Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

الأشعة السينية التصوير مضان يسمح لكل من الهوية وكمية من العناصر الموجودة في عينة لحلها مكانيا. حادث الأشعة السينية، من الطاقة مختارة لتكون أكبر من الإلكترون الطاقة من أعنف عنصر من مصلحة ملزمة، والتغلب على طاقة الربط الإلكترونات الداخلية قذيفة إلى النواة 1. وهذا يخلق "ثقب" في قذيفة الإلكترون. كما الإلكترونات طاقة أعلى تسقط في هذه الثقوب، وتنبعث الفلورسنت الأشعة السينية التي تعتمد على الطول الموجي فصل الطاقة من تلك المدارات. منذ تباعد الطاقة في المدارات هو سمة من عنصر معين، لديه الانبعاثات مضان الأشعة السينية أيضا موجات مميزة، تعتمد على العنصر. هذا هو الانبعاثات في الطول الموجي المميز الذي يتيح التعرف على العناصر الحالية. معايرة كثافة مضان تسمح الكميات من العناصر الحالية.

الأشعة السينية مضان microscopأصبح ص (XFM) تستخدم على نحو متزايد، ويرجع ذلك جزئيا إلى تطوير مصادر السنكروترون الأشعة السينية رائعة جدا، مثل تلك التي في الربيع-8 في اليابان، ومرفق الأوروبي الإشعاع السنكروترون (ESRF) في فرنسا، وفوتون المصدر المتقدم ( APS) في الولايات المتحدة (2). وتوفر هذه المصادر كثافة عالية جدا الحزم الأشعة السينية. في نفس الوقت، وإدخال تحسينات في مجال البصريات والأشعة السينية، مثل تكنولوجيا لوحة منطقة، سمح التركيز من هذه الحزم إلى البقع ميكرون الفرعي، وإن كان غير فعال بدلا 3. مع جدا الحزم عالية الكثافة، حتى كمية صغيرة نسبيا من الضوء الذي يمكن أن تركز كافية لإثارة المعادن الذاتية في الخلايا، وتنتج إشارة التي يمكن قياسها مع التكنولوجيا كاشف المتاحة حاليا. وهكذا، ودراسة البيولوجيا الكيميائية للمعادن في الخلية هي تطبيق واحد على وجه الخصوص أن يجعل من استخدام العديد من التطورات الأخيرة في هذه التقنية 4-10.

هناك العديد من العوامل الحاسمة لأخذها في الاعتبار عند التطبيقالكذب XFM للتحقيق في توزيع الأولي والكمي لخلايا الثدييات مثقف أو عينات بيولوجية أخرى. أولا، تحتاج العينة أن تبقى سليمة من الناحية الهيكلية وفيما يتعلق تكوينها عنصر، وذلك لقياس لتكون ذات مغزى. ثانيا، لا بد من الحفاظ على عينة أيضا في بعض الطريق بحيث يكون هاردي إلى أضرار الأشعة التي يمكن أن تسببها تركيزا شعاع الأشعة السينية. إحدى الطرق التي عينة يمكن تلبية كل من هذه المعايير في آن واحد هو أن يتم تجميدها بسرعة إلى الجسم الزجاجي، والجليد غير متبلور 11،12. كثيرا ما يتم تحقيق التجميد السريع من خلال تقنيات الحفظ بالتبريد مختلفة مثل يغرق تجميد أو ارتفاع ضغط تجميد 13-16. ومن المسلم به عموما أن الحفظ بالتبريد يحفظ العمارة الخلوية الشاملة والتراكيب الكيميائية في العينات البيولوجية أقرب إلى الدولة الأم وقت ممكن. تثبيت الكيميائية، من ناحية أخرى، ويرجع ذلك إلى انتشار بطيء والانتقائي للمثبتات إلى الخلايا والأنسجة كما ثالذراع تغييرات لاحقة كما في نفاذية الغشاء، قد تسمح مختلف أيونات الخلوية وخاصة أيونات إنتشاري مثل الكلور، الكالسيوم وK إلى أن ترشح، المفقودة أو نقلهم، مما يجعل التحقيق في هذه العناصر دون المستوى الأمثل 17-19. وعلى الرغم من ميزة واضحة من البرد التثبيت على تثبيت الكيميائية بشكل عام، لخلايا الثدييات ملتصقة على وجه الخصوص، الحفظ بالتبريد لديها مختلف القيود 20-23. أكثرها وضوحا هو أن ليس كل مختبر البحوث ويسهل الوصول إلى أدوات الحفظ بالتبريد. معظم المجمدات ارتفاع ضغط الحالية أو حتى يغرق المجمدات مكلفة ومملوكة فقط من قبل مجموعة فرعية من مرافق البرد، والتي قد تكون بعيدة عن حيث يتم تحضين الخلايا. قد يتم تداولها صالح الحفظ بالتبريد لعيب الإجهاد السفر المفروضة على الخلايا. وهكذا، في حين الحفظ بالتبريد هو بالتأكيد الطريق الأكثر صرامة للحفاظ على عينات للتحليل مضان الأشعة السينية، فمن المؤكد أنها ليست الأكثر في متناول جميع الباحثين في جميع الظروف.كما أنها ليست دائما ضرورية - إذا كان المعادن ذات الأهمية لا بد بإحكام على الجزيئات يمكن حلها، والقرار الذي سيتم تصويرها على عينة أكبر من الأضرار التي لحقت-المجهرية جدا التي قد تحدث أثناء التجفيف. وإذ تضع في اعتبارها المحاذير 24، تثبيت الكيميائية وتجفيف قد يكون خيارا مناسبا.

وتشمل العوامل الأخرى في الأشعة السينية تجربة التصوير مضان ناجحة تحليل سليم. الأشعة السينية التصوير مضان هو في الأساس الأشعة السينية الطيفي الانبعاثات مضان جنبا إلى جنب مع النقطية المسح إلى توفير تحليل المكاني. أطياف الانبعاث مضان الأشعة السينية التي تم جمعها تحتوي على مزيج من تداخل القمم الانبعاثات، الخلفية، والقمم نثر المرنة وغير المرنة من شعاع الحادث. البرمجيات التي تمكن من الإلتواء اجتثاث هذه المساهمات، وتركيب قمم الانبعاثات كان، وهو تطور حاسمة في هذا المجال 25. أيضا، وتطوير وشعبة نظم التجاريribution المعايير الأغشية الرقيقة من تكوين معروفة، وتستخدم لمعايرة كثافة مضان بالنسبة لكمية المواد، وقد تم أيضا مهم جدا.

يوفر هذا البروتوكول وصفا لإعداد الخلايا الملتصقة من قبل التثبيت الكيميائية والتجفيف في الهواء. خطوة حيوية في هذه العملية هي نمو الخلايا على النوافذ نيتريد السيليكون، والتي غالبا لا تلتزم بشكل جيد، مما يجعل الشطف لطيف في مفتاح الأزياء معين لتحقيق النجاح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الآلات، ركائز، الثقافة وسائل الإعلام وأطباق

  1. التعامل مع من السيليكون نتريد (سي 3 ن 4) النوافذ.
    1. فتح الكبسولة قليلا من خلال الضغط على نهاية واحدة تحتوي على نافذة في مثل هذه الطريقة لعدم الضغط على نافذة نفسه، في حين تناوب على الطرف الآخر من الكبسولة مع جهة أخرى.
    2. تحقق زوج من الاتجاه المعاكس، ملاقط غرامة ذات الرؤوس تحت stereomicroscope للتأكد من عدم وجود لاصق، ثغرات أو الانحناءات على الحافة. خلاف ذلك، قد يكون كسر النوافذ بواسطة ملاقط أو يطير منهم خلال الخطوات اللاحقة.
    3. إزالة نافذة من الكبسولة التي كتبها استيعاب بعناية إطار النافذة مع ملاقط، في حين الضغط بلطف الكبسولة قرب نهاية مفتوحة الضغط في اتجاه وذلك لجعل الكبسولة أوسع حيث تحتاج حواف نافذة للخروج.
  2. نافذة قبل غسل (اختياري).
    1. إذا رغبت في ذلك، والنوافذ قبل غسل بلطف بواسطة غمس لهمفي الماء المقطر لمدة 5 ثانية، تليها 2 دقيقة يغسل في 70٪ من الإيثانول و 2 دقيقة يغسل في الإيثانول بنسبة 100٪.
  3. الالصاق وتعقيم النوافذ على طبق الثقافة.
    1. لتركيب النوافذ، تعيين نافذة مع الجانب المسطح يصل في أسفل الطبق الثقافة، ضع قطعة من الشريط على شريحة زجاجية نظيفة. قطع نحو قطاع ربع بوصة من أسفل الجانب طويلة من الشريط. خذ قطعة من الشريط قبالة الجانب القصير (في ⅛ "من قبل ¾") بشفرة حلاقة نظيفة.
    2. استخدام ملاقط لتطبيق شريحة من الشريط إلى حافة الشبكة أو النافذة. استخدام ما يكفي للالتزام بشكل آمن دون تغطية افتتاح النافذة نفسها. التلاعب في الشريط الالتزام مع ملاقط، وضعت نافذة أسفل على الجزء السفلي من الطبق الثقافة. استخدام غيض من ملاقط التمسك الشريط إلى أسفل الطبق الثقافة بحزم.
    3. تطبيق الشريط الشريط أخرى إلى الحافة الأخرى والتقيد هذا إلى أسفل بحزم مع غيض من ملاقط.
    4. مرة واحدة كل النوافذمسجلة، وتعقيم النوافذ في أطباق الثقافة مع الأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة. تحقيق ذلك عن طريق وضع طبق تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في غطاء تدفق الصفحي لمدة 1 ساعة.
    5. (اختياري) إذا النوافذ لتكون مرحلة ما قبل المغلفة مع البولي يسين، تفعل ذلك بعد نافذة التعقيم. معطف النافذة مع 10 ميكرولتر من العقيمة 0.01٪ بولي-L-يسين الحل لمدة 1 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية، ثم شطف الحل المتبقية قبالة مع وسائل الإعلام الثقافة.
  4. إعداد مخازن لغسل النهائي قبل XFM.
    1. إعداد إما تريس الجلوكوز أو piperazine- N، N '-bis (حمض ethanesulfonic) (أنابيب) -sucrose عازلة خالية من أي المعادن النزرة مع الأسمولية ودرجة الحموضة ما يعادل Dulbecco والفوسفات عازلة المالحة (D-PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام أحد هذه المخازن المؤقتة لشطف الخلايا بعد الخلايا الثابتة كيميائيا.
      1. لجعل حل تريس، الجلوكوز (10 ملي تريس، 260 ملي الجلوكوز، 9 ملي حمض الخليك،) إضافة 1.4 غرام من الجلوكوز، 36 ملغ من قاعدة تريس و16 ميكرولتر من حمض الخليك إلى 20 مل من الماء عالى النقاء. ثم، وضبط الحجم النهائي إلى 30 مل مع الماء عالى النقاء. ليس هناك حاجة إلى تعديل درجة الحموضة. تخزين في RT تصل إلى أسبوع واحد.
      2. لجعل أنابيب السكروز (20 أنابيب ملي و 200 ملي السكروز) إضافة 0.18 غرام من أنابيب و 2.0 غرام من السكروز إلى 20 مل من الماء عالى النقاء وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع كميات صغيرة من حمض الخليك المركز. ثم، وضبط الحجم النهائي إلى 30 مل مع الماء عالى النقاء. تخزين في RT تصل إلى أسبوع واحد.
        ملاحظة: السبب لتجنب استخدام برنامج تلفزيوني في الشطف النهائي هو أن تركيزات الفوسفات وكلوريد البوتاسيوم وفي برنامج تلفزيوني مرتفعة بحيث يمكن أن تتداخل مع XFM إذا لم يتم إزالته تماما قبل التجفيف في الهواء.
  5. إعداد مخازن للطلاء الخلية.
    1. إعداد أو إخراج جميع وسائل الإعلام، مثل RPMI المتوسطة 1640، 1X التربسين-EDTA الحل، D-PBS، وأي الكواشف الأخرى حسب الحاجة لمعين خط خلية ملتصقة كما عادة يتم ذلك عن الركض الخلايا الملتصقة سالفائدة و، وتدفئة لهم إلى 37 درجة مئوية.

2. التصفيحات من الخلايا

  1. إلى الطبق الثقافة تعقيم تحتوي على النوافذ، في غطاء تدفق الصفحي، إضافة بلطف وسائل الإعلام (10 مل لطبق ثقافة 100 ملم)، على طول الجانب من الطبق الثقافة معها يميل بزاوية. تجنب خلق التوتر السطحي لزوم لها أو إسقاط وسائل الاعلام مباشرة على سطح النوافذ نيتريد السيليكون. كما تم إضافة وسائل الإعلام، وتخفيف ببطء زاوية الميل إلى معطف الشبكة ونافذة مع وسائل الإعلام.
  2. إعداد خط خلية ملتصقة الاهتمام بشكل مناسب، trypsinizing أو كشط الخلايا الخروج من لوحات كالمعتاد لالركض خط الخلية. القيام بأي العد الخليوي، أو إعداد الأخرى الضرورية قبل تطبيق الخلايا إلى لوحة جديدة.
  3. إضافة الخلايا إلى صحن الثقافة مع ويندوز في مناطق ذات كثافة خلية ما هو مطلوب للوصول إلى عادة 50٪ -70٪ التقاء في غضون 24-72 ساعة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. مراقبة نمو الخلايا في بعض الأحيان، وذلك باستخدام المجهر الضوئي مقلوب، حتى كثافة الخلية المطلوب (عادة 50٪ -70٪ التقاء) يتم التوصل.

3. تثبيت للخلايا

  1. إعداد الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ في D-PBS عن طريق تمييع الأسهم المشتراة (مثل 25٪ امتصاص العرق) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الخليك (لتجنب مضيفا الصوديوم الزائد للعينة).
  2. عندما تم نمت الخلايا كما هو مطلوب، ولقد تم تطبيق أي البقع الحيوية (مثل Hoescht) وتصويرها، وإزالة وسائل الإعلام التي كتبها طموح لطيف، إمالة الطبق في زاوية 45 درجة مع يد واحدة، والشفط باليد ماصة مع الآخر .
    ملاحظة: بدلا من pipetting لقضى وسائل الإعلام، والبديل هو اختيار النافذة تصل، وتراجع نافذة أنابيب microcentrifuge مع D-PBS مرتين ثم وضعه في وعاء ثقافة جديدة مع حلول تثبيتي لمدة 20 دقيقة تليها 2 مرات من PBS يغسل لإزالة مثبتات المتبقية. إذا ما تم اختيار هذا، انتقل ديرectly إلى الخطوة 3.5.
  3. شطف الطبق برفق مع D-PBS واستبدال السائل إزالتها على الفور عن طريق إضافة بلطف الطازجة 4٪ PFA / PBS حين عقد الطبق في زاوية 45 درجة، pipetting لنحو الجانب من الطبق، والاسترخاء ببطء زاوية الميل للسماح لل الحل تثبيتي لتغطية النوافذ. الحفاظ على خلايا مغطاة تثبيتي لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. إزالة السائل بواسطة طموح لطيف، ومرة ​​أخرى على النحو الوارد أعلاه، إمالة الطبق قليلا والشفط باليد.
  5. استبدال السائل إزالتها عن طريق إضافة بلطف بعض أنابيب / حل السكروز، وذلك باستخدام أسلوب إمالة وpipetting لهو موضح في الخطوة 3.3.
  6. كرر الخطوات من 3.4 و 3.5.
  7. إعداد المواد للتجفيف.
    1. جمع المناشف خالية من الوبر مثل Kimwipes، وسحب واحد من مربع لذلك هو مفيد للغاية بسرعة وسهولة.
    2. إعداد، مكان نظيف غير مستوى لضبط نافذة لتجف. المبين حصيرة شبكة المطاط من الأنواع المستعملة في المجهر الإلكتروني، الذي لديه التلال ذلكيمكن مسنود نافذة واحدة على نهاية في حين أن يجف. هذا وسوف تبقي نافذة من أن يعلقوا على سطح التجفيف لأنه يجف، واستنزاف أي عازلة المتبقية إلى حافة العينة.
  8. ينتف الريش بعناية الشريط تعلق على نافذة لعقد نافذة للخروج من السائل. استرداد النوافذ التي تأتي من خارج الشريط من خلال تطبيق كمية صغيرة من أنابيب / السكروز لحملهم على تعويم ثم انتشالها مع ملاقط العكسية.
  9. بعناية (بدون لمس نافذة نفسه) وبدقة جصص أي أنابيب الزائد / السكروز من على حافة النافذة مع Kimwipe. جصص أيضا منطقة بادئة مرة أخرى باستخدام أضعاف مقربة من Kimwipe.
    ملاحظة: إن الهدف هو أن يكون تبلور أقل قدر من الأملاح أو مخازن على سطح النافذة وقت ممكن.
  10. وضع نافذة على حصيرة الشبكة. تأكد من أن نافذة لا الاستلقاء على حصيرة الشبكة، ولكن مسنود حتى على حافة (باستخدام التلال من حصيرة الشبكة) ولمس اقل من الشبكةحصيرة ممكن. السماح للنافذة الجافة.

4. تصاعد عينة والتصوير

  1. مرة واحدة قد جفت العينة، تحقق من وجود خلايا على النوافذ باستخدام المجهر الضوئي. تنفيذ هذا التحقق، قبل إعداد العينات للنقل إلى السنكروترون.
  2. حزمة النوافذ للنقل إلى beamline السنكروترون استضافة تجربتك. يضعوا بلطف النوافذ مع الشريط على الجانبين لشريحة زجاجية، ثم يلصق الشريحة الزجاجية مع الشريط إلى أسفل طبق بتري البلاستيك. الشريط طبق بيتري مغلقة.
    ملاحظة: قبل هذه النقطة، ويمكن تنفيذ هذه الخطوات في أي مختبر نموذجي. من الأفضل أن يتم ذلك بالخطوات التالية في beamline السنكروترون.
  3. إزالة الشريط من نافذة بلطف مع ملاقط. استخدام طلاء الأظافر، حتى في طبقة رقيقة على طول حافة النافذة، لتأمين النوافذ إلى حامل الألومنيوم التي تقدمها المتعاونين beamline في السنكروترون.
  4. إدراج حامل الألومنيوم فيوالحركية جبل، ومن ثم وضعه في موقف في المجهر الأشعة السينية. جبل العينة على شريحة توصيله إلى مراحل الآلية، داخل حجرة العينة في beamline.
  5. بعد الخروج من الأشعة السينية منطقة أداة المجهر عينة (أ القفص مصنوعة من الجدران المليئة الرصاص)، والإعداد للمسح. باستخدام برنامج beamline محددة، واختيار المنطقة المناسبة من العينة إلى مسح، أثناء عرض موقف شعاع الأشعة السينية على العينة باستخدام كاميرا مجهزة الفيديو عبر الشعر ومع كاميرا ماض المصب الانحياز مسبقا.
  6. اختيار القرار المناسب للعينة، استنادا إلى تقدير لحجم أصغر سمة من سمات الفائدة. لتصوير خلايا الثدييات واحدة (~ 20-40 ميكرومتر في الحجم)، واستخدام قرار من 0.25-0.5 ميكرون. لتصوير مناطق من الأنسجة، والتمييز بين طبقات الخلايا عن بعضها البعض، استخدام دقة من 2-20 ميكرون.
  7. اختيار الوقت المناسب ليسكن العينة، استنادا إلى تقدير كمية من التقىآل المصالح الحاضر. لمحة المسح السريع، أو إذا كميات عالية من المعادن موجودة، استخدام فحوصات الطاير مع الأوقات يسكن من 30-300 ميللي ثانية لكل بكسل. إذا كانت المادة قليلة موجودة، أو لقياس المعادن من الوفرة النسبية منخفضة، واستخدام خطوة بالاشعة مع أوقات يسكن من 1-2 ثانية لكل بكسل.
  8. برمجة المسح في البرنامج beamline محددة. الحصول على صورة خطوط المسح الضوئي. العمل مع المتعاونين beamline لتحليل البيانات مع البرامج التي من شأنها تحديد القمم الطاقة المميزة لكل عنصر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قدرة التصوير مضان الأشعة السينية لتوفير المعلومات حول العينات البيولوجية تتوقف على هذه العينات التي يجري إعدادها في مثل هذه الطريقة أنها متماسكة إلى أضرار الإشعاع على مقياس الوقت من التجربة، وبعد هم الكيميائية والسمات الهيكلية بشكل جيد الحفاظ عليها. في عرض نتيجة العينة التي تم إعدادها على النحو المبين أعلاه وتصويرها، فمن الممكن أن نرى أن هناك تباين في العناصر الحالية - مشيرا إلى أن التثبيت الحفاظ على هذه الجوانب من الخلية (الشكل 1).

وعلى العكس، وتبحث بدلا من ذلك في عينة حيث هذه العملية لم تسير على ما يرام، ويبقى المخزن المؤقت حاضرا أثناء التجفيف، وتشكيل الكريستال واسعة من الجزيئات الحالية يخلق الضرر الهيكلي للخلايا ويتداخل مع مجموعة من أطياف مضان الأشعة السينية (أيضا الشكل 2).

يتم إنشاء هذه الصور عن طريق لكل بكسل المناسب من الطيف مضان الأشعة السينية في كل نقطة في الصورة. وهذا يعني أن كل الطيف، وجمعها في كل بكسل، تم تحليلها بشكل فردي. عند عرض لوحات في هذه الصور المتولدة من البيانات المجهزة، والقيمة التي تم تعيينها إلى كل نقطة في الصورة هي مجموع متكاملة من التمويه لانبعاث مميزة من عنصر معين (على سبيل المثال، والحديد) كما يناسب مضان الأشعة السينية الطيف جمعت في تلك المرحلة. على سبيل المثال، بكسل واحد في الصورة له قيمة (عدد) للحديد، والذي هو مجموع المساحة تحت منحنى جاوس في الطاقة الانبعاثات مميزة للحديد، التي تناسبها ونماذج البيانات لطيف الانبعاث من هذه النقطة على العينة. يتم عرض البيانات مع القيم عتبة فوق كل صورة (ماكس ودقيقة) أن تعيين العالية والغايات منخفضة من جدول الألوان (في أسفل كل صورة) لقيم معينة داخل الصورة.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "العرض =" 700 "/>
يعرض الشكل 1. الأشعة السينية صورة الإسفار من خلية الإنسان SH-SY5Y. كل لوحة في هذه الصورة معلومات مختلفة عن الخلايا نفسها. الفريق الأول، وصفت مدينة دبي للإنترنت، هو تدخل الفرق النقيض من صورة مجهرية ضوئية من الخلايا. لوحات التالية، من اليسار إلى اليمين، هي الفسفور (P)، (S) الكبريت والحديد (الحديد)، والزنك (الزنك) وصور من نفس الخلايا، والتي تبين توزيعها فوق منطقة الخلية. شريط النطاق المبين هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الأشعة السينية صورة الإسفار من خلية فأر B103، أعدت مع ضعف أو عدم كفاية إزالة المخازن المؤقتة. خليتين مرئية في (P) لوحة الفوسفور،وتكون مرئية بشكل طفيف في الحديد (الحديد) والزنك (الزنك) لوحات. ومع ذلك، فإن وجود عازلة تبلور وظاهرة للعيان كما مسحة من الجسيمات من خلال مركز الصورة، يحجب معظم المعلومات. شريط النطاق المبين هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأشعة السينية التصوير مضان مفيد في العديد من المجالات، بما في ذلك علوم الأرض، وعلوم المواد، والبيولوجيا الكيميائية 26-34. أنتجت التقدم في السنكروترون الأشعة السينية، والتركيز، وللغاية الحزم عالية الكثافة. الحزم تركيزا الأشعة السينية كافية لإثارة المعادن المحلية في خلايا موجودة الآن، وتنتج إشارة التي يمكن قياسها مع المتاحة حاليا تكنولوجيا السيليكون كاشف الانجراف. ودراسة البيولوجيا الكيميائية للمعادن في الخلية هي تطبيق واحد على وجه الخصوص أن يجعل من استخدام العديد من التطورات الأخيرة في هذا المجال.

ومع ذلك، فإن دراسة المواد البيولوجية باستخدام الأشعة السينية مضان المجهر يقدم أيضا تحديات خاصة، نسبة إلى غيرها من المواد، لأنهم رطب. لمنع أضرار الإشعاع، من الناحية المثالية العينات سيتم المجمدة في الجليد الزجاجي أثناء القياس. ومع ذلك، التثبيت الكيميائية وتجفيف الهواء أكثر في متناول الكثير لمبتدئ، وربما يكون من المناسب إذا المعادنمن الفائدة inertly بد أن الجزيئات يمكن حلها، والقرار الذي سيتم تصويرها على عينة أكبر من الأضرار التي لحقت-المجهرية جدا التي قد تحدث أثناء التجفيف.

عند النظر في ركائز للخلية ملتصقة الدراسات XFM، تحتاج الركيزة المثلى لتلبية المتطلبات الأساسية التالية: 1) دعم نمو الخلايا قوية دون بالتناوب التكاثري والمظهرية نمو الخلايا العادية، 2) يجب أن لا يكون مضان الأشعة السينية التي تتداخل مع تلك العناصر من الفائدة، 3) أن تكون شفافة بصريا لتقييم نمو الخلايا تحت المجهر الضوئي قبل XFM، و4) تكون قادرة على الصمود أمام أي تلاعب الفيزيائية والكيميائية أثناء زراعة وتثبيت لاحق. تاريخيا، ركائز مختلفة، بدءا من رقائق البولي رقيقة / أفلام 35-37، formvar المجهري الذهب المطلي انتقال الإلكترون (TEM) شبكات 38-42 ونيتريد السيليكون النوافذ 5،17،43-46، وقد استخدمت لزراعة خلايا الثديياتالصورة واستخدامها في الأشعة السينية التصوير مضان. في المقارنة بين ركائز القائمة والمحتملة لتصوير خلايا الثدييات ملتصقة التي كتبها XFM، والسيليكون غشاء نيتريد (سي 3 ن 4) النوافذ هي الأكثر مناسبة بسبب انخفاض خلفية مضان وتكوين عنصر بسيط نسبيا 4-6،47،48. بالإضافة سي 3 ن 4 دعم ويندوز مرفق الخلية القوي والانتشار. بالمقارنة مع غيرها من ركائز شائعة الاستخدام مثل الشبكات TEM، سي 3 N لديها 4 النوافذ أيضا منطقة التصوير دون انقطاع أكبر بكثير مما هو ميزة خاصة عندما تستخدم هذه النوافذ لالمقطعي بالأشعة السينية.

تتوفر تجاريا من عدد محدود من الباعة سي 3 ن 4 النوافذ. العمل مع ويندوز نيتريد السيليكون هو المهارة المكتسبة. النوافذ هي هشة للغاية، وتتطلب عناية كبيرة لعدم إنشاء أي قوات التواء في حين التعامل معها التي قد تتحطم عليها، أو لإسقاط لهم. هندللهم جي من الحواف باستخدام الملقط العكسي هو نهج شعبي. معظم النوافذ لها سمك تتراوح من 30 نانومتر إلى 500 نانومتر، وعرض من 1 × 1 مم إلى 5 × 5 مم. في العام، وأثخن في الغشاء، وأكثر قوة لها أن جميع أنواع التعامل مع الإجهاد. ومع ذلك، مع زيادة سمك والشفافية أقل البصرية، وأنها سوف تزيد من الانبعاثات الخلفية من العينة. 200 أغشية سميكة نانومتر هي مثالية جدا. لديهم تأثير ضئيل على القياس، ومع ذلك هي قوي بما يكفي لمعالجة دون الكثير من الكسر.

على الرغم من أن العديد من أنواع الخلايا اختبار يمكن أن نعلق في البداية وتنمو بقوة على العقيمة سي 3 ن 4 النوافذ، والخلايا المزروعة على السيليكون النوافذ نيتريد هي بشكل عام تحريكها بسهولة أكثر بكثير من الخلايا على لوحات زراعة الخلايا التقليدية. فإنها تصبح منفصلة بسهولة، وتجميعها أو اعتقلوا حتى خلال التغييرات الوسائط الروتينية. لقد وجدنا في كثير من الأحيان أصبحت النوافذ قبل غسلها ماء أكثر. خلايا نعلق أفضل، وكان أقل تشانم لتجميع معا. الخطوات الموضحة في البروتوكول فوق ترسم نهجا لطيف غسل للحفاظ على الخلايا على النافذة. وتشمل بعض الخطوات الأخرى التي يمكن اتخاذها طلاء النوافذ مع بولي يسين، أو laminin، تماما كما واحدة معطف قوة ساترة.

جانب آخر من هذه الطريقة التي يمكن أن تكون على نجاح أو فشل التجربة معين هو تسخين العينات. في مراقبة نمو الخلايا في الأوعية البلاستيكية الثقافة، لا يبدو أن المعدل الطبيعي للالانفعالات الناتجة عن pipetting لوحة والنقل أن يسبب الكثير من الضرر. ومع ذلك، لالخلايا المزروعة على السيليكون نيتريد النوافذ، هناك حاجة إلى مزيد من الحذر أثناء تغيير وسائل الاعلام وصفيحة النقل. وبالنسبة لبعض خلايا تحريكها بسهولة مثل الخلايا الليفية الماوس NIH / 3T3، لوحات الثقافة التي تحتوي على نوافذ تحتاج إلى التعامل معها بعناية. ويتعين أن تتخذ أنهم بعناية من الحاضنة ومجموعة بلطف على المسرح المجهر أو سطح مجلس الوزراء. ليس بالضرورة كل ص القليلسوف صدمة hysical تخل الخلايا، ولكن من خطر انفصال الخلايا ويزيد من دون مزيد من الحذر. وبالإضافة إلى ذلك، قد دفعات مختلفة من الجنين البقري المصل ونيتريد السيليكون نوافذ لها آثار معينة على المرفق من الخلايا على النافذة. بعض المصادر من المصل أو دفعات من النوافذ تبدو أسهل للعمل مع، أي دون رؤية الكثير من الاضطرابات التي كتبها رعاية مماثلة. لذلك، قد ينصح بعض التجربة والخطأ للخط خلية من الفائدة.

مع التطورات في مراحل المبردة لمجهرية مضان الأشعة السينية، وكذلك البحوث العلمية الجديدة في إعداد العينات البيولوجية المائية المجمدة، فمن المرجح أن إعداد العينات في المستقبل أكثر من ذلك بكثير على نحو متزايد وتشمل تجميد العينات المائية. الكثير من نفس التحديات في العمل مع النوافذ نيتريد السيليكون، والإبقاء على التصاق الخلايا موجودة هناك أيضا. ومع ذلك، وإتقان هذه التقنية لا تزال مكانا جيدا جدا لبدء في تطوير المهارات قبل محاولة الحفظ بالتبريد، لالثانية مرات عديدة، هو وسيلة مناسبة تماما لعينات الصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

الكيمياء، العدد 97، الأشعة السينية، مضان، والتصوير، والمعادن، البيولوجيا الكيميائية، المجهري، السنكروترون
إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter