Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

X-ray fluorescenza consente sia l'identità e la quantità di elementi presenti in un campione da spazialmente risolto. Incidente raggi X, di una energia selezionata per essere maggiore dell'energia dell'elemento più pesante di interesse vincolante elettroni, superare l'energia di legame degli elettroni interno-shell al nucleo 1. Questo crea un 'buco' nel guscio di elettroni. Come elettroni ad alta energia cadono in questi fori, raggi X fluorescenti sono emessi cui lunghezza d'onda dipende dalla separazione dell'energia di tali orbitali. Poiché la spaziatura energia degli orbitali è caratteristica di un dato elemento, l'emissione di fluorescenza a raggi X ha anche lunghezze d'onda caratteristiche, dipendenti sull'elemento. È questa emissione alla lunghezza d'onda caratteristica che permette l'identificazione degli elementi presenti. Calibrazione dell'intensità di fluorescenza permette quantificazione degli elementi presenti.

Fluorescenza a raggi X microscopy (XFM) è diventato sempre più utilizzato, in parte a causa dello sviluppo di fonti di sincrotrone a raggi X molto brillanti, come quelle in Primavera-8 in Giappone, l'europeo di radiazione di sincrotrone (ESRF) in Francia, e l'Advanced Photon Source ( APS) negli Stati Uniti 2. Queste fonti forniscono altissima intensità fasci di raggi X. Allo stesso tempo, il miglioramento ottica a raggi X, come la tecnologia zone plate, permesso la messa a fuoco di questi fasci a macchie sub-micron, anche se piuttosto inefficiente 3. Con molto fasci ad alta intensità, anche una quantità relativamente piccola di luce che può essere messo a fuoco è sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule, producendo segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore. Pertanto, lo studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questa tecnica 4-10.

Ci sono molti fattori critici da considerare durante la appmentire XFM per indagare la distribuzione elementare e la quantificazione di cellule di mammifero in coltura o altri campioni biologici. In primo luogo, il campione deve essere mantenuto integro, sia strutturalmente e rispetto alla sua composizione elementare, affinché la misura sia significativo. In secondo luogo, il campione deve essere conservato in qualche modo in modo che sia resistente al danno di radiazione che può essere causato da un fascio di raggi X focalizzato. Un modo che un campione può soddisfare entrambi i criteri contemporaneamente deve essere rapidamente congelati in un vetrosa, ghiaccio amorfo 11,12. Congelamento rapido è spesso raggiunto attraverso varie tecniche di crioconservazione, come tuffo il congelamento o alta pressione congelamento 13-16. E 'generalmente accettato che la crioconservazione conserva architettura cellulare complessiva e composizioni chimiche in campioni biologici il più vicino possibile allo stato nativo. Fissaggio chimico, d'altra parte, a causa della penetrazione lenta e selettiva di fissativi in ​​cellule e tessuti come well le successive variazioni di permeabilità della membrana, possono consentire vari ioni cellulari soprattutto gli ioni diffusibili come Cl, Ca e K per essere colati, perse o ricollocate, rendendo così investigazione di questi elementi non ottimali 17-19. Nonostante il chiaro vantaggio di crio-over fissaggio fissaggio chimica in generale, per le cellule di mammifero aderenti in particolare, crioconservazione ha varie limitazioni 20-23. La più ovvia è che non tutti i laboratori di ricerca ha un facile accesso agli strumenti di crioconservazione. La maggior parte dei congelatori alta pressione correnti o anche immergono congelatori sono costosi e di proprietà solo da un sottoinsieme di strutture cryo, che può essere lontano da dove vengono incubate cellule. Il vantaggio di crioconservazione potrebbe essere scambiato per lo svantaggio di stress viaggi collocato sulle cellule. Così, mentre crioconservazione è sicuramente il modo più rigoroso per conservare campioni per analisi a raggi X di fluorescenza, non è certamente la più accessibile a tutti i ricercatori in tutte le circostanze;né è sempre essenziale - se i metalli di interesse sono strettamente legati alle macromolecole fissabili, e la risoluzione con cui viene ripreso il campione è superiore al danneggiamento del ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l'essiccazione. Memore dei caveat 24, fissaggio chimico e asciugatura può essere una scelta adatta.

Altri fattori in un esperimento di imaging di fluorescenza a raggi X di successo includono l'analisi corretta. X-ray imaging di fluorescenza è fondamentalmente spettroscopia di emissione di fluorescenza di raggi X in combinazione con raster-scanning per fornire la risoluzione spaziale. Gli spettri di emissione di fluorescenza a raggi X raccolti contengono una combinazione di sovrapposizione picchi di emissione, di fondo, e le cime di scattering elastico e anelastico del fascio incidente. Software che consente la de-convoluzione di questi contributi, e il montaggio dei picchi di emissione, è stato uno sviluppo critico per questo campo 25. Inoltre, lo sviluppo e dist commercialeribution di norme a film sottile di composizione nota, usata per calibrare intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di materiale, è stato molto importante anche.

Questo protocollo fornisce una descrizione della preparazione di cellule aderenti da fissazione chimica ed essiccamento all'aria. Un passo fondamentale in questo processo è la crescita delle cellule alle finestre di nitruro di silicio, che spesso non aderiscono bene, rendendo dolce risciacquo in una particolare chiave di modo di successo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione di strumenti, Substrati, Culture Media e Piatti

  1. Gestione delle finestre nitruro di silicio (Si 3 N 4).
    1. Aprire la capsula leggermente spremitura un'estremità contenente la finestra in modo tale da non comprimere finestra stessa, ruotando l'altra estremità della capsula con l'altra mano.
    2. Controllare un paio di inversione, pinzette dalla punta sottile sotto stereomicroscopio per assicurarsi che non ci siano adesivi, lacune o curve sulla punta. In caso contrario, le finestre possono essere rotti dalle pinzette o il distacco di loro durante le fasi successive.
    3. Rimuovere la finestra dalla capsula afferrando attentamente il telaio della finestra con una pinzetta, mentre delicatamente comprimendo la capsula in prossimità dell'estremità aperta esercitando una pressione in una direzione in modo da rendere la capsula più ampio in cui i bordi della finestra devono venire fuori.
  2. Finestra pre-lavaggio (optional).
    1. Se lo si desidera, le finestre di prelavaggio per immersione delicatamentein acqua distillata per 5 sec, seguito da 2 minuti di lavaggio in 70% di etanolo e 2 min lavaggio in 100% di etanolo.
  3. L'apposizione e sterilizzazione finestre sul piatto cultura.
    1. Per fissare le finestre, impostare la finestra con lato piatto fino al fondo del piatto di coltura, posizionare un pezzo di nastro su un vetrino pulito. Tagliare su una striscia di quarto di pollice giù per il lato lungo del nastro. Prendete una fetta di nastro largo del lato corto (a ⅛ "da ¾") con una lama di rasoio pulito.
    2. Utilizzare pinzette per applicare la fetta di nastro al bordo della griglia o finestra. Usare abbastanza per aderire saldamente senza coprire l'apertura della finestra stessa. Manipolando il nastro aderito con pinzette, impostare il finestrino sul fondo del piatto di coltura. Utilizzare la punta delle pinzette di aderire il nastro al fondo del piatto cultura saldamente.
    3. Applicare un'altra striscia di nastro per l'altro bordo e rispettare questo al fondo saldamente con la punta delle pinzette.
    4. Una volta che tutte le finestre sonoregistrato, sterilizzare finestre in piastre di coltura con raggi ultravioletti (UV). Realizzare questo mettendo il piatto sotto la lampada UV in una cappa a flusso laminare per circa 1 ora.
    5. (Facoltativo) Se le finestre devono essere pre-rivestito con poli-lisina, farlo seguente finestra di sterilizzazione. Rivestire la finestra con 10 ml di soluzione sterile 0,01% poli-L-lisina per 1 ora a 37 ° C incubatore, e poi sciacquare la soluzione rimanente via con il mezzo di coltura.
  4. Preparare buffer per lavaggio finale prima XFM.
    1. Preparare sia un Tris-glucosio o piperazine- N, N '-bis (acido etansolfonico) (TUBI) -sucrose tampone privo di eventuali tracce di metalli con osmolalità e pH pari al tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS) senza calcio e magnesio. Utilizzare uno di questi buffer per risciacquare celle dopo cellule vengono fissate chimicamente.
      1. Per rendere la soluzione Tris-glucosio (Tris 10 mM, glucosio 260 mM, 9 mM acido acetico,) aggiungere 1,4 g di glucosio, 36 mg di base Tris e16 ml di acido acetico e 20 ml di acqua ultrapura. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Non è necessaria alcuna regolazione del pH. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana.
      2. Per rendere i TUBI-saccarosio (20 TUBI mM, saccarosio 200 mm) aggiungono 0,18 g di tubi e 2,0 g di saccarosio a 20 ml di acqua ultrapura e regolare il pH a 7,4 con piccole quantità di acido acetico concentrato. Poi, regolare il volume finale di 30 ml con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente fino a una settimana.
        NOTA: La ragione per evitare di utilizzare PBS nel risciacquo finale è che le concentrazioni di fosfato, cloruro e potassio in PBS sono così alti che può interferire con XFM se non viene completamente rimosso prima essiccazione all'aria.
  5. Preparare buffer per la placcatura cellulare.
    1. Preparare o estrarre tutti i media, come ad esempio RPMI medio 1640, 1x soluzione tripsina-EDTA, D-PBS, e tutti gli altri reagenti come necessario per la particolare linea cellulare aderente come normalmente fatto per passaging le cellule aderenti ointeressi f, e riscaldare a 37 ° C.

2. placcatura di Celle

  1. Per piatto di coltura sterilizzato contenente le finestre, nella cappa a flusso laminare, aggiungere delicatamente supporti (10 ml per un piatto di coltura 100 mm), lungo il lato del piatto cultura con esso inclinato ad un angolo. Evitare di creare tensione superficiale inutili o cadere supporto direttamente sulla superficie delle finestre nitruro di silicio. Come si aggiunge supporto, lentamente alleviare l'angolo di inclinazione per rivestire la griglia e la finestra con i media.
  2. Preparare la linea cellulare aderenti di interesse appropriato, trypsinizing o raschiare le cellule fuori delle piastre come al solito per passaging la linea cellulare. Eseguire una conta cellulare, o altra preparazione necessaria prima di applicare le cellule alla piastra fresca.
  3. Aggiungere cellule al piatto cultura con finestre ad una densità cellulare che è necessaria per raggiungere tipicamente il 50% -70% di confluenza entro 24-72 ore, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica. Osservare la crescita delle cellule occasionalmente, utilizzando un microscopio ottico invertito, fino alla densità cellulare desiderata (di solito 50% -70% di confluenza) è raggiunto.

3. Fissazione delle cellule

  1. Preparare freschi 4% paraformaldeide in D-PBS diluendo uno stock acquistato (ad esempio 25% paraformaldeide) e regolando il pH a 7,4 con acido acetico (per evitare l'aggiunta di eccesso di sodio al campione).
  2. Quando le cellule sono state coltivate come desiderato, e le macchie vitali (come Hoescht) sono stati applicati e ripreso, rimuovere il supporto aspirando delicatamente, inclinando il piatto in un angolo di 45 ° con una mano, e l'aspirazione con una pipetta con l'altra mano .
    NOTA: Invece di pipettaggio impiegato mezzi, l'alternativa è quella di scegliere la finestra in alto, immergere la finestra in microprovette con D-PBS due volte e poi metterlo in una nuova imbarcazione cultura con soluzioni fissativo per 20 minuti seguito da 2 tempi di lavaggio PBS per rimuovere i residui fissativi. Se questo viene scelto, andare directly al punto 3.5.
  3. Lavare il piatto delicatamente con D-PBS e sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo delicatamente il fresco 4% PFA / PBS tenendo il piatto con un angolo di 45 °, pipettaggio verso il lato del piatto, e lentamente rilassante l'angolo di inclinazione per consentire la soluzione fissativa per coprire le finestre. Conservare le celle coperte con il fissativo per 20 minuti a RT.
  4. Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata, ancora come sopra, inclinando leggermente il piatto ed aspirando a mano.
  5. Sostituire il liquido rimosso aggiungendo delicatamente alcuni dei tubi / soluzione di saccarosio, con il metodo di inclinazione e pipettaggio descritto nel passaggio 3.3.
  6. Ripetere i punti 3.4 e 3.5.
  7. Preparare i materiali per l'essiccazione.
    1. Raccogliere asciugamani privo di lanugine, come Kimwipes, e tirare uno fuori dalla scatola, quindi è a portata di mano molto rapidamente e facilmente.
    2. Preparare un luogo non-pulita e in piano per impostare la finestra per asciugare. Impostare su una stuoia griglia gomma del tipo usato in microscopia elettronica, che ha così crestela finestra può essere appoggiato su un'estremità mentre si asciuga. Ciò manterrà la finestra di rimanere bloccati alla superficie di essiccazione come si asciuga, e drenare qualsiasi buffer residuo al bordo del campione.
  8. Tweeze cautela il nastro collegata alla finestra per tenere la finestra fuori dal liquido. Recuperare le finestre che si staccano del nastro, applicando una piccola quantità di TUBI / saccarosio per farli galleggiare e poi raccogliere con le pinzette inversa.
  9. Cautela (senza toccare la finestra stessa) e accuratamente daub qualsiasi eccesso TUBI / saccarosio dal bordo della finestra con un Kimwipe. Daub Anche la parte posteriore zona frastagliata con una piega arrotondata di un Kimwipe.
    NOTA: L'obiettivo è di avere meno cristallizzazione di sali o buffer sulla superficie della finestra possibile.
  10. Collocare la finestra sul tappeto griglia. Assicurarsi che la finestra non è disteso sul tappeto griglia, ma appoggiato su un bordo (con le creste del tappeto griglia) e toccando il meno della grigliamat possibile. Lasciare la finestra di asciutto.

4. Montaggio del campione e Imaging

  1. Una volta che il campione è essiccato, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico. Eseguire questa verifica, prima di preparare i campioni per il trasporto di un sincrotrone.
  2. Pacchetto le finestre per il trasporto alla linea di luce di sincrotrone di hosting l'esperimento. Apporre delicatamente le finestre con nastro su due lati di un vetrino, poi fissare il vetrino con nastro sul fondo di una piastra di Petri di plastica. Nastro il piatto chiusa Petri.
    NOTA: Prima di questo punto, la procedura può essere eseguita in qualsiasi laboratorio tipico. Le seguenti operazioni dovrebbero essere meglio fatto a una linea di luce di sincrotrone.
  3. Rimuovere il nastro dalla finestra delicatamente con una pinzetta. Utilizzare smalto, in un sottile strato uniforme lungo il bordo della finestra, per fissare le finestre al possessore di alluminio fornito dai collaboratori beamline del sincrotrone.
  4. Inserire il supporto di alluminio inuna cinematica di montaggio, e poi posto in posizione al microscopio a raggi X. Montare il campione su una staffa di collegamento alla fasi motorizzati, all'interno della camera campione alla linea di luce.
  5. Dopo essere usciti dalla radiografia zona strumento microscopio campione (una gabbia fatta di muri di piombo pieno), impostare la scansione. Utilizzando il software specifico linea di luce, selezionare la zona appropriata del campione da esaminare, mentre si visualizza la posizione del fascio di raggi X sul campione utilizzando una macchina fotografica dotata di un video mirino e pre-allineata con una fotocamera scintillatore valle.
  6. Scegliere la risoluzione appropriata per il campione, sulla base di una stima della dimensione della funzione più piccolo di interesse. Per l'imaging singole cellule di mammifero (~ 20-40 micron di dimensione), utilizzare una risoluzione di 0,25-0,5 micron. Per le zone di tessuti di imaging, e distinguendo strati cellulari tra loro, utilizzare una risoluzione di 2-20 micron.
  7. Scegliere il tempo di permanenza adeguato per il campione, in base alla stima della quantità del riunitoal di interesse presenti. Per una scansione rapida panoramica, o se sono presenti elevate quantità di metalli, utilizzare scansioni Vola con tempi di sosta di 30-300 msec per pixel. Se poco materiale è presente, o per misurare i metalli di bassa abbondanza relativa, utilizzare scansioni passo con tempi di sosta di 1-2 sec per pixel.
  8. Programmare le scansioni nel software specifico per linea di luce. Acquisire un'immagine raster-scan. Lavorare insieme con i collaboratori linea di luce per analizzare i dati con il software che identificheranno i caratteristici picchi di energia per ogni elemento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La capacità dell'imaging fluorescenza a raggi X per fornire informazioni sui campioni biologici è subordinato questi campioni essere preparati in modo tale che essi sono robusti alle radiazioni sulla scala temporale dell'esperimento, e tuttavia la loro caratteristiche chimiche e strutturali sono ben conservato. Nella visualizzazione del risultato di un campione che è stato preparato come sopra descritto e illustrato, è possibile vedere che c'è variazione degli elementi presenti - indica che la fissazione conservato questi aspetti della cella (Figura 1).

Viceversa, guardando invece un campione in cui questo processo non è andato bene, e il buffer rimane presente durante l'essiccazione, vasta formazione di cristalli dalle molecole presenti crea danni strutturali delle cellule e anche interferisce con la raccolta degli spettri fluorescenza a raggi X ( Figura 2).

Queste immagini sono generati da raccordo per-pixel dello spettro di fluorescenza a raggi X in ogni punto dell'immagine. Ciò significa che ogni spettro, raccolti in ogni pixel, è stato analizzato singolarmente. Quando si visualizzano i pannelli in queste immagini generate dai dati a muro, il valore assegnato a ciascun punto dell'immagine è la somma integrata di una gaussiana per l'emissione caratteristica di un dato elemento (ad esempio, ferro) come meglio si adatta la fluorescenza a raggi X Spettro raccolto in quel punto. Per esempio, un singolo pixel nell'immagine ha un valore (numero) per il ferro, che è la somma dell'area sotto la curva gaussiana alla emissione energia caratteristico per il ferro, che si adatta e modelli dati per lo spettro di emissione di quel punto sul campione. I dati vengono visualizzati con valori di soglia sopra ogni immagine (max e min) che assegnano l'alta e bassa estremità del colore-tavolo (in fondo di ogni immagine) a valori specifici all'interno dell'immagine.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figura 1. X-ray Fluorescence Immagine di una cellula umana SH-SY5Y. Ogni pannello in questa immagine visualizza diverse informazioni sulle stesse cellule. Il primo pannello, etichettato DIC, è l'ottica interferenza differenziale contrasto micrografia delle cellule. I seguenti pannelli, da sinistra a destra, sono il fosforo (P), zolfo (S), ferro (Fe) e zinco (Zn) immagini delle stesse cellule, che mostrano la loro distribuzione sulla superficie della cellula. La barra di scala mostrata è di 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 2
Figura 2. X-ray Fluorescence immagine di una cella Rat B103, preparati con la rimozione scarsa o insufficiente di buffer. Due celle sono visibili in fosforo (P) del pannello,e sono leggermente visibile nel ferro (Fe) e zinco (Zn) pannelli. Tuttavia, la presenza di tampone cristallizzato, visibile come una macchia di particolato attraverso il centro dell'immagine, oscura maggior parte delle informazioni. La barra di scala mostrata è di 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

X-ray imaging di fluorescenza è utile in molti campi, tra cui geoscienze, scienza dei materiali e biologia chimica 26-34. Advances in raggi X di sincrotrone, e la loro messa a fuoco, hanno prodotto molto fasci ad alta intensità. Focused X-ray travi sufficiente per eccitare i metalli endogeni nelle cellule ora esistono, segnale che può essere misurata con la tecnologia attualmente disponibile rivelatore al silicio deriva produzione. E studio della biologia chimica di metalli nella cella è un'applicazione in particolare, che fa uso di molti dei recenti sviluppi in questo settore.

Tuttavia, lo studio dei materiali biologici utilizzando raggi X microscopia a fluorescenza presenta anche sfide particolari, rispetto ad altri materiali, perché sono idratati. Per evitare danni da radiazioni, idealmente i campioni saranno congelati in ghiaccio vitreo durante la misurazione. Tuttavia, la fissazione chimica e asciugatura ad aria sono molto più accessibili per i principianti, e può essere opportuno se i metallidi interesse sono inerti legato alle macromolecole risolvibili, e la risoluzione in cui verrà ripreso il campione è superiore al danno alla ultra-microstruttura che potrebbero verificarsi durante l'asciugatura.

Nel considerare substrati per cellulari aderenti studi XFM, un substrato ideale deve soddisfare i seguenti requisiti di base: 1) sostenere la crescita cellulare robusto senza alternanza normale crescita cellulare proliferativa e fenotipica, 2) non devono avere fluorescenza a raggi X che si sovrappone con quelli degli elementi di interesse, 3) è otticamente trasparente per la valutazione della crescita cellulare al microscopio luce prima XFM, e 4) in grado di resistere a qualsiasi manipolazione fisica e chimica durante la coltura e fissazione successiva. Storicamente, diversi substrati, che vanno da sottili pellicole in policarbonato / film 35-37, Formvar microscopia elettronica a trasmissione oro patinata (TEM) griglie 38-42 e nitruro di silicio finestre 5,17,43-46, sono stati utilizzati per far crescere cellule di mammiferos e usato per X-ray imaging di fluorescenza. Nel confronto fra i substrati esistenti e potenziali per l'imaging cellule di mammifero aderenti da XFM, membrana di nitruro di silicio (Si 3 N 4) le finestre sono più adatti a causa della loro bassa fluorescenza di fondo e relativamente semplice composizione elementare 4-6,47,48. Inoltre Si 3 N 4 finestre supportano adesione cellulare robusto e la proliferazione. Rispetto ad altri substrati comunemente usati come griglie TEM, Si 3 N 4 finestre hanno anche una zona molto più ampia ininterrotta di immagini che è un vantaggio particolare quando queste finestre vengono usate per tomografia a raggi X.

Si 3 N 4 finestre sono disponibili in commercio da un numero limitato di fornitori. Lavorare con le finestre nitruro di silicio è una capacità acquisita. Le finestre sono molto fragili, e richiedono molta attenzione per non creare eventuali forze di torsione durante la manipolazione di loro che li possa distruggere, o di farli cadere. Handlli ing per i bordi con una pinzetta inversa è un approccio popolare. La maggior parte delle finestre hanno spessori che vanno da 30 nm a 500 nm e una larghezza da 1 x 1 mm a 5 x 5 mm. In generale, lo spessore della membrana, il più robusto che sono a tutti i tipi di gestione dello stress. Tuttavia, con spessore maggiorato e trasparenza ottica meno, aumenteranno l'emissione sfondo dal campione. I 200 membrane spesse nm sono abbastanza ideale. Hanno un impatto minimo sulla valutazione, ma sono abbastanza robusto per essere gestito senza molto rotture.

Sebbene molti tipi cellulari testate può inizialmente attaccare e robusto crescere sulle sterili Si 3 N 4 finestre, le cellule cresciute su finestre di nitruro di silicio sono in generale molto più facilmente agitata di cellule su piastre di coltura cellulare tradizionali. Essi diventano facilmente staccati, aggregati o rastrellati anche durante i cambi di media di routine. Abbiamo trovato le finestre pre-lavati diventati spesso più idrofila; cellule collegare meglio e aveva meno chance di aggregare insieme. I passi descritti nel protocollo sopra delineano un approccio dolce lavaggio a mantenere le cellule sulla finestra. Alcuni altri passi che possono essere adottate comprendono il rivestimento le finestre con poli-lisina, o laminina, proprio come si potrebbe ricoprire una coprioggetto.

Un altro aspetto di questo metodo che può essere il successo o il fallimento di un dato esperimento è agitazione dei campioni. Osservando la crescita delle cellule 'in recipienti di coltura in plastica, la normale gamma di agitazione derivante da pipettaggio e trasporto piatto non sembra causare molti danni. Tuttavia, per le cellule coltivate sulle finestre nitruro di silicio, è necessaria molta attenzione durante il cambio dei media e il trasporto piatto. Per alcune cellule facilmente agitate come le cellule di fibroblasti di topo NIH / 3T3, le piastre di coltura contenenti finestre devono essere maneggiati con cura. Essi devono essere attentamente prese fuori dal termostato e delicatamente impostare sul palco microscopio o la superficie mobile. Non necessariamente ogni piccolo pscossa hysical disturberà le cellule, ma il rischio di distacco delle cellule aumenta, senza attenzione. Inoltre, diversi lotti di finestre e siero fetale bovino nitruro di silicio può avere certi effetti sul fissaggio delle cellule sulla finestra. Alcune fonti di siero o lotti di finestre sembrano più facile da lavorare, cioè, senza vedere troppo disturbo per la stessa cura. Così, alcuni tentativi ed errori per la linea cellulare di interesse possono essere informati.

Con gli sviluppi in fasi criogenici per raggi X micropali fluorescenza, nonché nuova ricerca nella preparazione di campioni biologici idrate congelati, è probabile che la preparazione del campione in futuro sarà molto più sempre includono campioni congelati idrati. Molte delle stesse sfide nel lavorare con le finestre nitruro di silicio, e mantenendo l'adesione cellulare esistono pure. Eppure, padroneggiare questa tecnica rimane un ottimo punto di partenza per lo sviluppo di competenze prima di tentare crioconservazione, unnd molte volte, è un modo perfettamente adatto a campioni di immagine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Chimica X-ray la fluorescenza l'imaging i metalli biologia chimica microscopia sincrotrone
Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter