Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

Røntgen fluorescens bilde tillater både identiteten og mengden av elementer som er tilstede i en prøve som skal romlig løst. Innfallende røntgenstråler, av en energi valgt til å være større enn elektron-bindingsenergien av den tyngste element av interesse, å overvinne bindingsenergien av det indre skall elektroner til kjernen 1. Dette skaper et "hull" i elektronskallet. Som høyere energi elektronene faller ned i disse hull, blir fluorescerende røntgenstråler utsendes hvis bølgelengde avhenger av energi separasjon av disse orbitaler. Siden avstanden mellom orbitaler energi er karakteristisk for et gitt element, har røntgen-fluorescens-emisjon også karakteristiske bølgelengder, avhengig av elementet. Det er denne emisjon ved en karakteristisk bølgelengde som tillater identifisering av de tilstedeværende elementer. Kalibrering av fluorescens-intensitet tillater kvantifisering av de tilstedeværende elementer.

X-ray fluorescens microscopy (XFM) har blitt stadig mer brukt, delvis på grunn av utviklingen av svært strålende X-ray synkrotron kilder, slik som de på Spring-8 i Japan, den europeiske Radiation Synchrotron Facility (ESRF) i Frankrike, og Advanced Photon Source ( APS) i USA to. Disse kildene gir svært høy intensitet X-ray bjelker. På samme tid, forbedringer i røntgen optikk, slik som soneplate teknologi, tillot fokusering av disse bjelker i sub-mikron flekker, riktignok ganske ineffektivt 3. Med svært høy intensitet bjelker, og med en relativt liten mengde lys som kan være fokusert er tilstrekkelig til å opphisse de endogene metaller i cellene, produsere signal som kan måles med tiden tilgjengelig detektorteknologi. Således studere den kjemiske biologi av metaller i cellen er en anvendelse i særdeleshet som gjør bruk av mange av de nyere utviklinger i denne teknikken 4-10.

Det er mange kritiske faktorer som skal vurderes mens appliggende XFM å undersøke de elementære distribusjon og kvantifisering av dyrkede pattedyrceller eller andre biologiske prøver. For det første må prøven som skal holdes intakt, både konstruksjonsmessig og med hensyn til sin grunnsammensetning, for måling skal være meningsfylt. For det andre må prøven også bli konservert på en eller annen måte slik at den er hardfør til skaden stråling som kan være forårsaket av en fokusert røntgenstråle. En måte at en prøve kan oppfylle begge disse kriteriene på en gang, er å bli hurtig frosset i et glassaktig, amorft, is 11,12. Rapid frysing oppnås ofte gjennom ulike nedfrysing teknikker som stupe frysing eller høytrykks frysing 13-16. Det er generelt akseptert at nedfrysing bevarer totale cellulære arkitektur og kjemiske sammensetninger i biologiske prøver så nær naturlig tilstand som mulig. Kjemisk fiksering, på den annen side, på grunn av den langsomme og selektiv gjennomtrengning av bindemiddel inn i celler og vev som well som senere endringer i membran permeabilitet, kan tillate ulike cellulære ioner spesielt bærerdiffunderbare ioner som Cl, Ca og K for å bli utvasket, tapte eller flyttet, og dermed gjengivelse etterforskning av disse elementene suboptimale 17-19. Til tross for den klare fordelen av kryo-fiksering i løpet av kjemisk fiksering generelt, for adherente pattedyrceller i særdeleshet, har nedfrysing forskjellige begrensninger 20-23. Den mest åpenbare er at ikke alle forskningslaboratorium har lett tilgang til nedfrysing instrumenter. De fleste nåværende høytrykks frysere eller styrter frysere er kostbare og bare eies av en undergruppe av kryo anlegg, som kan være langt fra der cellene inkuberes. Nytten av nedfrysing kan bli omsatt for den ulempe at de for stress plassert på cellene. Således, mens nedfrysing er sikkert den mest grundige måten å bevare prøver for X-ray fluorescens analyse, er det absolutt ikke det mest tilgjengelige for alle forskere under alle omstendigheter;det er heller ikke alltid nødvendig - hvis metallene av interesse er tett bundet til an å fikse makromolekyler, og oppløsningen som utvalget skal avbildes er større enn skadene på ultra-mikrostruktur som kan oppstå under tørking. Oppmerksom på de begrensningene 24, kan kjemisk fiksering og tørking være et passende valg.

Andre faktorer i en vellykket X-ray fluorescens bildebehandling eksperiment inkluderer riktig analyse. X-ray fluorescens bildebehandling er fundamentalt X-ray fluorescens emisjonsspektrometrisk kombinert med raster-skanning for å gi romlig oppløsning. X-ray fluorescens utslipps spektra innsamlet inneholde en kombinasjon av overlappende utslipps topper, bakgrunn og de elastiske og uelastisk spredning toppene i innfallende strålen. Programvare som gjør at de-konvolusjon av disse bidragene, og montering av utslipps topper, har vært en kritisk utvikling av dette feltet 25. Også, utvikling og kommersiell distribution av tynnfilm standarder med kjent sammensetning, som brukes til å kalibrere fluorescens intensitet i forhold til materialmengden, har også vært svært viktig.

Denne protokollen gir en beskrivelse av fremstillingen av adherente celler ved kjemisk fiksering og lufttørking. Et viktig steg i denne prosessen er veksten av cellene på silisiumnitridpartiklene vinduer, som ofte ikke holder seg godt, noe som gjør skånsom skylling i en bestemt måte nøkkelen til suksess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøring av instrumenter, Underlag, Kultur Media og Retter

  1. Håndtering av Silisiumnitrid (Si 3 N 4) vinduer.
    1. Åpne kapselen lett ved å klemme den ene enden som inneholder vinduet på en slik måte at det ikke presse vinduet i seg selv, mens den roterer den andre enden av kapselen med den andre hånden.
    2. Sjekk et par revers, for å fin-tipped pinsett henhold stereo sørge for at det ikke er noen lim, hull eller svinger på spissen. Ellers kan vinduene bli brutt av pinsett eller fly ut av dem i løpet av de påfølgende trinn.
    3. Ta ut vinduet fra kapselen ved forsiktig å ta tak i rammen av vinduet med pinsett, mens forsiktig klemme kapselen i nærheten av den åpne ende påføring av trykk i en retning, slik som å gjøre kapselen bredere hvor kantene på vinduet trenger for å komme ut.
  2. Vindu forvask (valgfritt).
    1. Dersom det er ønskelig, pre-wash vinduer ved forsiktig dyppe demi destillert vann i 5 sekunder, fulgt av 2 min vask i 70% etanol og vask 2 min i 100% etanol.
  3. Anbringelse og sterilisering vinduer på kulturen fatet.
    1. Å feste vinduene, sette vinduet med flate siden opp på bunnen av kulturen fatet, legg et stykke tape på et rent glass lysbilde. Skjær ca en kvart tomme stripe nedover langsiden av båndet. Ta en bit av tape av den korte siden (på ⅛ "med ¾") med en ren barberblad.
    2. Bruk pinsett til å bruke skive tape til kanten av rutenettet eller vindu. Bruk nok til å sikkert følge det uten å dekke vindusåpningen selv. Manipulere levd tape med pinsett, sette vinduet ned på bunnen av kulturen fatet. Med tuppen av en pinsett til å følge båndet til bunnen av kulturskålen fast.
    3. Påfør en annen tape stripe til den andre kanten og følge denne til bunnen fast med tuppen av pinsett.
    4. Når alle vinduer erteipet, sterilisere vinduer i kultur retter med ultrafiolett (UV) stråling. Oppnå dette ved å plassere fatet under UV-lampe i en laminær strømningshette i ca. 1 time.
    5. (Valgfritt) Hvis vinduene er å være pre-belagt med poly-lysin, gjør det følgende vindu sterilisering. Coat vinduet med 10 ul steril 0,01% poly-L-lysin-løsning i 1 time i et 37 ° C inkubator og deretter skylle den resterende oppløsning av med kulturmedier.
  4. Forberede buffere for siste vask før XFM.
    1. Forbered enten en Tris-glukose eller piperazin-N, N'-bis (etansulfonsyre) (PIPES) buffer -sucrose fri for spormetaller med osmolaliteten og pH tilsvarende Dulbeccos fosfatbuffersaltløsning (D-PBS) uten kalsium og magnesium. Bruk en av disse buffere for å skylle celler etter celler er kjemisk løst.
      1. For å gjøre Tris-glukoseløsning (10 mM Tris, 260 mM glukose, 9 mM eddiksyre) tilsett 1,4 g glukose, 36 mg Tris base og16 ul eddiksyre og 20 ml ultrarent vann. Juster deretter endelig volum til 30 ml med ultrarent vann. Ingen pH-justering er nødvendig. Oppbevar ved romtemperatur opp til en uke.
      2. For å gjøre PIPES-sukrose (20 mM PIPES, 200 mM sukrose) legg 0,18 g av rør og 2,0 g sukrose i 20 ml ultrarent vann, og justere pH til 7,4 med små mengder av konsentrert eddiksyre. Juster deretter endelig volum til 30 ml med ultrarent vann. Oppbevar ved romtemperatur opp til en uke.
        MERK: Grunnen for å unngå å bruke PBS i den endelige skylling er at konsentrasjonene av fosfat, klorid og kalium i PBS er så høy at det kan forstyrre XFM hvis det ikke blir fullstendig fjernet før lufttørking.
  5. Forberede buffere for celle plating.
    1. Forberede eller ta ut alle medier, som for eksempel RPMI medium 1640, 1x trypsin-EDTA løsning, D-PBS, og eventuelle andre reagenser som er nødvendige for den aktuelle tilhenger cellelinje som normalt ville bli gjort for passering de adherente celler of interesse, og varm dem til 37 ° C.

2. Plating av celler

  1. Til sterilisert kultur fatet inneholder vinduene, i laminær hette, tilsett medier (10 ml for en 100 mm kultur parabol), langs siden av kulturen fatet med det på skrå. Unngå å skape unødig overflatespenning eller slippe media direkte på overflaten av silikonnitrid vinduer. Som media er lagt til, sakte avlaste hellingsvinkelen å belegge rutenett og vindu med media.
  2. Forberede tilhenger cellelinje av interesse hensiktsmessig, trypsinizing eller skraping cellene off av platene som vanlig for passering cellelinjen. Utføre en hvilken som helst celletelling, eller andre preparat er nødvendig før påføring av cellene til friske plate.
  3. Legg celler i kulturskål med vinduer på en celletetthet som er nødvendig for å nå typisk 50% -70% konfluens i løpet av 24-72 timer, og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% karbondioksyd. Observer cellenes vekst og til, ved hjelp av et invertert mikroskop lys, inntil den ønskede celletetthet (vanligvis 50% -70% konfluens) er nådd.

3. Fiksering av celler

  1. Forbered frisk 4% paraformaldehyd i D-PBS ved å fortynne en kjøpt lager (slik som 25% paraformaldehyd) og justering av pH til 7,4 med eddiksyre (for å unngå tilsetning av overskudd av natrium i prøven).
  2. Når cellene har blitt dyrket som ønsket, og ingen vitale flekker (som Hoescht) er anvendt og avbildes, fjerne mediet ved forsiktig aspirasjon, vippe fatet i 45 ° vinkel med den ene hånden, og aspirere hånd pipette med den andre .
    MERK: I stedet for pipettering brukt media, er et alternativ å plukke vinduet opp, dypp vinduet inn mikrosentrifugerør med D-PBS to ganger og deretter plassere det inn i en ny kultur fartøy med festing løsninger for 20 min etterfulgt av to ganger med PBS vask for å fjerne de gjenværende bindemiddel. Hvis dette er valgt, gå directly til trinn 3.5.
  3. Skyll fatet forsiktig med D-PBS og erstatte den fjernet væske umiddelbart ved å forsiktig legge den friske 4% PFA / PBS mens du holder den rett på en 45 ° vinkel, pipettering mot siden av fatet, og sakte avslappende hellingsvinkelen til å tillate fiksativ løsning for å dekke vinduene. Holde cellene dekket med fiksativ i 20 min ved RT.
  4. Fjern væsken ved forsiktig aspirasjon, igjen som ovenfor, vippe fatet litt og aspirere for hånd.
  5. Erstatte den fjernede væsken ved forsiktig tilsetning av noen av rørene / sukroseoppløsning, ved hjelp av skråstilling og pipettering metoden beskrevet i trinn 3.3.
  6. Gjenta trinn 3.4 og 3.5.
  7. Forberede materialet for tørking.
    1. Samle lofri håndklær som Kimwipes, og trekke en ut av boksen, så det er praktisk svært raskt og enkelt.
    2. Forberede en ren, ikke-nivå sted å sette vinduet for å tørke. Sett ut en gummi rutenett matte av den typen som brukes i elektronmikroskopi, som har rygger såvinduet kan bli støttet på den ene enden, mens den tørker. Dette vil holde vinduet fra å bli sittende fast på tørkeoverflaten når det tørker, og drenere eventuelle gjenværende buffer til kanten av prøven.
  8. Tweeze tapen forsiktig festet til vinduet for å holde vinduet opp ut av væsken. Hente vinduer som kommer ut av båndet ved å bruke en liten mengde av rør / sukrose for å få dem til å flyte og deretter plukke dem opp med omvendt pinsett.
  9. Forsiktig (uten å berøre vinduet selv) og grundig klatte overflødig RØR / sukrose fra kanten av vinduet med en Kimwipe. Klatte også bak innrykket området ved hjelp av en avrundet fold av en Kimwipe.
    MERK: Målet er å ha så lite krystallisering av salter eller buffere på overflaten av vinduet som mulig.
  10. Plassere vinduet på rutenettet matten. Pass på at vinduet ikke ligger flatt på rutenettet matte, men støttet opp på en kant (med rygger av rutenettet matte) og berøre så lite av rutenettetmatte som mulig. La vinduet tørr.

4. Prøve Montering og bildebehandling

  1. Når prøven er tørket, kontrollerer tilstedeværelsen av celler på vinduene ved hjelp av et lysmikroskop. Utføre denne verifiseringen, før du forbereder prøvene for transport til en synkrotron.
  2. Pakke vinduene for transport til synkrotron beamline hosting eksperimentet. Forsiktig påføre vinduer med tape på to sider av en glassplate, og deretter påføre glass med bånd til bunnen av en petriskål av plast. Tape petriskål stengt.
    MERK: Før dette punktet, disse trinnene kan utføres på noen typiske lab. Følgende trinn vil best gjøres ved en synkrotron beamline.
  3. Fjern tapen fra vinduet forsiktig med pinsett. Bruke neglelakk, i en tynn enda belegg langs kanten av vinduet, for å sikre vinduene til en aluminium holder levert av beamline samarbeidspartnere på synkrotron.
  4. Sett aluminium holderen innen kinematisk montere, og deretter plassere den på plass i X-ray mikroskop. Montere prøven på en brakett å koble den til motoriserte etapper, inne i prøvekammeret på beamline.
  5. Etter at du avslutter prøven X-ray mikroskop instrument område (et bur laget av bly fylte vegger), oppsett skanningen. Ved hjelp beamline-spesifikk programvare, velg riktig område av prøven for å skanne, mens du ser på plasseringen av X-ray strålen på prøven med et kamera utstyrt med en video kors og pre-justert med en nedstrøms scintillator kamera.
  6. Velge den passende oppløsning for prøven, basert på et estimat av størrelsen på den minste trekk av interesse. For bildebehandling enkeltpattedyrceller (~ 20-40 mikrometer i størrelse), bruker en oppløsning på 0,25-0,5 mikrometer. For avbilding områder av vev, og skille cellelagene fra hverandre, å bruke en oppløsning av 2-20 um.
  7. Velge den riktige oppholdstiden for prøven, basert på en beregning av mengden av den møtteal av interesse til stede. For en rask oversikt skanning, eller hvis store mengder metaller er til stede, bruker flue skanninger med dveletider av 30-300 millisekunder per piksel. Hvis lite materiale er til stede, eller å måle metaller med lav relativ overflod, bruker step skanninger med oppholdstider på 1-2 sek per piksel.
  8. Programmere skanner inn i beamline-spesifikk programvare. Tilegne seg et raster-scan bilde. Arbeide sammen med de beamline samarbeidspartnere for å analysere data med programvare som vil identifisere de karakteristiske energitopper for hvert element.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evnen til X-ray fluorescens bildebehandling for å gi informasjon om biologiske prøver er betinget av disse prøvene være forberedt på en slik måte at de er robuste til stråleskader på tidsskala av eksperimentet, og likevel deres kjemiske og strukturelle trekk er godt bevart. I viser resultatet av en prøve som har blitt fremstilt som beskrevet ovenfor og avbildes, er det mulig å se at det er variasjon i de tilstedeværende elementer - som indikerer at fikseringen bevares disse sidene av cellen (figur 1).

Motsatt ser i stedet på en prøve hvor denne prosessen gikk ikke bra, og bufferen er fortsatt til stede under tørking, omfattende krystalldannelse fra molekyler tilstede skaper strukturelle skader på cellene og griper med samling av X-ray fluorescensspektra (også Figur 2).

Disse bildene er generert av per-pixel montering av røntgen-fluorescens-spektrum ved hvert punkt i bildet. Dette betyr at hvert spektrum, samlet på hver piksel, er individuelt analysert. Når du viser panelene i disse bildene som genereres fra de monterte data, er verdien tilordnet hvert punkt i bildet den integrerte summen av en Gaussian for den karakteristiske utslipp av et gitt element (f.eks jern) som passer best på X-ray fluorescens spekteret som samles på det punktet. For eksempel har en enkelt piksel i bildet en verdi (tall) for jern, som er summen av arealet under en gausskurve på den karakteristiske utslipp energi for jern, som passer og modeller data for utslipp spekteret av det punktet på prøven. Dataene vises med terskelverdier over hvert bilde (max og min) som tildeler høy- og lav-endene av farge-tabellen (nederst på hvert bilde) til bestemte verdier i bildet.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. X-ray fluorescens Bilde av en menneskelig SH-SY5Y Cell. Hvert panel i dette bildet viser forskjellig informasjon om de samme cellene. Det første panelet, merket DIC, er den optiske differensialinterferenskontrastmikroskopibilde av cellene. De følgende paneler, venstre til høyre, er fosfor (P), svovel (S), jern (Fe), og sink (Zn) bilder av de samme celler, som viser deres fordeling over hele arealet av cellen. Målestokken vist er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Figur 2
Figur 2. X-ray fluorescens Bilde av en Rat B103 Cell, tilberedt med dårlig eller utilstrekkelig fjerning av buffere. To celler er synlig i fosfor (P) panel,og er lett synlig i jern (Fe) og sink (Zn) paneler. Men tilstedeværelsen av krystallisert buffer, synlig som et utstryk av partikler gjennom sentrum av bildet, skjuler det meste av informasjonen. Målestokken vist er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

X-ray fluorescens bildebehandling er nyttig i mange felt, blant annet geofag, materialvitenskap, og kjemisk biologi 26-34. Fremskritt innen synkrotron røntgen, og deres fokus, har produsert svært høy intensitet bjelker. Fokusert røntgen bjelker tilstrekkelig til å eksitere de endogene metaller i celler som nå eksisterer, produserer signalet som kan måles med tiden tilgjengelig silisium drift detektorteknologi. Og studere den kjemiske biologi av metaller i cellen er ett program spesielt som gjør bruk av mange av de siste utviklingen i dette området.

Likevel, studiet av biologisk materiale ved hjelp av X-ray fluorescens mikros presenterer også spesielle utfordringer, i forhold til andre materialer, fordi de er hydrert. For å unngå stråleskader, ideelt prøvene ville bli frosset i glasslegemet is under målingen. Imidlertid kjemisk fiksering og lufttørking er mye mer tilgjengelig for nybegynnere, og kan være hensiktsmessig dersom metalleneav interesse er inert bundet til an å fikse makromolekyler, og oppløsningen som utvalget skal avbildes er større enn skadene på ultra-mikrostruktur som kan oppstå under tørking.

I vurderingen av substrater for tilhenger celle XFM studier, trenger et ideelt underlag for å oppfylle følgende grunnleggende krav: 1) støtter robust cellevekst uten vekslende normal proliferativ og fenotypiske cellevekst, må 2) ikke har X-ray fluorescens som overlapper med de av elementer av interesse, 3) å være optisk transparent for cellevekst vurdering under lysmikroskop før XFM, og 4) være i stand til å motstå en hvilken som helst fysisk og kjemisk manipulering under dyrkingen og etterfølgende fiksering. Historisk sett har forskjellige substrater, som strekker seg fra tynne folier polykarbonat / filmer 35-37, formvar belagte gull transmisjonselektronmikroskopi (TEM) rutenett 38-42 og silisiumnitrid vinduer 5,17,43-46, er blitt brukt til å dyrke pattedyrcelles og brukes for røntgen fluorescens-avbildning. I sammenligning mellom de eksisterende og potensielle substrater for avbilding av adherente pattedyrceller ved XFM, silisiumnitrid membran (Si 3 N 4) vinduer som er mest egnet på grunn av deres lave fluorescens bakgrunn og relativt enkel elementsammensetning 4-6,47,48. I tillegg Si 3 N 4 vinduer støtte robust celle vedlegg og spredning. Sammenlignet med andre vanlige underlag som TEM rutenett, Si 3 N 4 vinduer har også en mye større uavbrutt bildeområdet som er en spesiell fordel når disse vinduene brukes for X-ray tomografi.

Si 3 N 4 vinduer er kommersielt tilgjengelige fra et begrenset antall leverandører. Arbeide med silisiumnitridpartiklene vinduer er en ervervet dyktighet. Vinduene er svært skjør, og krever stor forsiktighet for å ikke skape noen kronglete krefter ved håndtering av dem som kan knuse dem, eller å slippe dem. Handling dem i kantene som bruker omvendt pinsett er en populær tilnærming. De fleste vinduer har tykkelser fra 30 nm til 500 nm og en bredde fra 1 x 1 mm til 5 x 5 mm. Generelt, jo tykkere membranen er, jo mer robust de er for alle typer håndteringsstress. Men med økt tykkelse og mindre optisk transparens, vil de øke bakgrunnen emisjon fra prøven. De 200 nm tykke membraner er helt ideell. De har minimal innvirkning på målingen, men er solid nok til å bli håndtert uten mye brekkasje.

Selv om mange celletyper testet kan i utgangspunktet feste og robust vokse på de sterile Si 3 N 4 vinduer, celler dyrket på siliciumnitrid vinduer er generelt mye mer lett irriterte enn celler på tradisjonelle cellekulturplater. De blir lett frittliggende, aggregert eller rundet opp selv under rutinemedie endringer. Vi fant forvasket vinduer ble ofte mer hydrofil; celler feste bedre og hadde mindre chance å samle sammen. Trinnene som er beskrevet i protokollen ovenfor avgrense en mild-vask tilnærming til å holde cellene i vinduet. Noen andre skritt som kan tas inkluderer belegg vinduene med poly-lysin, eller laminin, akkurat som man kunne belegge en dekkglass.

Et annet aspekt av denne metode som kan være suksess eller svikt i et gitt eksperiment er omrøring av prøvene. I å observere cellenes vekst på plast kultur fartøy, betyr det normale utvalget av uro som følge av pipettering og plate transport synes ikke å forårsake mye skade. Men for celler dyrket på silisiumnitridet vinduer, ekstra forsiktighet under medieendringer og plate transport nødvendig. For noen lett irriterte celler som mus fibroblastceller NIH / 3T3, kultur plater som inneholder windows må håndteres forsiktig. De har til å være nøye tatt ut fra inkubatoren og forsiktig satt på mikroskopet scenen eller kabinett overflaten. Ikke nødvendigvis hver lille physical sjokk forstyrrer cellene, men risikoen for celle avløsning øker uten ekstra omsorg. I tillegg kan forskjellige satser av føtalt bovint serum og silisiumnitrid vinduer har visse effekter på festingen av celler på vinduet. Noen kilder til serum eller grupper av vinduer virke lettere å jobbe med, det vil si uten å se for mye forstyrrelse av lignende vare. I så fall kan en del prøving og feiling for cellelinje av interesse anbefales.

Med utviklingen i kryogeniske stadier for X-ray fluorescens microprobes, samt ny forskning i utarbeidelsen av frosne hydrerte biologiske prøver, er det sannsynlig at prøveopparbeidelse i fremtiden vil mye mer i økende grad omfatter frosset hydrerte prøver. Mange av de samme utfordringene i arbeids med silisiumnitridpartiklene vinduer, og beholde celleadhesjonen finnes der også. Likevel, mestring denne teknikken er fortsatt et veldig godt sted å starte i å utvikle ferdigheter før du prøver nedfrysing, ennd mange ganger, er en perfekt egnet måte til bildeeksempler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Kjemi X-ray fluorescens bildebehandling metaller kjemiske biologi mikroskopi synkrotron
Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter