или заморозить при температуре -80 ° C.
3. Запись Set-до
<P CLASS = "jove_content"> Примечание: запись настройки (2А) состоит из двух палат (плоскодонных цилиндров, ~ 3-4 мл объема), в Cl - (см ниже) электрод, рН-метр с аналоговым или цифровой выходной электрический, дигитайзер, и компьютер с соответствующим программным обеспечением сбора данных.- Подключение Cl - электрод рН-метра, выход рН-метра к цифровым преобразователем, который подключен к компьютеру. Поместите электрод сравнения в одной камере и перекодирования провод в другой (рис 2б).
ПРИМЕЧАНИЕ: полярность проводов правильная, если у Av Cal (см Шаг 6.4 и 7.2) положительно. - Поместите камеры на мешалке с мешалкой в записи камеры (рис 1б). Убедитесь в том, мешалки не прикасайтесь к электроду.
- Подключите камеры, используя агар мост (рис 2B) (100 мМ КСl и 2% агарозном). Храните мосты агара в 100 мМ KCl.
4. Подготовка Cl - Электрод
- Возьмите старый и -possibly- нефункционирующих рН электрод. Разбить стекло покрытие полностью раскрыть серебряные провода.
- Осторожно снимите покрытие из серебра проводов, используя лезвие скальпеля. Очистите провода, используя обильное количество H 2 O и этанола.
- Место в насыщенном растворе FeCl 3 (или отбеливателя) до проводов покрыты однородным слоем темно-AgCl.
5. Получение однослойные везикулы
- Ночь перед экспериментов, зыбь 1 г Сефадекса G-50 шариков в 15 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K 2 SO 4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) при осторожном встряхивании (не мешают) для по меньшей мере, 3 ч при комнатной температуре перед использованием. Каждый эксперимент требует ~ 3 мл набухшего бисером. Держите опухшие бисером при 4 ° С в течение нескольких дней максимум.
- В то время как липосомы тают при комнатной температуре, влить в каждый столбец ~ 3 мл опухших G-50 шариков. Дайте им высохнуть самотеком при комнатной температуре; это, как правило, занимает 1-2 мин.
- Подготовка однослойные везикулы экструзией Протеолипосомы 11 раз через мини-экструдере с использованием 0,4 м тефлоновую среза.
- Поместите колонку в пластиковом круглым дном трубки. Спин столбцы, чтобы удалить излишки раствора. Центрифуга в течение 20-30 сек при 1400 мкг в клинической центрифуге.
- Выбросить, положите столбец в 13 х 100 мм стеклянной трубки и добавить 100 мкл экструдированных везикул в колонке. Спин колонка течение 1 мин при 500 х г в клинической центрифуге.
- Соберите ~ 200 мкл проточные, которые будут добавлены к записи камеры в шаге 6.5.
6. Efflux Измерение
- Поместите 2 мл 100 мМ KCl в контрольном (земля) камеры и 1,8 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K 2 SO 4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) в записи камеры. Небольшой осмотическое дисбаланс между внутренними внешние решения не влияет
- Запустите программу приобретения. Пусть исходная равновесие, это может занять несколько минут.
- После того, как сигнал достигнет стабильного базовой линии (липосомы готовы и столбцы сухой), начните запись (рис 3а).
- Добавить 15 мкл 10 мМ KCl решение для калибровки системы (рис 2а).
- Добавить липосомы. Небольшой скачок может быть видна из-за неполного удаления внешнего Cl - от протеолипосом (3А). Подождите, пока базовый стабилизируется.
- Добавить валиномицина (1 мкл при концентрации 1 мг / мл в этаноле), чтобы инициировать отток (фиг.3А).
- Пусть истечение запустить его ход времени, пока не наступит плато (рис 3А).
- Добавить 40 мкл 1,5 М β-октилглюкозида (β-OG), полученного в внешнего буфера для растворения всех липосом (фиг.3А). Конец записи.
7. Данныенализ
- Экспорт файла трассировки из в формате ASCII или текстовом и импортировать его в программу анализа выбора.
- Измерьте напряжение в следующих пунктах (3А):
В начале записи (V 0);
После добавления калибровочного импульса (V CAL);
После того липосом (V липо);
В конце оттока (V ребра);
После добавления моющего средства (V TOT);
Базовый уровень напряжения, так что V 0 = 0. - Используя уравнение Нернста-Планка для определения экспериментальное значение
путем измерения 
Где Vol Кэл объем калибровки импульса в мкл, 1800 в объем камеры в начале эксперимента выражается в1, л, [Cl] кал / в являются Cl - концентрация калибровочного импульса и внешнего буфера в мм и у Av кал является скачок в мВ измеряется после калибровки импульса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это эмпирическое определение α служит трем целям: он гарантирует, что система должным образом реагирует, предлагает меру согласованности ответ прибора между экспериментов, а также проверьте, нет ли ошибки не были сделаны в процессе становления решений. - Рассчитайте концентрации хлора после каждого следующего шага:
Коэффициент 3/400 происходит от разведения калибровки импульса 15 мкл в 2000 мкл конечного объема. - Calculели изменения в [CL] на каждом шаге, ΔCl липосакции / FIN / малыш.
- Преобразование V (T) в Cl (Т) с
Непосредственно определить [CL] значения в критических точках и сравнить их с расчетными значениями в качестве внутреннего контроля. - Нормализация проследить, чтобы Cl отн липо = 0 и Cl отн малыш = 1
- Установите время отток курс к следующему уравнению:
Там, где L представляет собой скорость Cl - утечки, что определяется экспериментально путем измерения Cl - отток из небелковых липосом, полученных в тех же условиях, и τ является постоянной времени процесса. - Рассчитать V, начальную скорость:
Там, где ΔCl ребра выражается в миллимолей и V представляет собой объем камеры в мкл. - Рассчитайте транспорт / скорость проводимости
Где р P / L, МВт является молекулярная масса активного комплекса выражены в кД
путем измерения 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы описываем подробный и надежный протокол для измерения Cl - транспорт, опосредованный очищенной CLC-EC1, прокариотической CLC-типа Н + / Cl - теплообменник, восстановленного в липосомы. Схематическое представление опыта показана на рисунке 3 Протеолипосомы восстановленные с очищенной CLC-EC1 и содержащий большой внутренней Cl -. Погружены в растворе ванны, содержащем низкую Cl -. В этих условиях чистой Cl - истечение препятствует накоплению положительного заряда в липосомы (рис 3а). Добавление валиномицина позволяет K +, чтобы перемещаться по таким мембрана шунтирования электрического потенциала и инициирование Cl - истечение (рис 3б). Поток времени Конечно осуществляется с использованием Cl - селективные электрод и общее количество Cl -, содержащийся в пузырьках непосредственно измеряется путем солюбилизации их с помощью моющего средства. Из нихсыпучие эксперименты можно определить свойства отдельных восстановленных белков, таких как скорость оборота, стехиометрии активного комплекса и фракции активного белка. Используя уравнения 7-9, чтобы соответствовать времени истечения курс и оценить унитарное скорости переноса CLC-EC1 мы находим, что τ (0,2 мкг / мг) = 41 сек и F 0 (0,2 мкг / мг) = 0,31, что свидетельствует о ~ 1 / 3 липосом содержит 0 активные белки. Из этих значений мы рассчитываем, что унитарное ставка транспорт γ ~ 2500 Cl - с -1, что хорошо согласуется с опубликованными значениями 8,14.
Рисунок 1: Cl - истечение анализ (A - B) Схематическое представление Cl - -efflux тест для безбелковых липосом (А) или CLC-EC1.восстановленные везикулы (б). (C) Время симуляции курс ионофором инициативе Cl - истечение из протеолипосомах (черный) или безбелковых липосом (серый пунктирная линия). Efflux инициируют добавлением ионофора (*) и останавливали добавлением моющего средства, чтобы растворить липосомы (^). Красная пунктирная линия экспоненциального подходит для определения постоянной времени, τ, хлора -. Отток из липосом, содержащих по крайней мере, 1 активную копию CLC-EC1 и F 0 фракция липосом, содержащих 0 активные белки Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.
Рисунок 2: Запись создана () Запись создана.. (B) Крупный план из камер. <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" TARGET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Пример след и анализ (A) Типичный V (T) следы истечения экспериментов с протеолипосомах восстановленных с WT CLC-EC1 в 0,2 мкг / мг P / л.. Стрелки указывают времена добавлением KCl калибровки импульса, липосомы, валиномицина и β-OG. Пунктирные линии указывают значения у Av на различных этапах. (B) V (T) след превращается в Cl (T), используя уравнение 5, нормированную, используя уравнение 6 и времени истечения Конечно пригодный к уравнению 7 (красная пунктирная линия). (C) нормированное время курсы отток из протеолипосомах восстановленных с WT CLC-EC1 в 0,2 мкг / мг P / L (черный) или на 5 мкг / мг P / L (серый). Пунктирс лучше всего приступы времени истечения курсов уравнения 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали подробный протокол для измерения Cl - транспорт, опосредованный очищенных анион-селективным каналов или перевозчиков восстановленных в липосомы. Пример был использован прокариотической H + / Cl - теплообменник CLC-EC1. Тем не менее, методика может быть легко адаптированы для изучения каналов стробированных лигандами 12,13,15, 11,12 напряжения или спортивных другую анионную селективность 15,16 заменой Ag: электрод AgCl с одним подходящим для рассматриваемого иона. Электроды селективными в отношении других, чем Cl ионов -, таких как H +, I - и F -, являются коммерчески доступными.
Обсуждение некоторых из важнейших шагов и допущений следовать.
Пределы разбавления предположении Пуассона
Вывод унитарного скорости (уравнение 7-9) справедливо только в разведении режима Пуассона, когда большинство липосомы продAin только один активный белок, так что вероятность наличия нескольких копий в данной пузырька невелика и макроскопическое время отток постоянной населения везикул хорошо аппроксимируется, что липосом, содержащих один белок. В самом деле, сравнение Cl - истечение времени, конечно опосредовано липосом восстанавливают CLC-EC1 при низкой (черный, 0,2 мкг / мг) и высокой P / L (серый, 5 мкг / мг) (фиг.3С) показывает, что в Последний случай оттока кинетика станет быстрее и F 0 уменьшается, что свидетельствует о том, что меньшая часть от общего объема липосом содержит 0 белки. Общее количество Cl -, содержащиеся в обоих образцах был сопоставим везикулы, ~ 0,7 и ~ 0,55 мкмоль соответственно, что указывает на полное внутреннее объемы пузырьков в двух образцах было одинаковым и чтобы количество белка восстанавливали не влияет на размер везикулы. Установка высокого P / L отток времени курс уравнения 7 дает значения τ (5 мкг / мг) = 8,8 сек и F 0 (5 мкг / мг) = 0,06, что указывает, что только ~ 6% от пузырьков не содержат активных CLC-EC1 димеры, в отличие от ~ 31 найденного% при P / L = 0,2 мкг / мг. Таким образом, оценка скорости унитарного оборота при высоких Т / л γ ~ 450 Cl - сек -1, почти в 6 раз ниже, чем полученное при низкой P / L и опубликованных данных 8,14. Таким образом, анализ оттока время курсов от липосом восстановленных при высоких Т / L'ы будут недооценивать унитарное ставки транспортного восстановленного белка. Таким образом, чтобы точно определить единую ставку транспортного романа белка это имеет ключевое значение для точного определения количества белка восстановленного и работать при низком P / L'ы, в разведении режима Пуассона. Это идеально достигается путем определения полного анализа белка титрования для определения оптимального режима работать.
Определение массы активного комплекса
палатки "> Анализ описано выше, предполагает, что стехиометрии активного комплекса, как известно, и восстановленный белок полностью активным. Тем не менее, для новых препаратов эти величины не могут быть известны заранее. В этом случае можно непосредственно определить эти параметры путем измерения F 0 'S при разных белка отношений липидов
где р плотность белка, 
, Ρ это число липосом в массе липида, N- число Авогадро, М П масса функционального комплекса канала и φ представляет собой долю активных белков. Установив, что определенный экспериментальным F 0-х годов в различных белковых соотношениях липидных это позляла определять р 0, и, следовательно, М П и φ.
Конечная доля липосом не поддается регистрации
Вывод унитарного скорости переноса предполагает, что при высоких Т / L'S Все липосомы содержат, по меньшей мере, один активный транспортный белок. Тем не менее, в некоторых случаях это было установлено, не так: при высокой P / единиц значительная часть липосом остается невосприимчивой к восстановления некоторых белков 11-13,17. В то время как происхождение этого явления не ясно, можно предположить, что более крупные белки могут быть исключены из везикул с меньшими радиусами, таким образом, уменьшая количество доступных липосом.
В этом случае уравнение 10 должен быть изменен, чтобы: 
где θ является доля липосом, рефрактерных к Протейп включение. Важно отметить, что ρ и φ также зависит от способа восстанавливающей, так как различные процедуры будут иметь различные извлечения для липидов и белков в липосомы при восстановлении и формировании. Предполагая, что выход 100% для обоих приведет к неправильной оценке γ. Поэтому, чтобы получить точную количественную оценку унитарной оборота / проводимости важно экспериментально определить фракцию липидов и белков, потерянной при восстановлении 8,11.
Ориентация восстановленных белков
Одним из предположений, сделанных в процессе анализа является то, что все воссозданные белки являются функционально эквивалентны. Тем не менее, многие каналы и транспортеры предпочли направления перевозок, явление, известное как ректификации. Это функциональная асимметрия может привести к ошибке оценки скорости оборота. Кроме того, ориентация восстановленных белков априори + градиенты, для каналов или перевозчиков, которые лиганд или напряжения в зависимости от.
Соображения по формированию плотных липосом
Одним из ключевых факторов, позволяющих использовать уплотнительныеF истечение анализа, описанного здесь является формирование плотных липосом. Три важных переменных, которые необходимо учитывать для достижения этой цели являются выбор моющего средства использовали для солюбилизации белков, стратегию моющего средства, удаление и выбор липидного состава липосом. В протоколе, представленной здесь, CLC-EC1 солюбилизируют в децил-Maltopyranoside (DM), детергента с высокой критической концентрацией мицелл (CMC) значение, которое, таким образом, легко удалены. Тем не менее, различные синтетические и природные моющие средства были использованы для очистки белков, которые были впоследствии восстановленных липосом в ограниченном без каких-либо воздействий на герметичности пузырьков. Эти моющие средства имеют широкий диапазон СМС, так высоко, как миллимолей (такие как СД или дигитониновых) и цене мкмоль (например, додецил Maltopyranoside (DDM) или dioctylpropane-бис-maltopyranoside (ДМНГ)). Важно отметить, однако, что липиды используются для формирования липосомы, солюбилизировали с использованием CHAPS, или другой мягкое моющее средство, И, следовательно, гибридные мицеллы в результате смеси белка и липидов могут иметь физико-химические свойства, отличные от свойств исходных моющих средств. Поэтому возможно, что в некоторых случаях остаточный удаления моющего средства, которые могли бы дестабилизировать липосом приводит к более выраженной утечек. Чтобы обойти эту проблему, желательно, чтобы исследовать альтернативные стратегии удаления моющего средства, такие как biobeads 12,13, спиновых фильтрационные колонки 15 или гель 18. И, наконец, липидный состав везикул является важным параметром, как конкретные смеси может быть различным вытекающей ионов в определенных условиях. Например, липосомы формируются из E. палочка полярный липидный экстракт плотно, чтобы Cl - при кислых значениях рН, но становятся все более вытекающей как рН увеличивается 19 или липосомы, образованные из 3: 1 смеси 1-пальмитоил-2-олеоил фосфатидил-этаноламин (Pope) и 1-пальмитоил 2-олеоил фосфатидилглицерин (POPG), Имеют намного меньшую проницаемость для Н +, чем те, которые образованы из Е. палочка полярный липид извлечь 20. Важно отметить, однако, что липидный состав везикул может также влиять на активность восстановленного белка 13,21,22. Таким образом, важно, чтобы точно определить свойства белка, свободной от пузырьков, полученных в каждом состоянии, а затем оценить, как это влияет на свойства восстановленного белка.
Обобщение, не являющихся каналами CLC-типа и перевозчиков
Отток анализа, как описано здесь, могут быть непосредственно использованы для определения свойств одиночных молекул любого Cl - канал или селективные транспортер, и, например, был использован, чтобы характеризовать свойства Са 2+, активированных Cl - канал 12 TMEM16A , Рассмотрим теперь, как адаптировать отток анализа для исследования свойств транспортеров или ChannELS, которые не являются Cl - селективный и / или имеют унитарные ставки на перевозки, которые значительно отличаются от ~ 10 3 иона сек -1 CLC-EC1.
Простейший случай является то, что белок исследования является анион-селективным. В этом случае необходимо только регулировка заменить Ag: электрод AgCl с коммерчески доступным в соответствующей избирательностью, как это было сделано для F - селективный Flucs и ЦОМС 16,23,24, или я - проницаемые каналы, такие как CFTR 15 , Если, с другой стороны, восстановленный белок является селективным для катионов, кроме ионофор валиномицина должен быть использован, чтобы инициировать отток. Учитывая дефицит утвержденного Cl - Ионофоры полезной заменой является H + ионофор, такие как карбонилцианид 4- (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP). В этом случае важно, чтобы гарантировать, что внутрипузырное рН поддерживают постоянным, например, путем увеличения буферчисле емкость внутренней раствора. Альтернативной стратегией является катион, чтобы следовать отток через канал или восстановленного переносчика с помощью протонов, как противоиона и мониторинга транспорта H + с использованием рН-метр 25 или радиометрический рН-чувствительных зонд 26. Тем не менее, косвенный характер этих измерений оказывает количественное определение транспортных свойств восстановленного белка трудно. Наконец, селективные электроды для ряда катионов существуют и являются коммерчески доступными. Третий вариант является то, что белок под исследования является проницаемой для обоих анионов и катионов, например, плохо селективного канала 13 или катион / Cl - котранспортера. В этом случае, восстановленные липосомы не выдерживают градиент KCl в процессе обмена раствора (шаги 5.4-5.5) таким образом, что они теряют содержание соли. Поэтому в этом случае все кинетической информация будет потеряна. Тем не менее, часть липосом, содержащих по меньшей мере, один активный протEin, F 0, все еще может быть определено путем добавления моющего средства и измерения остаточного ловушке Cl - контент (этап 6.8). Это позволяет для определения молекулярной массы белка путем проведения белок титрования и с использованием уравнения 10.
Еще один аспект, чтобы рассмотреть возможность того, что унитарное скорость переноса восстановленного белка порядков, отличающейся от CLC-EC1. Например, большинство перевозчиков есть текучесть кадров размером 1-10 сек -1, 2-3 порядков ниже, чем CLC-EC1, в то время как большинство каналов ионы поведения на 10 6 -10 7 сек -1, 3-4,000 раза быстрее, чем CLC -ec1. Для медленных перевозчиков размере Cl - утечки из безбелковых липосом может стать ограничивающим, так как его удельный вес в технологических отток увеличивается, как транспорт расход уменьшается белка-х годов. По нашему опыту скорость утечки несколько варьируется между препаратами и, как правило, в порядкенесколько ионов с -1. Таким образом, при работе с медленными транспортеры желательно подготовить небелкового липосом бок о бок с каждым восстановления, чтобы точно измерить утечку, соответствующую каждой партии пузырьков. Отток анализ успешно используется для определения унитарного скорость медленных перевозчиков с темпами оборота вокруг 1-10 ион сек -1, таких как цианобактерии CLC 27. Обратное положение имеет место, когда восстановленный белок имеет высокую проводимость, например ионных каналов. В этом случае кинетика оттока слишком быстро, чтобы быть решена как время смешения (~ 1-2 сек) и собственного времени отклика регистрирующего электрода стать ограничивающим скорость. В этом случае, кинетическая информация будет потеряна, но масса активного комплекса может быть определена по-прежнему 24. Стоит отметить, что другие подходы, такие как плоская липидного бислоя записей или патч зажима липосом больше подходят для изучения очищенных ионные каналы, как эти тэchniques непосредственно обеспечивают единого информационного молекулы с высоким временным разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
