Introduction
X射线荧光成像可以用于两者的身份和样品中存在的元素的量，以在空间上分辨。选择为大于电子结合感兴趣的重元素的能量的能量的入射X射线，克服内壳层电子的结合能的核1。这会在电子层一个“洞”。作为高能量电子落入到这些孔中，荧光X射线被发射的，其波长依赖于那些轨道的能量的分离。由于轨道的能量间距是一个给定的元件的特性，在X射线荧光发射也具有特征波长，取决于在元件上。正是这种发射在特征波长，允许存在的元素的识别。的荧光强度的校准允许存在的元素的定量分析。
X射线荧光microscopY（XFM）已经越来越使用，部分原因是非常辉煌的X射线同步辐射光源，例如那些在春天-8在日本，欧洲同步加速器辐射设备（ESRF）在法国，以及先进光子源（发展APS），在美国的2。这些源提供非常高强度X射线束。同时，改善在透视光学，如带片的技术，允许这些光束到亚微米的斑点的聚焦，虽然相当低效3。具有非常高强度的光束，即使是相对小的光量，可以集中足以激发内源的金属中的细胞，产生的信号，可以与目前可用的检测器技术来测量。因此，研究金属的化学生物学中，细胞是在特定的一个应用程序，利用许多的最近发展的在该技术4-10。
存在要考虑的，而应用程序的许多关键因素卧XFM调查培养的哺乳动物细胞或其它生物样品的元素分布和定量。首先，将样品需要保持完好，在结构上并且相对于它的元素组成中，为了进行测定才有意义。其次，样品也必须以某种方式保存，使得它是耐寒到能够通过聚焦X射线束而引起的辐射损伤。该样品可以一次同时满足这些标准的一种方法是将快速冷冻成玻璃状，无定形冰11,12。快速冷冻往往是通过诸如暴跌冻结或高压冻结13-16各种冷冻保存技术来实现的。人们普遍认为冻存保留整体蜂窝结构，化学成分的生物样品尽可能接近天然状态为可能的。化学固定，另一方面，由于缓慢和选择性渗透固定剂进入细胞和组织如瓦特ELL在膜渗透性作为以后的变化，可以允许各种细胞的离子特别是可扩散的离子如Cl，Ca和K至浸出，丢失或重定位，从而使这些元件不理想的17-19的调查。尽管低温定影超过化学固定在一般情况下，对于贴壁哺乳动物细胞，尤其是明显的优势，冷冻保存有各种限制20-23。其中最明显的是，并不是每一个研究实验室可方便前往冷冻保存仪器。大多数当前的高压冷冻甚至沉浸冷冻费用昂贵，拥有仅由冷冻设施的子集，其可以远离其中细胞温育。冷冻保存的好处可能被交易的出行压力置于细胞的缺点。因此，尽管冻存肯定是最严格的方式来保存样品X射线荧光分析，它肯定不是最方便的在各种情况下所有的研究人员;也不总是必要 - 如果感兴趣的金属是紧密地结合到可定影大分子，并且在该样品将被成像的分辨率大于在干燥过程中可能出现的超显微组织的损害。注意到的告诫24的，化学固定和干燥可以是合适的选择。
其他因素在成功的X射线荧光成像实验，包括适当的分析。 X射线荧光成像是从根本上的X射线荧光发射光谱结合光栅扫描，以提供空间分辨率。收集到的X射线荧光发射光谱重叠的包含发射峰，背景和入射光束的弹性和非弹性散射峰的组合。软件，使反卷积的这些贡献和排放峰值的拟合，得到了关键的发展，这一领域的25。此外，开发和商业DIST已知成分，用于校准相对于物质量荧光强度薄膜标准ribution，也一直很重要。
这个协议提供了通过化学固定和空气干燥制备贴壁细胞的描述。在这个过程中的重要一步是细胞上的氮化硅窗口，往往不坚持好，使温柔漂洗以特殊的方式成功的关键的增长。
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Protocol
1.制备仪器，基板，文化传媒和菜
- 处理氮化硅（Si 3 N 4）的窗口。
- 略通过挤压一端包含窗口以这样的方式，以不挤窗口本身打开胶囊，一边旋转用另一只手的胶囊的另一端。
- 检查一对反向的，体视显微镜下的细尖的镊子，以确保有在尖端无粘性，缺口或弯曲。否则，该窗口可以由镊子破裂或断开他们的飞在随后的步骤。
- 通过仔细地抓用镊子窗口的帧删除从胶囊的窗口中，同时轻轻挤压胶囊靠近开口端施加压力的方向，以使上述胶囊更宽其中窗口的边缘需要出来。
- 窗口预洗（可选）。
- 如果需要，预洗窗轻轻蘸他们入蒸馏水，持续5秒，然后2分钟洗涤在70％乙醇和2分钟的洗涤在100％乙醇。
- 粘贴并在培养皿灭菌窗户。
- 贴上窗，设置平面朝上在培养皿底部的窗口中，将一块胶布上干净的载玻片上。削减约四分之一英寸的带断下带的长边。取的胶带片断的短边（在⅛“由¾”）配有一个干净的刀片。
- 使用镊子的胶带片应用到电网或窗口的边缘。使用足够安全地坚持它不涉及窗口开放本身。操纵粘附胶带用镊子，向下设置窗口到培养皿的底部。使用镊子的顶端附着胶带到培养皿牢固的底部。
- 适用的另一种带条的另一边缘和粘附这对底牢固地用镊子的尖端。
- 一旦所有的窗户都录音，消毒在培养皿窗用紫外线（UV）辐射。通过将盘在紫外灯下在层流罩约1小时完成此。
- （可选）如果窗口是被预先涂有聚赖氨酸，这样做如下窗口灭菌。与培养基外套与10微升的无菌0.01％聚-L-赖氨酸1小时在37℃培养箱溶液，然后在窗口冲洗剩余溶液关闭。
- 准备缓冲区XFM前的最后洗净。
- 制备任一个的Tris-葡萄糖或哌嗪-N，N'-双（乙磺酸）（PIPES）缓冲液-sucrose不含任何痕量金属与渗透压和pH相当于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），无钙和镁。使用这些缓冲区之一冲洗细胞细胞化学固定后。
- 使的Tris-葡萄糖溶液（10mM的Tris，260 mM的葡萄糖，9毫乙酸）添加1.4克葡萄糖，36毫克的Tris碱和16微升乙酸到20ml的超纯水。然后，调节最终体积至30ml，用超纯水。不需要进行pH调节。存储在室温至一个星期。
- 为了使PIPES-蔗糖（20毫摩尔PIPES，200mM的蔗糖）添加0.18克PIPES和2.0g蔗糖到20ml的超纯水和将pH调节至7.4与少量浓乙酸。然后，调节最终体积至30ml，用超纯水。存储在室温至一个星期。
注：原因，以避免在最后的漂洗用PBS是磷酸盐，氯离子和钾在PBS中的浓度是如此之高，它可以与XFM干扰，如果它没有完全空气干燥前除去。
- 制备任一个的Tris-葡萄糖或哌嗪-N，N'-双（乙磺酸）（PIPES）缓冲液-sucrose不含任何痕量金属与渗透压和pH相当于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），无钙和镁。使用这些缓冲区之一冲洗细胞细胞化学固定后。
- 准备缓冲区细胞接种。
- 制备或采取了所有媒体，如RPMI培养基1640，1×胰蛋白酶-EDTA溶液，D-PBS，并根据需要对特定粘附细胞系作为通常用于传代的粘附细胞ø作出的任何其他试剂˚F兴趣，温暖他们到37℃。
2.电镀细胞
- 含有该窗口，在层流罩中无菌培养皿中，轻轻地添加介质（10毫升100毫米培养皿），沿着所述培养皿用它倾斜成一角度的侧面。避免产生不必要的表面张力，或直接拖放到媒体的氮化硅窗户表面。媒体被添加，慢慢解除的倾斜角以涂覆网格和窗口介质。
- 准备感兴趣的贴壁细胞系适当，胰蛋白酶和刮细胞脱落板像往常一样的传代细胞系。应用细胞的新鲜板之前执行的任何细胞计数，或其他必要的准备。
- 加入细胞培养皿与窗户是需要的通常在24-72小时达到50％-70％汇合的细胞密度，并在湿润的培养箱中5％二氧化碳孵育在37℃。 观察细胞的生长偶尔，使用倒置显微镜，直至所需的细胞密度（通常为50％-70％汇合）为止。
3.固定细胞
- 通过稀释所购买的股票（如25％多聚甲醛）并调节pH至7.4，用乙酸（以避免加入过量的钠的样品）制备在D-PBS新鲜的4％多聚甲醛。
- 当细胞已生长如需要的话，和任何重要污渍（如赫司特）已经被施加并成像，通过温和抽吸取出介质，倾斜盘以45°的角度，用一只手，并用手移液管与其它吸。
注意：不要用移液介质的，另一种是选择窗口起来，蘸窗口，进入离心管与D-PBS两次，然后将其放置到一个新的培养容器与固定液解决方案，20分钟后洗净PBS的2倍以去除残留固定剂。如果选择了此项，去DIRectly步骤3.5。 - 轻轻冲洗菜D-PBS，并轻轻加入新鲜的4％PFA / PBS同时举行的菜在45°角，移液对菜的一侧，然后缓慢放松的倾斜角度，使立即更换去除液体固定剂溶液以覆盖窗口。保持覆盖有固定剂为20分钟，在室温将细胞。
- 轻轻吸去除液体，再上面，倾斜的菜稍微用手吸。
- 轻轻加入一些管道/蔗糖溶液中，使用步骤3.3中所述的倾斜和移液的方法重新装上卸下液体。
- 重复步骤3.4和3.5。
- 准备材料干燥。
- 收集无绒布毛巾等的Kimwipes和拉一开箱所以它是非常方便快捷和容易。
- 准备一个干净，无级的地方设置窗口晾干。设置在电子显微镜中使用的那种，有脊等的橡胶垫格该窗口可以在一端支撑，而它干燥。这将保持窗口从卡住至干燥表面，因为它干燥时，和漏任何剩余缓冲器到样品的边缘。
- 仔细tweeze附连到窗口保持窗口向上出来的液体的胶带。检索窗户脱落带的通过施加少量PIPES /蔗糖，让他们浮起并然后拾取它们与反向镊子。
- 小心（不接触窗口本身），并彻底地涂抹从用Kimwipe窗口的边缘的任何多余的PIPES /蔗糖。也涂抹用的Kimwipe的圆形折回来缩进区域。
注意：我们的目标是有盐或缓冲剂，作为小结晶窗口尽可能的表面上。 - 把窗口拖到网格垫。确保该窗口未在网格垫平放，但撑起上的边缘（使用网格垫的脊）和触摸尽可能少的网格的垫越好。让窗口干燥。
4.样品安装和成像
- 一旦样品已干燥，验证细胞对使用光学显微镜的窗口的存在。执行此验证，准备样品运输到同步之前。
- 打包窗口运输同步加速器光束线的托管实验。轻轻贴上窗户用胶带上双方向载玻片，然后贴上带有胶带的载玻片于塑料培养皿的底部。用胶带将培养皿关。
注：在该点之前，这些步骤可以以任何典型的实验室中进行。下面的步骤将最擅长的同步加速器光束线来完成。 - 从轻轻用镊子窗口中删除的磁带。用指甲油，在沿窗口的边缘的薄均匀涂层，以固定的窗口由束线合作者在同步加速器提供的铝支架。
- 将铝架成的运动装入，然后将其放入在X射线显微镜的位置。安装在其上的束线连接到机动阶段，样品腔室内部的支架上的样品。
- 退出后，将样品透视镜仪器区（铅做的填充墙一厨），设置扫描。使用束线专用软件，选择的样品进行扫描的适当区域，同时用配有视频十字形和照相机观察在样品上的X射线束的位置的预对准的下游闪烁照相机。
- 选择适当的分辨率的样品的基础上，所关心的最小特征的尺寸的估计。对于单一的成像哺乳动物细胞（〜20-40微米大小），用0.25-0.5微米的分辨率。用于成像的组织的区域，且彼此可区别的细胞层，用2-20微米的分辨率。
- 选择适当的停留时间为样品，基于所述满足量的估计值人的利益存在。对于一个快速浏览扫描，或者高量金属的存在，使用飞扫描与每像素30-300毫秒的停留时间。如果小料存在，或测量低相对丰度的金属，使用分步扫描与每像素1-2秒的停留时间。
- 程序扫描成束线专用软件。获得光栅扫描图像。与光束线合作者一起工作，分析软件中的数据，将确定的特征能量峰的每一个元素。
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Representative Results
X射线荧光成像提供关于生物样品的信息的能力，是在被制成以这样的方式即它们是健壮的时间尺度实验辐射损伤这些样品队伍，但它们的化学和结构特征是公保存。在观看已制备如上所述并成像的样品的结果，有可能看到有变化存在的元素-表示定影保留在细胞的这些方面（ 图1）。
相反地，在寻找代替在一个样品，其中该处理不顺利，而缓冲保持干燥期间目前，广泛晶体形成从本分子产生对细胞结构的破坏，也与X射线荧光光谱的收集干扰（ 图2）。
每像素接头产生这些图像在图像中的每个点的X射线荧光光谱。这意味着每个光谱中，在每个像素收集已个别分析。当观看在从拟合数据生成这些图像的面板，在图像中分配给每个点的值是高斯的集成总和为给定的元件的特性的发射（ 例如，铁），为最适合的荧光X射线光谱收集在该点。例如，图像中的单个像素的值（数字）为铁，这是该区域的高斯曲线，在铁的特征发射能量下的总和，即配合和模型为该点的发射光谱的数据在样品上。该数据显示与每个图像在阈值以上的值（最大值和最小值），该分配高和色表的低端（在每个图像的底部）的图像内的特定的值。
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图一人SH-SY5Y细胞1 X射线荧光图像，在此图像中的每个面板显示相同的细胞不同的信息。第一面板，标记为DIC，是细胞的光学微分干涉对比显微镜照片。下面的面板，从左到右，是磷（P），硫（S），铁（Fe），和相同的细胞的锌（Zn）的图像，显示出它们的分布在单元的面积。所示的比例尺为20微米。 请点击此处查看图的放大版本。
图2. X射线荧光大鼠B103细胞的图像，差的或不充分去除缓冲器的制备。两种细胞都是在磷（P）面板可见，并且是在铁（Fe），锌（Zn）的板略微可见。然而，结晶缓冲液的存在下，通过所述图像的中心微粒的涂片可见，掩盖的大部分信息。所示的比例尺为20微米。 请点击此处查看图的放大版本。
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Discussion
在许多领域，包括地球科学，材料科学，化学生物学26-34 X射线荧光成像是非常有用的。进展同步辐射X射线，和它们的聚焦，产生了非常高的强度的光束。聚焦X射线束足以激发内源的金属中的细胞现在存在，产生可与目前可用的硅漂移检测器技术进行测量的信号。和学习金属的化学生物学中，细胞是在特定的一个应用程序，利用许多近期的发展在这方面的。
然而，使用X射线荧光显微镜生物材料的研究也提出了特殊的挑战，相对于其它的材料，因为它们被水合。为了防止辐射损伤，理想的样品将在测量期间冻结在冰玻璃。然而，化学固定和空气干燥得多访问的新手，也可以适当如果金属感兴趣的是惰性绑定到可定影大分子，并且在该样品将被成像的分辨率大于在干燥过程中可能出现的超显微组织的损害。
在考虑对粘附细胞XFM研究底物，一个理想的基底需要满足以下基本要求：1）支持稳健细胞生长而不交替正常增殖和表型的细胞生长，2）必须不具有与这些元件的重叠X射线荧光的兴趣，3）是光学透明的，在光学显微镜下XFM前的细胞生长的评估，以及4）能够培养和随后的固定过程中承受的任何物理和化学操作。在历史上，不同的衬底，从薄的聚碳酸酯箔/膜35-37，聚乙烯醇缩甲醛涂覆的金透射电子显微镜（TEM）栅格38-42和氮化硅窗户5,17,43-46，已被用于生长的哺乳动物细胞s和用于X射线荧光成像。在其中用于通过XFM，氮化硅膜成像粘附哺乳动物细胞的现有和潜在的衬底比较（的Si 3 N 4）的窗户是最合适的，因为它们的低荧光背景和相对简单的元素组成4-6,47,48。另外的Si 3 N 4个窗口支持强大的细胞粘附和增殖。相对于其他常用的基材如TEM格栅上，的Si 3 N 4的窗口也有一个大得多的不间断成像区域这是当这些窗被用于X射线断层摄影术的特定优势。
的Si 3 N 4的窗口是可商购自供应商的数量有限。氮化硅窗口的工作是后天的技能。窗户是非常脆弱的，需要非常谨慎，不会造成任何扭曲力，同时处理他们可能打破，或将其删除它们。 HANDL通过反向镊子边缘荷兰国际集团他们是一种流行的做法。大多数窗口有厚度范围为30纳米至500纳米，并从1×1毫米的宽度，以5×5毫米。在一般情况下，越厚的膜，更强大的它们对各种处理压力。然而，具有增加的厚度和较少的光学透明性，它们将增加从样品的背景发射。 200nm厚的膜是比较理想的。他们对测量的影响微乎其微，但也足够坚固没有太多的破损来处理。
虽然许多类型的细胞测试可以初步附着和强劲增长的无菌的Si 3 N 4个窗口，生长在氮化硅窗口细胞一般更容易激动细胞相比传统细胞培养板。他们变得容易脱落，聚集，甚至在日常的媒体变化围捕。我们发现预洗窗往往变得更加亲水;细胞附着更好，少了陈CE聚集在一起。以上在协议中描述的步骤划定一个轻柔洗涤的方法来保持的细胞中的窗口上。可以采取一些其他步骤包括涂布的窗户用聚赖氨酸，或层粘连蛋白，正如人们可能涂层盖玻片。
这种方法，可以是一个给定的实验的成功或失败的另一个方面是所述样品的搅拌。在观察细胞的生长在塑料培养容器，搅拌似乎从移液器和平板运输造成的正常范围并没有造成多大的危害。然而，对于生长在氮化硅窗户细胞，在此期间介质的变化和板运输格外小心是必要的。对于一些容易激动的细胞，如小鼠成纤维细胞NIH / 3T3，必须审慎处理，需要包含Windows的培养皿。他们仔细从孵化器中取出，并在显微镜舞台上或机柜表面轻轻设置。不一定每个小P震撼物质环境会扰乱细胞，但细胞脱落的风险没有增加额外的照顾。此外，胎牛血清和氮化硅窗口不同批次可能对细胞的窗口上的附件有一定的影响。血清中的一些源或窗口批次似乎更容易， 也就是工作，没有通过类似的保健看到太多困扰。所以，一些试验和错误为感兴趣的细胞系可以被告知。
与发展用于X射线荧光微探针的低温阶段，以及新的研究在冷冻水合生物样品的制备中，则很可能在未来的样品制备将更加日益包括冷冻水合标本。许多在与氮化硅窗口工作，并保持细胞粘附相同的挑战存在那里。然而，掌握这种技术仍然是一个非常好的开始开发技能尝试冷冻保存前，一第二多次，是一种非常适合的方式将图像的样本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon nitride windows | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom | SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. | Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| Reverse tweezers | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers |
| Rubber grid mat | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | 71170 | Round Grid Mat |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | 338826 | trace metals grade concentrated acetic acid |
| PIPES buffer | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 | P6757 | solid PIPES buffer |
| Formaldehyde stock solution | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde |
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