Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern 1. Hierdoor ontstaat een 'gat' in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie emissie ook karakteristieke golflengten, afhankelijk van het element. Hierdoor emissie bij een karakteristieke golflengte die de identificatie van de aanwezige elementen toelaat. Kalibratie van de fluorescentie-intensiteit maakt de kwantificering van de aanwezige elementen.

X-ray fluorescentie microscopy (XFM) is in toenemende mate benut, mede door de ontwikkeling van zeer briljante X-ray synchrotron bronnen, zoals die bij Spring-8 in Japan, de Europese Radiation Synchrotron Facility (ESRF) in Frankrijk, en de Advanced Photon Source ( APS) in de US 2. Deze bronnen bieden zeer hoge intensiteit röntgenstralen. Tegelijkertijd, verbetering röntgenoptiek, zoals zoneplaat technologie, kon de concentratie van deze bundels op submicron spots, zij het ​​wat inefficiënt 3. Met zeer hoge intensiteit balken, een betrekkelijk kleine hoeveelheid licht kan worden gericht voldoende om de endogene metalen in cellen wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige detectortechnologie. Aldus bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen in deze techniek maakt 4-10.

Er zijn veel kritische factoren worden beschouwd, terwijl appliggend XFM de elementaire verdeling en kwantificering van gekweekte zoogdiercellen of andere biologische monsters te onderzoeken. Ten eerste moet het monster intact te blijven, zowel structureel als wat betreft de elementaire samenstelling, zodat de meting zinvol zijn. Ten tweede moet het monster worden bewaard andere manier zodat het winterhard tot stralingsschade die kan worden veroorzaakt door een gerichte röntgenbundel. Een manier die een monster kan aan deze beide criteria tegelijk is om snel tot een glasachtig, amorfe ijs 11,12 worden bevroren. Snel invriezen wordt vaak bereikt door middel van verschillende cryopreservatie technieken zoals invallend bevriezing of hoge druk invriezen 13-16. Het is algemeen aanvaard dat cryopreservatie bewaart totale cellulaire architectuur en de chemische samenstellingen in biologische monsters dicht natieve toestand mogelijk. Chemische fixatie, anderzijds, vanwege de langzame en selectieve penetratie van fixeermiddelen in cellen en weefsels well als latere wijzigingen in membraanpermeabiliteit, kunnen verschillende cellulaire ionen vooral de diffundeerbare ionen zoals Cl, Ca en K worden uitgeloogd, verloren of verplaatst, dus waardoor het onderzoek van deze elementen suboptimale 17-19 mogelijk te maken. Ondanks het duidelijke voordeel van cryo-fixatie dan chemische fixatie in het algemeen, voor adherente cellen van zoogdieren in het bijzonder, cryopreservatie heeft verschillende beperkingen 20-23. De meest voor de hand liggende is dat niet elk onderzoek lab heeft een gemakkelijke toegang tot cryopreservatie instrumenten. De meeste huidige hoge druk diepvriezers of zelfs dompelen vriezers zijn kostbaar en bezit alleen een subset van cryo faciliteiten, ver van waar cellen worden geïncubeerd zijn. Het voordeel van cryopreservatie zou kunnen worden verhandeld voor het nadeel van reizen spanning geplaatst op de cellen. Dus, terwijl cryopreservatie is zeker de meest rigoureuze manier om monsters voor X-stralen fluorescentie analyse te bewaren, het is zeker niet de meest toegankelijk is voor alle onderzoekers onder alle omstandigheden;noch is het essentieel - als de metalen worden strak gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen. Indachtig de kanttekeningen 24, kan chemische fixatie en drogen een geschikte keuze te zijn.

Andere factoren in een succesvolle röntgenfluorescentie imagingexperiment omvatten juiste analyse. X-stralen fluorescentie beeldvorming is fundamenteel X-ray fluorescentie-emissie spectroscopie gecombineerd met raster-scan om ruimtelijke resolutie bieden. De X-ray fluorescentie-emissie spectra verzameld bevatten een combinatie van overlappende emissie pieken, achtergrond, en de elastische en inelastische verstrooiing toppen van de invallende bundel. Software die de de-convolutie van deze bijdragen, en de montage van de uitstoot pieken mogelijk maakt, is een kritische ontwikkeling van dit gebied 25. Ook de ontwikkeling en commerciële distribution van dunne-film standaarden van bekende samenstelling, gebruikt voor fluorescentie-intensiteit ten opzichte materiaalhoeveelheid calibreren is ook belangrijk geweest.

Dit protocol geeft een beschrijving van de bereiding van hechtende cellen door chemische fixatie en drogen aan de lucht. Een essentiële stap in dit proces is de groei van de cellen op het siliciumnitride ramen, die vaak niet goed hechten, waardoor zacht spoelen op een bepaalde wijze sleutel tot succes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de instrumenten, Substrates, Cultuur Media en Schotels

  1. Behandeling van Siliciumnitride (Si 3 N 4) ramen.
    1. Open de capsule enigszins door uitknijpen ene uiteinde met het venster op zodanige wijze dat het raam zelf niet knijpen, terwijl het draaien van de andere kant van de capsule met de andere hand.
    2. Check een paar omgekeerde, puntig pincet onder stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen lijm, gaten of bochten aan het uiteinde. Anders kunnen de ramen worden gebroken door de pincet of vliegen van hen tijdens de volgende stappen.
    3. Haal het venster uit de capsule door voorzichtig grijpen het kader van het venster met een pincet, terwijl knijpen de capsule aan de bovenrand aanbrengen van druk in een richting om de capsule breder te maken wanneer de randen van het raam moet komen.
  2. Venster pre-wash (optioneel).
    1. Indien gewenst, voorwas ramen door ze voorzichtig te dompelenin gedestilleerd water gedurende 5 seconden, gevolgd door 2 minuten wassen in 70% ethanol en 2 minuten wassen in 100% ethanol.
  3. Het aanbrengen en het steriliseren van ramen aan de cultuur schotel.
    1. Om de ramen aan te brengen, stelt u het venster met de platte kant naar boven op de bodem van de cultuur schotel, leg een stukje tape op een schoon glasplaatje. Snijd ongeveer een kwart inch strip af langs de lange zijde van de tape. Neem een ​​stukje tape uit de korte zijde (bij ⅛ "met ¾") met een schone scheermesje.
    2. Gebruik pincet om het stukje tape toepassing op de rand van het rooster of raam. Gebruik voldoende om veilig te houden zonder die de raamopening zelf. Manipuleren van de gehandeld tape met een pincet, stelt het raam naar beneden op de bodem van de cultuur schotel. Gebruik de punt van de pincet tape hechten aan de bodem van de kweekschaal stevig.
    3. Breng een strip aan de andere rand en zich deze aan de onderzijde verbonden met het uiteinde van de pincet.
    4. Zodra alle ramen zijnafgeplakt, steriliseren ramen in de cultuur gerechten met ultraviolet (UV) straling. Dit te bereiken door het plaatsen van de schotel onder de UV lamp in een laminaire stroming kap voor ongeveer 1 uur.
    5. (Optioneel) Als ramen zijn om vooraf worden bekleed met poly-lysine, hoeft dus volgende venster sterilisatie. Coat het raam met 10 ul steriel 0,01% poly-L-lysine oplossing gedurende 1 uur in een 37 ° C incubator, en spoel de resterende oplossing weg het kweekmedium.
  4. Bereid buffers voor de laatste wasbeurt voordat XFM.
    1. Bereid ofwel een Tris-glucose of piperazine-N, -sucrose N-bis (ethaansulfonzuur) (PIPES) vrij van sporenmetalen met osmolariteit en pH equivalent aan Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) buffer zonder calcium en magnesium. Gebruik een van deze buffers aan cellen te spoelen na cellen chemisch worden gefixeerd.
      1. De Tris-glucose-oplossing (10 mM Tris, 260 mM glucose, 9 mM azijnzuur,) maak voeg 1,4 g glucose, 36 mg Tris base en16 gl azijnzuur 20 ml ultrazuiver water. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Geen pH aanpassing nodig. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week.
      2. Te maken de leidingen-sucrose (20 mM PIPES, 200 mM sucrose) toe te voegen 0,18 g van leidingen en 2,0 g sucrose tot 20 ml van ultrapuur water en breng de pH op 7,4 met kleine hoeveelheden geconcentreerd azijnzuur. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week.
        OPMERKING: De reden om het gebruik van PBS in het naspoelen is dat de concentratie van fosfaat, chloride en kalium in PBS zo hoog dat het kan interfereren met XFM als deze niet volledig verwijderd voordat de lucht drogen.
  5. Bereid buffers voor mobiele plating.
    1. Bereid of neem alle media zoals RPMI medium 1640, 1x trypsine-EDTA-oplossing, D-PBS, en andere reagentia nodig voor de bepaalde hechtende cellijn wordt normaal gedaan passage van de hechtende cellen of belang en warm ze tot 37 ° C.

2. Het plateren van Cellen

  1. De gesteriliseerde kweekschaal met de ramen in de laminaire stroming kap voorzichtig medium (10 ml voor een 100 mm kweekschaal) toe, langs de kant van de kweekschaal met het scheef staat. Vermijd onnodige oppervlaktespanning of het laten vallen van de media direct op het oppervlak van siliciumnitride ramen. Omdat de media wordt toegevoegd, langzaam verlichten van de kantelhoek om de vacht van het net en het venster met de media.
  2. Bereid de aanhanger cellijn van belang adequaat, trypsinizing of schrapen van de cellen af ​​van de platen zoals gebruikelijk voor passage van de cellijn. Voer een cel tellen, of andere voorbereiding nodig voor het aanbrengen van de cellen aan de verse plaat.
  3. Cellen toe te voegen aan de cultuur schotel met ramen bij een celdichtheid die nodig is om 50% -70% samenvloeiing meestal bereiken binnen 24-72 uur, en incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Let groei van de cel af, met een omgekeerde lichtmicroscoop, totdat de gewenste celdichtheid (gewoonlijk 50% -70% confluentie) bereikt.

3. Fixatie van Cellen

  1. Bereid vers 4% paraformaldehyde in D-PBS door verdunning van een voorraad gekocht (bijvoorbeeld 25% paraformaldehyde) en de pH op 7,4 met azijnzuur (niet te verhogen overmaat natrium te voegen).
  2. Wanneer cellen werden gekweekt zoals gewenst, en alle vitale vlekken (zoals Hoechst) zijn toegepast en afgebeeld, verwijder de media door zachte aspiratie, kantelen van de schotel 45 ° hoek enerzijds en aanzuigen hand pipet met de andere .
    OPMERKING: In plaats van pipetteren besteed media, een alternatief is om het venster te halen, dompel het raam in microcentrifugebuisjes met D-PBS twee keer en leg het in een nieuwe cultuur schip met een fixatief oplossingen gedurende 20 min gevolgd door 2 maal PBS wassen de resterende fixeermiddelen verwijderen. Als dit wordt gekozen, gaat directly stap 3.5.
  3. Spoel de schotel voorzichtig met D-PBS en onmiddellijk vervangen de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van de verse 4% PFA / PBS terwijl het gerecht in een hoek van 45 °, pipetteren in de richting van de kant van de schotel, en langzaam het ontspannen van de kantelhoek om de fixeeroplossing ter dekking van de ramen. Houd de cellen bedekt met fixatief 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder de vloeistof door zachte aspiratie, opnieuw zoals hierboven, het kantelen van de schotel lichtjes en opzuigen met de hand.
  5. Vervang de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van een aantal van de leidingen / sucrose-oplossing, met behulp van het kantelen en pipetteren methode in stap 3.3 beschreven.
  6. Herhaal stap 3.4 en 3.5.
  7. Bereid de materialen drogen.
    1. Verzamel-pluizende handdoeken zoals Kimwipes, en trek een out of the box, dus het is handig zeer snel en gemakkelijk.
    2. Bereid een schone, niet-niveau plaats te zetten het raam te drogen. Stel een rubberen mat raster van de soort gebruikt in elektronenmicroscopie, die ribbels heeft zohet raam kan worden gestut aan één uiteinde terwijl het droogt. Het venster houden komen te zitten aan het droogoppervlak als het droogt en afvoer resterende buffer aan de rand van het monster.
  8. Tweeze de tape bevestigd aan het venster om het venster maximaal uit de vloeistof zorgvuldig. Ophalen ramen die off van de band komen door toepassing van een kleine hoeveelheid van de leidingen / sucrose om hen te drijven en dan ze op te pakken met het omgekeerde pincet.
  9. Zorgvuldig (zonder het raam zelf) en grondig pleisteren overtollige PIPES / sucrose uit de rand van het venster met een Kimwipe. Ook bekladden de rug ingesprongen gebied met behulp van een afgeronde plooi van een Kimwipe.
    Opmerking: Het doel is om zo weinig kristallisatie van zouten of buffers op het oppervlak van het scherm mogelijk.
  10. Plaats het raam op de grid mat. Zorg ervoor dat het venster niet wordt plat op de grid mat, maar gestut op een rand (met behulp van de ruggen van de grid mat) en zo weinig van het net te rakenmat mogelijk. Laat het raam droog.

4. Steekproef Montage en Imaging

  1. Zodra het monster droog is, controleert de aanwezigheid van cellen op de ramen met behulp van een lichtmicroscoop. Voer deze controle, voor de voorbereiding van de monsters voor vervoer naar een synchrotron.
  2. Verpak de ramen voor het transport naar de synchrotron beamline hosten van uw experiment. Voorzichtig aanbrengen ramen met tape aan twee zijden een glasplaatje, dan brengt het glaasje met tape aan de onderkant van een plastic petrischaal. Tape de petrischaal dicht.
    OPMERKING: Voorafgaand aan dit punt, deze stappen kunnen worden uitgevoerd in elke typische lab uitgevoerd. De volgende stappen kunnen het best worden gedaan op een synchrotron beamline.
  3. Verwijder de tape van het raam voorzichtig met een pincet. Gebruik nagellak, in een dunne gelijkmatige laag aan de rand van het venster, de ramen bevestigen aan een aluminium houder door de bundellijn medewerkers synchrotron.
  4. Plaats de aluminium houder ineen kinematische monteren, en plaats het in de juiste positie in de X-ray microscoop. Monteer het monster op een console aan te sluiten op gemotoriseerde podia, binnen de steekproef kamer bij de beamline.
  5. Nadat het monster röntgenmicroscoop instrument gebied (een hok gemaakt van met lood gevulde muren), het instellen van de scan te verlaten. Met bundellijn-specifieke software, kiest het juiste gebied van het monster te scannen, terwijl het bekijken van de positie van de röntgenbundel op het monster met een camera uitgerust met een video dradenkruis en pre uitgelijnd met een stroomafwaartse scintillator camera.
  6. Kies de juiste resolutie voor het monster, op basis van een schatting van de omvang van de kleinste kenmerk van belang. Voor beeldvorming van enkele zoogdiercellen (~ 20-40 micrometer in grootte), gebruik dan een resolutie van 0,25-0,5 urn. Voor beeldvorming gebied van weefsels en onderscheiden cellagen van elkaar, gebruik een oplossing van 2-20 urn.
  7. Kies de juiste verblijftijd voor de steekproef, gebaseerd op een schatting van de hoeveelheid van de ontmoetingal van belang aanwezig is. Voor een snel overzicht scan, of wanneer grote hoeveelheden metalen aanwezig zijn, gebruik dan vlieg scans met verblijftijden van 30-300 msec per pixel. Als weinig materiaal aanwezig is, of om metalen van lage relatieve overvloed te meten, gebruiken stap scans met verblijftijden van 1-2 sec per pixel.
  8. Programmeren van de scans in de beamline-specifieke software. Verwerven van een rasterafbeelding-scan. Werken samen met de beamline medewerkers om de gegevens met software die de karakteristieke energie pieken zal voor elke element analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het vermogen van X-stralen fluorescentie beeldvorming om informatie over biologische monsters is afhankelijk van deze monsters wordt bereid zodanig dat ze robuust stralingsschade op de tijdschaal van het experiment, en toch hun chemische en structurele karakteristieken goed behouden. Bij bekijken van de resultaten van een monster dat is bereid zoals hierboven is beschreven en afgebeeld, is het mogelijk dat er variatie in de onderhavige elementen - aangeeft dat fixatie behouden deze aspecten van de cel (figuur 1).

Omgekeerd kijken maar een voorbeeld waar dit proces verliep niet goed en de buffer aanwezig tijdens het drogen blijft uitgebreide kristalvorming van deze moleculen veroorzaakt structurele schade aan de cellen en ook interfereert met het verzamelen van de röntgenfluorescentie spectra ( Figuur 2).

Deze beelden worden gegenereerd door per-pixel fitting van de röntgenfluorescentie spectrum op elk punt in het beeld. Dit betekent dat elk spectrum, die bij ieder pixel, is apart geanalyseerd. Bij het ​​bekijken van de panelen in deze beelden gegenereerd uit de ingebouwde gegevens, de waarde die aan elk punt in het beeld is het geïntegreerde som van een Gauss voor de karakteristieke emissie van een bepaald element (bijvoorbeeld ijzer) zo goed past bij de röntgenfluorescentie spectrum verzameld op dat punt. Bijvoorbeeld, één pixel in het beeld heeft een waarde (getal) voor ijzer, die de som van het oppervlak onder een Gauss-kromme bij de karakteristieke emissie energie voor ijzer, dat past en tweede analyse van het emissiespectrum van dit punt op het monster. De data wordt weergegeven drempelwaarden waarboven elk beeld (max en min) die de hoge en lage uiteinde van de kleur-tafel (onderaan elke afbeelding) om specifieke waarden in het beeld toe.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 1. Röntgenfluorescentie beeld van een menselijk SH-SY5Y Cell. Elk paneel in deze afbeelding toont verschillende informatie over dezelfde cellen. Het eerste paneel, gelabeld DIC, de optische differentieel interferentie contrast microfoto van de cellen. De volgende panelen, van links naar rechts, zijn de fosfor (P), zwavel (S), ijzer (Fe), en zink (Zn) beelden van dezelfde cellen waaruit hun verdeling over het oppervlak van de cel. De schaal bar getoond is 20 urn. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Röntgenfluorescentie Afbeelding van een Rat B103 Cell, bereid met slechte of onvoldoende verwijdering van buffers. Twee cellen zijn zichtbaar in de fosfor (P) paneel,en zijn licht zichtbaar in de ijzer (Fe) en zink (Zn) panelen. De aanwezigheid van gekristalliseerd buffer, zichtbaar als een uitstrijkje van deeltjes door het midden van het beeld, verduistert meeste informatie. De schaal bar getoond is 20 urn. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

X-stralen fluorescentie beeldvorming is bruikbaar in vele gebieden, met inbegrip van aardwetenschappen, materiaalkunde, en chemische biologie 26-34. Vooruitgang in synchrotron X-stralen, en de nadruk hebben zeer hoge intensiteit balken geproduceerd. Gerichte röntgenstralen voldoende om de endogene metalen in cellen bestaan ​​nu wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige silicium drift detector technologie. En bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen op dit gebied maakt.

Toch is de studie van biologische materialen met X-stralen fluorescentie microscopie geeft ook speciale uitdagingen met andere materialen, omdat ze gehydrateerd. Aan straling schade te voorkomen, idealiter de monsters zouden worden in het glasvocht ijs bevroren tijdens de meting. Echter, chemische fixatie en drogen aan de lucht zijn veel meer toegankelijk voor de beginner, en kan geschikt als de metalenplaats inert zijn gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen.

Bij de behandeling van substraten voor aanhanger cel XFM studies, een ideale ondergrond moet aan de volgende fundamentele eisen te voldoen: 1) ondersteunen robuuste celgroei zonder afwisselend normale proliferatieve en fenotypische celgroei, 2) mag niet röntgenfluorescentieanalyse dat overlapt met die van elementen van belang, 3) zijn optisch transparant voor celgroei beoordeling op grond van lichtmicroscoop voor XFM, en 4) in staat zijn om enige fysieke en chemische manipulatie weerstaan ​​tijdens het kweken en de daaropvolgende fixatie. Historisch verschillende substraten, variërend van dunne polycarbonaat folies / films 35-37, formvar gecoate goud transmissie elektronenmicroscopie (TEM) roosters 38-42 en siliciumnitride ramen 5,17,43-46, zijn gebruikt om zoogdiercellen groeiens en voor röntgenfluorescentie beeldvorming. In vergelijking tussen de huidige en potentiële substraten voor beeldvorming hechtende zoogdiercellen XFM, siliciumnitride membraan (Si 3 N 4) vensters meest geschikt vanwege hun lage fluorescentie achtergrond en relatief eenvoudige elementaire samenstelling 4-6,47,48. Daarnaast Si 3 N ondersteunen 4 ramen robuuste celaanhechting en proliferatie. Vergeleken met andere gebruikelijke substraten zoals TEM roosters, Si 3N 4 ramen hebben ook een veel groter ononderbroken opnamegebied hetgeen een bijzonder voordeel wanneer deze vensters worden gebruikt voor röntgenstralen.

Si 3 N 4 vensters zijn commercieel verkrijgbaar bij een beperkt aantal verkopers. Werken met siliciumnitride ramen is een verworven vaardigheid. De ramen zijn erg kwetsbaar, en vereisen veel aandacht aan elke torsiekrachten niet maken, terwijl ze te hanteren die hen zou kunnen breken, of om ze te laten vallen. Handling hen door de randen met behulp van reverse pincet is een populaire aanpak. De meeste ramen hebben diktes van 30 nm tot 500 nm en een breedte van 1 x 1 mm tot 5 x 5 mm. In het algemeen, hoe dikker het membraan, de robuustere ze allerlei omgaan met stress. Echter, met een grotere dikte en minder optische transparantie, zullen de achtergrond emissie uit het monster te verhogen. De 200 nm dikke membranen zijn zeer geschikt. Ze hebben een minimale invloed op de meting, maar stevig genoeg te verwerken zonder veel breuk.

Hoewel veel celtypen getest kan aanvankelijk bevestigen en stevig groeien op de steriele Si 3N 4 ramen cellen gekweekt van siliciumnitride ramen zijn in het algemeen veel gemakkelijker dan geschud cellen traditionele celkweekplaten. Ze raken gemakkelijk los, geaggregeerde of naar boven afgerond, zelfs tijdens routine media verandert. Vonden we voorgewassen ramen werd vaak meer hydrofiele; cellen hechten beter en had minder chance om samen te aggregeren. De stappen in het protocol hierboven beschreven bakenen een zachte wassen benadering houden de cellen op het raam. Enkele andere maatregelen die kunnen worden genomen zijn onder andere coating de ramen met poly-lysine, of laminin, net zoals men zou kunnen jas een dekglaasje.

Een ander aspect van deze werkwijze dat het succes of falen van een bepaald experiment kan worden is agitatie van de monsters. Bij het observeren van de groei van cellen 'op plastic cultuur schepen, doet het normale bereik van onrust als gevolg van pipetteren en plaat vervoer niet te veel schade te veroorzaken. Echter, voor de cellen gekweekt op de silicium nitride ramen, extra zorg tijdens wisselen van materiaal en plaat transport nodig is. Voor een gemakkelijk opgewonden cellen zoals muis fibroblast cellen NIH / 3T3, de kweekplaten met vensters moeten zorgvuldig worden behandeld. Ze moeten worden zorgvuldig genomen uit de couveuse en voorzichtig ingesteld op de microscoop podium of kast oppervlak. Niet per se elke kleine physical schok zal verstoren de cellen, maar het risico van cel onthechting verhoogt zonder extra zorg. Bovendien kunnen verschillende charges van foetaal runderserum en siliciumnitride vensters bepaalde effecten op de hechting van cellen op het raam. Sommige bronnen van serum of batches van ramen lijken gemakkelijker om mee te werken, dat wil zeggen, zonder te zien te veel verstoring door soortgelijke zorg. Dus, kan wat trial and error voor de cellijn van belang worden geadviseerd.

Ontwikkelingen in cryogene stappen voor röntgenfluorescentie microzuilen, evenals nieuwe onderzoek bij de bereiding van bevroren gehydrateerde biologische monsters, is het waarschijnlijk dat de monstervoorbereiding in de toekomst veel meer omvatten bevroren gehydrateerd monsters. Veel van dezelfde uitdagingen werken met siliciumnitride ramen en behouden celadhesie bestaan ​​er ook. Maar toch, het beheersen van deze techniek blijft een zeer goede plek om te beginnen bij het ontwikkelen van vaardigheden voordat cryopreservatie, eennd vele malen, is een uitermate geschikt middel om de afbeelding monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Chemie X-ray fluorescentie beeldvorming metalen chemische biologie microscopie synchrotron
Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter