Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

Рентгеновской визуализации флуоресценции позволяет как идентичности и количества элементов, присутствующих в образце, чтобы быть пространственным разрешением. Инцидент рентгеновские лучи, из энергии выбранной быть больше энергии связи электрона самого тяжелого элемента интересов, преодолеть энергию связи электронов внутренних оболочек к ядру 1. Это создает "дыру" в электронной оболочке. Как выше электроны падают в эти отверстия, флуоресцентные рентгеновские лучи испускаются, длина волны которого зависит от разности энергий этих орбиталей. С энергетический интервал орбиталей характерна для данного элемента, X-Ray флуоресценции также имеет характерные длины волн, в зависимости от элемента. Именно это излучение на характерной длине волны, что позволяет идентифицировать элементов, присутствующих. Калибровка интенсивности флуоресценции позволяет количественно оценивать элементов, присутствующих.

Рентгено-флуоресцентный microscopу (XFM) стала шире используются, отчасти в связи с развитием очень ярких рентгеновских источников синхротронного, таких, как в весенне-8 в Японии, Европы радиационной синхротронного фонда (ESRF) во Франции, и Advanced Photon Source ( APS) в США 2. Эти источники обеспечивают очень высокой интенсивности рентгеновских лучей. В то же время, улучшения в рентгеновской оптики, такие как зона пластины технологии, позволило фокусировки лучей в этих субмикронных пятен, хотя и довольно неэффективно 3. С очень пучков высокой интенсивности, даже относительно небольшое количество света, который может быть сфокусирован достаточно, чтобы возбудить эндогенные металлов в клетках, создавая сигнал, который может быть измерен с доступной в настоящее время технологии детектора. Таким образом, изучая химической биологии металлов в клетке одно приложение, в частности, позволяет использовать многие из недавних разработок в этой технике 4-10.

Есть много критических факторов, которые необходимо учитывать при приложениележа XFM исследовать распределение элементов и количественно культивируемых клеток млекопитающих или других биологических образцов. Во-первых, образец должен быть сохранены, как структурно, так и в отношении его химического состава, для того, чтобы измерения, чтобы иметь смысл. Во-вторых, образец также должны быть сохранены в некотором роде, так что он вынослив к повреждению излучения, которые могут быть вызваны с помощью сфокусированного пучка рентгеновских лучей. Один из способов, что образец может удовлетворить обоим этим критериям сразу будет быстро замораживают в стекловидное тело, аморфного льда 11,12. Быстрое замораживание часто достигается с помощью различных методов криоконсервации, таких как падение замораживания или высокого давления замораживания 13-16. Общепризнано, что криоконсервации сохраняет общую клеточную архитектуру и химические составы в биологических образцах как можно ближе к нативном состоянии, насколько это возможно. Химической фиксации, с другой стороны, из-за медленной и селективной проникновения фиксаторов в клетках и тканях, как шELL как последующие изменения в проницаемости мембран, может позволить различные клеточные ионы особенно к диффузии ионы, такие как Cl, Ca и K для выщелачивания, потерянных или перемещены, таким образом делая расследование этих элементов неоптимальных 17-19. Несмотря на явное преимущество в крио-фиксации в течение химической фиксации в целом, для прикрепленных клеток млекопитающих, в частности, криоконсервация имеет различные ограничения 20-23. Наиболее очевидным является то, что не каждый исследовательская лаборатория имеет легкий доступ к криоконсервации инструментов. Большинство современных морозильники высокого давления или даже погрузить морозильники являются дорогостоящими и принадлежит только подмножество крио объектов, которые могут быть далеко, где клетки инкубируют. Преимущество криоконсервации может быть обменены на недостаток хода стресса, размещенной на клетках. Таким образом, в то время как криоконсервация, безусловно, самый строгий способ сохранить образцы для анализа рентгеновской флуоресценции, это, конечно, не самый доступный для всех исследователей при всех обстоятельствах;и это не всегда необходимо - если металлы, представляющие интерес, тесно связан с фиксируемым макромолекул, и разрешение, с которым образец будет изображена больше, чем ущерб, к ультра-микроструктуры, которые могут возникнуть в процессе сушки. Памятуя о оговорками 24, химической фиксации и сушки может быть подходящим выбором.

Другие факторы в успешном рентгеновского эксперимента флуоресцентной томографии включают надлежащий анализ. Флуоресценции формирования изображений рентгеновским излучением в корне рентгеновской спектроскопии флуоресценции в сочетании с растровым сканированием, чтобы обеспечить пространственное разрешение. Спектры флуоресценции рентгеновских собранные содержат комбинацию совпадающих вершин выбросов, фон, и упругие и неупругие пики рассеяния падающего луча. Программное обеспечение, которое позволяет де-свертку этих взносов, а также установку пиков выбросов, был критический развитие в этой области 25. Кроме того, развитие и коммерческое расстояниеribution тонкопленочных стандартам известного состава, используемого для калибровки интенсивности флуоресценции по отношению к материальной количестве, также очень важно.

Этот протокол содержит описание приготовления адгезивных клеток с помощью химической фиксации и сушки на воздухе. Важным шагом в этом процессе является рост клеток на нитрида кремния окон, которые часто не придерживаются хорошо, что делает нежный промывания в определенном ключе моды к успеху.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка инструментов, подложек, культура, СМИ и блюда

  1. Обработка нитрида кремния (Si 3 N 4) окон.
    1. Открыть капсулу слегка сжимая один конец, содержащий окно таким образом, чтобы не сжать саму окно, при вращении другой конец капсулы с другой стороны.
    2. Проверить пару наоборот, остроконечный пинцет под стереоскопическим чтобы убедиться, что нет клейкие, пробелы изгибы или на кончике. В противном случае, окна могут быть разбиты пинцетом или улететь из них в течение последующих шагов.
    3. Удалить окно из капсулы, тщательно захвата кадра окна с помощью пинцета, а слегка сжимая капсулу вблизи открытого конца приложения давления в направлении, таким образом, чтобы капсула шире, где края окна должны выходить.
  2. Окно предварительная мойка (опция).
    1. При желании, предварительная стирка окна, осторожно опуская ихв дистиллированной воде в течение 5 сек, а затем 2 мин стирки в 70% -ном этаноле и 2 мин стирки в 100% -ном этаноле.
  3. Нанесение и стерилизации окна на блюдо культуры.
    1. Для прикрепления окна, установить окно с плоской стороной вверх в нижней части чашки для культивирования, поместить часть ленты на чистом стекле. Отрежьте около четверти дюйма полосу вниз по длинной стороне ленты. Возьмите кусочек ленты с короткой стороны (в ⅛ "в ¾") с чистой бритвой.
    2. С помощью пинцета применить кусочек ленты к краю сетки или окна. Используйте достаточно, чтобы надежно прикрепите ее без покрытия самого оконного проема. Манипулирование приклеенный ленту с помощью пинцета, установить окно вниз на дно чашки для культивирования. Используйте кончик пинцетом придерживаться ленты на дно культуры блюдо твердо.
    3. Применение другой ленты полосы к другой кромке и придерживаться этого на дно плотно кончиком пинцета.
    4. После того, как все окнавыявляется, стерилизовать окна в чашках для культивирования с ультрафиолетовым (УФ) излучения. Достижения этой цели, поместив тарелку под УФ-лампой в ламинарном боксе в течение приблизительно 1 ч.
    5. (Необязательно) Если окна должны быть предварительно покрыты поли-лизина, не так следующем окне стерилизации. Пальто окно с 10 мкл стерильной 0,01% поли-L-лизина раствор в течение 1 ч в 37 ° C инкубаторе, а затем промыть оставшийся раствор прочь с культуральной среде.
  4. Подготовка буфера для окончательной промывки перед XFM.
    1. Подготовьте либо Трис-глюкозу или пиперазин-N, N '-бис (этансульфоновая кислота) (трубы) -сахарозу буфер без каких-либо следов металлов с осмотическим давлением и рН, эквивалентном фосфатного буфера солевым раствором Дульбекко (D-PBS) без кальция и магния. Используйте один из этих буферов для полоскания клетки после клетки химически фиксированной.
      1. Чтобы сделать раствор трис-глюкозы (10 мМ Трис, 260 мМ глюкозы, 9 мМ уксусной кислоты,) добавляют 1,4 г глюкозы, 36 мг трис-основани и16 мкл уксусной кислоты в 20 мл сверхчистой воды. Затем отрегулировать конечный объем до 30 мл ультрачистой воды. Нет регулировки рН не требуется. Хранить при комнатной температуре до одной недели.
      2. Для того, чтобы трубы-сахарозы (20 мМ трубы, 200 мМ сахароза) добавляют 0,18 г трубы и 2,0 г сахарозы в 20 мл сверхчистой воды и доведения рН до 7,4 с небольшими количествами концентрированной уксусной кислоты. Затем отрегулировать конечный объем до 30 мл ультрачистой воды. Хранить при комнатной температуре до одной недели.
        Примечание: Причина, чтобы избежать с помощью PBS в окончательной промывки в том, что концентрации фосфата, хлорида и кали в PBS настолько высоки, что он может мешать XFM, если она не полностью удалена перед сушкой на воздухе.
  5. Подготовка буфера для клеток покрытия.
    1. Подготовка или вынуть все носители, такие как RPMI среде 1640, 1x раствор трипсина-ЭДТА, D-PBS, и любые другие реагенты, как, необходимые для конкретного клейкого клеточной линии, который обычно делается для пассирования прикрепленные клетки уплотнительныеF интерес, и согреть их до 37 ° C.

2. Покрытие из клеток

  1. К стерилизованной культуральной чашке, содержащей окна в ламинарном боксе, осторожно добавить носитель (10 мл на 100 мм чашку для культивирования), вдоль стороны чашки для культивирования с ней наклонена под углом. Избегайте излишнего поверхностного натяжения или удаление медиа непосредственно на поверхности нитрида кремния окон. Как средства массовой информации добавляют медленно снять угол наклона, чтобы покрыть сетку и окно со средствами массовой информации.
  2. Подготовка приверженцем клеточной линии интересов надлежащим образом, trypsinizing или выскабливание клетки прочь пластин, как обычно, для пассирования линии клеток. Выполнение любой подсчета клеток или другой препарат необходимо перед применением клеток в свежей пластинки.
  3. Добавить клеток в культуральной чашке с окнами при плотности клеток, которая необходима, чтобы достичь, как правило, 50% -70% слияния в течение 24-72 ч, и инкубируют при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% углекислого газа. Заметим, рост клеток от времени, используя инвертированный светового микроскопа, до желаемой плотности клеток (как правило, 50% -70% слияния) не будет достигнута.

3. Фиксация клеток

  1. Подготовьте свежий 4% параформальдегида в D-PBS разбавлением выбирают шток (например, 25% параформальдегидом) и доведением рН до 7,4 с помощью уксусной кислоты (чтобы избежать добавлением избытка натрия в образце).
  2. Когда клетки были выращены по желанию, и любые жизненные пятна (например, Hoescht) были применены и отображаемого, извлекайте носитель при слабом стремлении, наклоняя тарелку под углом 45 ° с одной стороны, и аспирационных вручную пипетки с другом ,
    Примечание: Вместо пипеток провел СМИ, альтернатива, чтобы выбрать окно вверх, опустить окно в микропробирок с D-PBS в два раза, а затем поместить его в новый сосуд для культивирования с фиксирующие решений в течение 20 мин, затем 2 раза в PBS стирки для удаления остаточных фиксаторов. Если это выбрано, перейдите режectly к шагу 3.5.
  3. Промойте блюдо аккуратно D-PBS и немедленно заменить снятую жидкость, осторожно добавляя свежие 4% PFA / PBS, удерживая блюдо под углом 45 °, пипеткой в ​​сторону тарелки, и медленно расслабляя угол наклона, чтобы позволить Фиксирующий раствор для покрытия окна. Сохранить клетки, покрытые с фиксатором в течение 20 мин при комнатной температуре.
  4. Удалить жидкость путем осторожного стремления, снова, как и выше, слегка наклонив блюдо и аспирации от руки.
  5. Замените удаленную жидкость, осторожно добавляя некоторые из труб / раствор сахарозы, используя поворотную и пипетки метод, описанный в шаге 3.3.
  6. Повторите шаги 3,4 и 3,5.
  7. Подготовка материалов для сушки.
    1. Соберите безворсовые полотенца, такие как Kimwipes, и потяните один из коробки, так что удобно очень быстро и легко.
    2. Подготовьте чистую, без ровном месте, чтобы установить окно, чтобы высохнуть. Изложены резиновый сетки мата типа, используемого в электронной микроскопии, которая имеет выступы такОкно может быть опираясь на одном конце, а она высыхает. Это позволит сохранить окна от застревания на поверхности сушки, как он высохнет, и слейте оставшуюся буфер к краю образца.
  8. Осторожно выщипывать ленту, прикрепленную к окну, чтобы держать окно до из жидкости. Получить окна, которые приходят от ленты с применением небольшого количества труб / сахарозы, чтобы заставить их плавать, а затем поднимать их с обратной пинцетом.
  9. Осторожно (не касаясь самого окна) и тщательно мазать излишки трубы / сахарозы от края окна с Kimwipe. Мазня Также заднюю отступом область, используя округлую сгиба Kimwipe.
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы иметь как можно меньше кристаллизацию солей или буферов на поверхности окна, как это возможно.
  10. Поместите окно на сетке мата. Убедитесь, что окно не лежал на сетке мата, но опершись на краю (используя хребты сетки мата) и касаясь лишь сеткимат, насколько это возможно. Пусть окна в сухом месте.

4. Пример монтажа и обработки изображений

  1. После того, как образец сушат, проверить наличие клеток на окнах с помощью светового микроскопа. Выполните эту проверку, прежде чем готовить образцы для транспортировки в синхротроне.
  2. Пакет окна для перевозки синхротронного пучке размещен ваш эксперимент. Осторожно прикрепить окна с лентой с двух сторон к стеклу, а затем прикрепить на стекло с лентой в нижней части пластиковой чашке Петри. Лента блюдо замке Петри.
    Примечание: Перед этой точки, эти шаги могут быть выполнены в любом типичном лаборатории. Следующие шаги лучше всего было бы сделать в синхротронного пучке.
  3. Удалите ленту из окна осторожно пинцетом. Использование лака для ногтей, в тонком покрытии даже вдоль края окна, чтобы обеспечить окна на алюминиевый держатель, представленной сотрудниками в пучке синхротрона.
  4. Вставьте держатель алюминия вкинематическая гору, а затем поместить его в положение в рентгеновском микроскопе. Установите образец на кронштейне, соединяющий его с моторизованными стадиях, внутри образца камеры на пучке.
  5. После выхода рентгеновского область микроскоп инструмента образец (клетка из свинца заполнены стены), настройки сканирования. Использование пучке специального программного обеспечения, выберите соответствующую область образца для сканирования, во время просмотра положение пучка рентгеновского излучения на образце с помощью камеры с видео перекрестия и предварительно согласованы с последующей сцинтиллятора камеры.
  6. Выбор подходящего разрешения для образца, на основании оценки размера наименьшего элемента, представляющего интерес. Для визуализации отдельных клеток млекопитающих (~ 20-40 мкм), использовать разрешение 0,25-0,5 мкм. Для визуализации области тканей и выделения слоев клеток друг от друга, используйте разрешение 2-20 мкм.
  7. Выберите подходящее время выдержки для образца, основанный на оценке количества встретилсяаль объекты настоящее время. Для обзора быстрого сканирования, или если большие количества металлов присутствуют, используйте лету сканирует с времени ожидания 30-300 мс на пиксель. Если мало материала присутствует, или для измерения металлов с низкой относительной численности, используйте шаг сканирования с остановкой времени 1-2 сек на пиксель.
  8. Программирование сканы в программное обеспечение пучке от конкретных условий. Приобретать растрового изображения. Работайте вместе с пучке сотрудников для анализа данных с помощью программного обеспечения, которое будет идентифицировать характерные энергии пиков для каждого элемента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Способность формирования изображений рентгеновским излучением флуоресценции для предоставления информации о биологических образцов зависит от этих образцов готовят таким образом, чтобы они были устойчивы к повреждению излучения на временной шкале эксперимента, и в то же их химические и структурные особенности хорошо сохраняется. В просмотре результата образца, который был подготовлен, как описано выше, и в образ, можно видеть, что существуют различия в элементах настоящее время - о том, что фиксация сохранились эти аспекты ячейки (рис 1).

Наоборот, глядя вместо на образец, где этот процесс не идут хорошо, и буфер сохраняет свое присутствие во время сушки, обширная образование кристаллов из молекул, находящихся создает структурного повреждения клеток, а также препятствует сбору спектров рентгеновской флуоресценции ( Рисунок 2).

Эти изображения генерируются на пиксель арматуры от рентгеновского спектра флуоресценции в каждой точке изображения. Это означает, что каждый спектр, собранные в каждом пикселе, был индивидуально анализировали. При просмотре панели в этих изображениях, полученных от встроенными данных, значение, присвоенное каждой точки изображения интегрированы сумма гауссианом для характеристической излучения данного элемента (например, железо), как наиболее подходит рентгенофлуоресцентного Спектр собирали в этой точке. Например, один пиксел в изображении имеет значение (число) для железа, которое складывается из площади под кривой Гаусса в характерной энергии излучения для железа, который подходит и модели данных для спектра излучения этой точки на образец. Данные отображаются с пороговыми значениями над каждым изображением (максимальный и минимальный), которые назначают на высокой и низкой концы цветовой таблицы (в нижней части каждого изображения) для конкретных значений в пределах изображения.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 1. X-Ray флуоресценции изображение человеческого SH-SY5Y Cell. Каждая панель в этом образе отображается различная информация о тех же клеток. Первая панель, обозначены ДВС, является оптический дифференциальный интерференционный контраст микрофотография клеток. Следующие панели, слева направо, являются фосфор (Р), серы (S), железо (Fe), цинк (Zn) изображения тех же клеток, с указанием их распределение по площади ячейки. Масштабная линейка показан 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Фиг.2
Рисунок 2. рентгеновской флуоресценции изображение крысы B103 Cell, приготовленный с плохого или недостаточного удаления из буферов. Два клетки видны в фосфора (P) панели,и немного виден в железе (Fe) и цинка (Zn) панелей. Тем не менее, присутствие кристаллизованной буфера, видно, как мазок из частиц через центр изображения, скрывает большую часть информации. Масштабная линейка показан 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Флуоресценции изображений X-Ray полезно во многих областях, в том числе наук о Земле, науки о материалах и химической биологии 26-34. Достижения в синхротронного рентгеновского излучения, и их фокусировки, дают весьма высокоинтенсивные пучки. Сфокусированный рентгеновских пучков достаточно, чтобы возбудить эндогенные металлов в клетках существуют в настоящее время, производить сигнал, который может быть измерен с доступной в настоящее время технологии кремниевых детектора дрейфа. И изучение химической биологии металлов в клетке одно приложение, в частности, позволяет использовать многие из недавних разработок в этой области.

Тем не менее, изучение биологических материалов с использованием рентгеновской флуоресцентной микроскопии также создает особые проблемы, по сравнению с другими материалами, так как они увлажненной. Для предотвращения повреждения излучения, в идеале образцы будут заморожены в стекловидный лёд во время измерения. Тем не менее, химической фиксации и сушки на воздухе гораздо более доступным для новичков, и может быть целесообразно, если металловПредставляют интерес вяло связан с фиксируемым макромолекул, и разрешение, с которым образец будет изображена больше, чем ущерб, к ультра-микроструктуры, которые могут возникнуть в процессе сушки.

При рассмотрении субстраты для приверженцем клеток исследований XFM, идеальным субстратом должен соответствовать следующим основным требованиям: 1) поддержка устойчивого роста клеток без переменного нормальной пролиферации и фенотипическую рост клеток, 2) не должен иметь рентгеновской флюоресценции, которая перекрывает с теми элементами интерес, 3) оптически прозрачным для оценки роста клеток под световым микроскопом до XFM, и 4) быть в состоянии выдержать любые физические и химические манипуляции в процессе культивирования и последующей фиксации. Исторически сложилось так, различные субстраты, начиная от тонких поликарбоната фольга / фильмов 35-37, formvar покрытием золото просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) сетки 38-42 и нитрида кремния окна 5,17,43-46, были использованы расти клетки млекопитающего,с и используется для флуоресценции визуализации рентгеновского излучения. По сравнению среди существующих и потенциальных субстратов для работы с изображениями прилипшие клетки млекопитающих XFM, нитрида кремния мембраны (Si 3 N 4) окна являются наиболее подходящими из-за их низкой фоновой флуоресценции и относительно простой элементного состава 4-6,47,48. Кроме того Si 3 N 4 окна поддерживают подключение надежную и пролиферацию клеток. По сравнению с другими широко используемыми субстратов, таких как ТЕА сетей, Si 3 N 4 окна также имеют гораздо больший бесперебойного область формирования изображения, которое Особое преимущество, когда эти окна используются для рентгеновской томографии.

Si 3 N 4 окна являются коммерчески доступными от ограниченного числа поставщиков. Работа с нитрида кремния окон приобретенный навык. Окна являются очень хрупкими и требуют большой осторожности, чтобы не создавать каких-либо скручивающие усилия при работе им, что, возможно, разрушить их или отказаться от них. Handlих начало на краях с использованием обратной пинцет является популярным подходом. Большинство окон имеют толщину в диапазоне от 30 нм до 500 нм и шириной от 1 х 1 мм до 5 х 5 мм. В общем, тем толще мембраны, более надежными они ко всем видам обработки стресса. Тем не менее, с увеличением толщины и оптической прозрачности менее, они будут увеличивать фоновый излучение от образца. 200 нм мембраны довольно идеально. Они имеют минимальное влияние на измерение, но достаточно крепким, чтобы быть обработаны без особых повреждений.

Хотя многие типы клеток испытания могут изначально приложить и энергично растут на стерильных Si 3 N 4 окна, клетки, выращенные на нитрида кремния окон в целом гораздо легче перемешивается, чем клетки на традиционных культур клеток пластин. Они становятся легко снимается, собраны или округляется до даже во время обычной смены носителя. Мы нашли предварительно промытые окна часто становился более гидрофильными; клетки приложить все лучше и было меньше чанCE агрегировать вместе. Описанные в протоколе выше очертить нежно-стиральная подход к поддержанию клетки на окне. Некоторые другие шаги, которые могут быть приняты включать нанесение на окна с поли-лизин, или ламинином, как можно было бы пальто покровное.

Другой аспект этого метода, который может быть успех или неуспех данного эксперимента является перемешивание образцов. Наблюдая рост клеток на пластиковых сосудов для культивирования, нормальный диапазон агитации в результате пипетки и пластиной перевозки, кажется, не причинить много вреда. Тем не менее, для клеток, выращенных на нитрида кремния окон, дополнительная забота во время смены носителя и пластины транспортировки не требуется. Для некоторых легко волновавших клеток, таких как фибробласты мыши NIH / 3T3, культуральные пластины, содержащие окна должны быть обработаны тщательно. Они должны быть тщательно вынимают из инкубатора и осторожно установить на столике микроскопа или в шкафу поверхности. Не обязательно каждый маленький рhysical шок будет мешать клетки, но риск открепления клеток увеличивается без дополнительной помощи. Кроме того, различные партии сыворотки плода коровы и нитрида кремния окон может иметь определенные последствия для прикрепления клеток на окне. Некоторые источники сыворотки или партии окнами показаться, что легче работать, т.е. не видя слишком много беспокойства подобным помощи. Так, некоторые проб и ошибок для клеточной линии интересов может быть рекомендовано.

С достижениями в области криогенных этапов для рентгеновских флуоресцентных микрозондов, а также новых исследований в подготовке замороженных гидратированных биологических образцов, вполне вероятно, что подготовка проб в будущем будет гораздо больше, все чаще включают заморожены гидратированных образцов. Многие из тех же проблем в работе с нитрида кремния окон и удержания клеточную адгезию имеются и другие. Тем не менее, освоение этой техники остается очень хорошее место, чтобы начать в развитии навыков, прежде чем криоконсервация,й много раз, это отлично подходит способ изображения образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Химия выпуск 97 X-Ray флуоресценция изображений металлы химическая биология микроскопия синхротронное
Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter