Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52370
Automatic Translation
1, 2
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

Introduction

De raios-X de imagens por fluorescência permite tanto a identidade e quantidade de elementos presentes numa amostra a ser espacialmente resolvido. Incidentes raios-X, de uma energia seleccionada para ser maior do que a energia do elemento mais pesado de interesse de ligação de electrões, ultrapassar a energia de ligação dos electrões de concha interior do núcleo 1. Isso cria um "buraco" na camada de elétrons. Tal como electrões de alta energia cair para estes orifícios, raios-X fluorescentes são emitidos cujo comprimento de onda é dependente da energia de separação dessas orbitais. Uma vez que o espaçamento entre a energia das orbitais é característica de um dado elemento, a emissão de fluorescência de raios-X também tem comprimentos de onda característicos, dependentes do elemento. É esta emissão a um comprimento de onda característico que permite a identificação dos elementos presentes. A calibração da intensidade de fluorescência permite a quantificação dos elementos presentes.

Fluorescência de raios X microscopy (XFM) tornou-se cada vez mais utilizada, em parte devido ao desenvolvimento de fontes de síncrotron de raios-X muito brilhantes, como as que estão em Spring-8 no Japão, o Mecanismo Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) em França, eo Advanced Photon Source ( APS) em os EUA 2. Estas fontes fornecem muito elevado de intensidade de raios-X. Ao mesmo tempo, as melhorias na óptica de raios-X, tal como a tecnologia de placa de zona, permitiu a focagem de feixes para estes pontos de sub-micron, embora bastante ineficiente 3. Com muito feixes de alta intensidade, mesmo uma quantidade relativamente pequena de luz que pode ser focado é suficiente para excitar os metais endógenos nas células, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível detector. Assim, o estudo da biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso de muitos dos desenvolvimentos recentes nesta técnica 4-10.

Há muitos fatores críticos a serem considerados ao appdeitada XFM para investigar a distribuição elementar e quantificação de células de mamíferos em cultura ou outras amostras biológicas. Em primeiro lugar, a amostra tem de ser mantidas intactas, quer estruturalmente quer no que diz respeito à sua composição elementar, em ordem para a medição de ser significativa. Em segundo lugar, a amostra deve ser também preservada de alguma forma de modo que seja resistente aos danos que a radiação pode ser causada por um feixe de raios-X concentrado. Uma maneira que uma amostra pode atender a esses critérios ao mesmo tempo, deve ser rapidamente congelados em um vítreo, gelo amorfo 11,12. Congelação rápida é muitas vezes conseguida através de várias técnicas de criopreservação, como o congelamento de mergulho ou de alta pressão congelamento 13-16. É geralmente aceite que a criopreservação preserva arquitectura celular em geral e composições químicas em amostras biológicas quanto à proximidade estado nativo quanto possível. Fixação química, por outro lado, devido à penetração lenta e selectiva de fixadores em células e tecidos como well alterações posteriores como na permeabilidade da membrana, pode permitir que vários íons celulares especialmente os íons difusíveis, como Cl, Ca e K a ser lixiviados, perdidos ou realocados, tornando assim investigação destes elementos sub�timas 17-19. Apesar da clara vantagem de crio-fixação sobre fixação química em geral, para células de mamíferos aderentes, em particular, a criopreservação tem várias limitações 20-23. A mais óbvia é que nem todo laboratório de pesquisa tem fácil acesso a instrumentos de criopreservação. A maioria dos congeladores alta pressão actuais nem mergulhar congeladores são dispendiosos e de propriedade apenas de um subconjunto de instalações de crio, que pode ser medida a partir de onde as células são incubadas. O benefício de criopreservação pode ser trocado por a desvantagem de estresse viagens colocado sobre as células. Assim, enquanto a criopreservação é certamente a forma mais rigorosa para preservar amostras para análise de fluorescência de raios-X, não é certamente o mais acessível a todos os investigadores em todas as circunstâncias;nem sempre é essencial - se os metais de interesse estão fortemente ligados a macromoléculas fixável, e a resolução na qual a amostra vai ser trabalhada é maior do que o dano para o ultra-microestrutura que pode ocorrer durante a secagem. Ciente das ressalvas 24, fixação química e secagem pode ser uma escolha adequada.

Outros fatores em um raio-X experimento imagens de fluorescência de sucesso incluir uma análise adequada. Fluorescência de raios X de imagem é, fundamentalmente, de raios-X espectroscopia de emissão de fluorescência combinado com raster-digitalização para fornecer resolução espacial. Os espectros de emissão de fluorescência de raios-X recolhidos conter uma combinação de sobreposição de picos de emissão de fundo, e os picos de espalhamento de elásticos e inelásticos do feixe incidente. Software que permite que o de-convolution dessas contribuições e na concepção dos picos de emissão, tem sido um desenvolvimento crítico a esse campo 25. Além disso, o desenvolvimento comercial e distribution de padrões de película fina de composição conhecida e utilizada para calibrar a intensidade da fluorescência em relação à quantidade de material, também tem sido muito importante.

Este protocolo fornece uma descrição da preparação de células aderentes por fixação química e secagem ao ar. Um passo fundamental neste processo é o crescimento das células nas janelas de nitreto de silício, que muitas vezes não aderem bem, fazendo lavagem suave em uma chave de moda especial para o sucesso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação de instrumentos, substratos, Meios de Cultura e pratos

  1. Manuseio de nitreto de silício (Si 3 N 4) janelas.
    1. Abrir a cápsula, apertando ligeiramente uma extremidade que contém a janela de tal modo que não espremer a própria janela, enquanto se rodam a outra extremidade da cápsula com a outra mão.
    2. Confira um par de reverso, uma pinça de ponta fina, sob lupa para se certificar de que não há adesivas, lacunas ou curvas na ponta. Caso contrário, as janelas podem ser quebrado pelas pinças ou voar fora deles durante as etapas subsequentes.
    3. Remover a janela a partir da cápsula por cuidadosamente agarrar o quadro da janela, com uma pinça, enquanto apertando suavemente a cápsula perto da extremidade aberta da aplicação de pressão numa direcção de modo a tornar a cápsula mais amplo, onde as extremidades da janela precisa de sair.
  2. Janela de pré-lavagem (opcional).
    1. Se desejado, janelas de pré-lavagem por suavemente mergulhando-em água destilada durante 5 segundos, seguido de 2 min de lavagem com etanol a 70% e 2 min de lavagem em etanol a 100%.
  3. Aposição e esterilização janelas na placa de cultura.
    1. Para fixar as janelas, defina a janela com o lado liso para cima, na parte inferior da placa de cultura, coloque um pedaço de fita em uma lâmina de vidro limpa. Corte uma tira de cerca de um quarto de polegada a descer o lado longo da fita. Tome uma fatia de fita fora o lado mais curto (pelo ⅛ "por ¾"), com uma lâmina de barbear limpo.
    2. Utilize uma pinça para aplicar a fatia de fita para a extremidade da grade ou janela. Use o suficiente para aderir-lo de forma segura, sem cobrir a própria abertura da janela. Manipular a fita colada, com uma pinça, defina a janela para baixo para o fundo da placa de cultura. Utilize a ponta da pinça para aderir a fita para o fundo do prato de cultura com firmeza.
    3. Aplicar uma outra tira de fita adesiva para o outro bordo e isso para aderir firmemente a parte inferior com a ponta da pinça.
    4. Uma vez que todas as janelas sãogravadas, esterilizar janelas em placas de cultura com radiação ultravioleta (UV). Realizar isto colocando o prato sob a lâmpada UV numa câmara de fluxo laminar durante cerca de 1 h.
    5. (Opcional) Se as janelas são para ser pré-revestida com poli-lisina, de modo que após a esterilização janela. Brasão da janela com 10 ml de solução estéril de 0,01% de lisina poli-L-1 para hr em um 37 ° C incubadora, e depois enxaguar o restante solução fora com o meio de cultura.
  4. Prepare buffers para lavagem final antes XFM.
    1. Prepare ou um sistema tampão Tris-glicose ou piperazina-N, N'-bis (ácido etanossulfónico) (PIPES) -sacarose tampão isento de quaisquer vestígios de metais, com a osmolalidade e pH equivalente ao tampão salino de fosfato da Dulbecco (D-PBS) sem cálcio e magnésio. Use um desses buffers para lavar células após células são fixadas quimicamente.
      1. Para fazer a solução de Tris-glucose (10 mM Tris, 260 mM de glucose, 9 mM de ácido acético), adicionar 1,4 g de glicose, 36 mg de base Tris e16 ul de ácido acético a 20 ml de água ultrapura. Em seguida, ajustar o volume final para 30 ml com água ultrapura. Não é necessário qualquer ajuste de pH. Armazenar à temperatura ambiente até uma semana.
      2. Para fazer com que os tubos de sacarose (20 TUBOS mM, 200 mM sacarose) adicionar 0,18 g de tubos e 2,0 g de sacarose em 20 ml de água ultrapura e ajustar o pH para 7,4 com pequenas quantidades de ácido acético concentrado. Em seguida, ajustar o volume final para 30 ml com água ultrapura. Armazenar à temperatura ambiente até uma semana.
        Observação: A razão para evitar o uso de PBS no enxaguamento final é que as concentrações de fosfato, cloreto e potássio em PBS são tão alta que possa interferir com XFM se não for completamente removido antes da secagem por ar.
  5. Prepare buffers para revestimento celular.
    1. Prepare ou para levar todos os meios, tais como o meio RPMI 1640, 1x solução de tripsina-EDTA, D-PBS, e quaisquer outros reagentes necessários, como para a linha de células aderentes em particular como seria normalmente feita por passagem das células aderentes de of interesse, e aquecê-los a 37 ° C.

2. chapeamento de Células

  1. Para o prato de cultura esterilizado contendo as janelas, na câmara de fluxo laminar, adicionar suavemente suportes (10 ml para um prato de cultura de 100 milímetros), ao longo do lado do prato de cultura com ele inclinado num ângulo. Evite criar tensão superficial desnecessária ou deixar cair a mídia diretamente na superfície das janelas de nitreto de silício. Como a mídia é adicionada, lentamente aliviar o ângulo de inclinação para revestir a grade e uma janela com a mídia.
  2. Prepare a linha de células aderentes de interesse de forma adequada, trypsinizing ou raspar as células fora das placas, como de costume para passaging a linha celular. Executar qualquer contagem de células, ou de outra preparação necessária antes de aplicar as células à placa fresca.
  3. Adicionar células a placas de cultura com janelas numa densidade celular que é necessário para alcançar tipicamente 50% -70% de confluência dentro de 24-72 h, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de dióxido de carbono. Observar o crescimento das células, ocasionalmente, usando um microscópio óptico invertido, até a densidade celular desejada (geralmente 50% -70% de confluência) é alcançado.

3. Fixação de Células

  1. Preparar uma solução de paraformaldeído a 4% em STP-D através da diluição de um estoque adquirido (tal como 25% de paraformaldeído) e ajustando o pH para 7,4 com ácido acético (para evitar a adição de sódio em excesso para a amostra).
  2. Quando as células foram cultivadas como desejado, e todas as manchas vitais (tais como Hoescht) foram aplicadas e fotografada, remova a mídia através de aspiração ligeira, inclinando o prato em um ângulo de 45 ° com uma mão, e aspiração, com uma pipeta mão com a outra .
    NOTA: Em vez de mídia de pipetagem passado, uma alternativa é pegar a janela para cima, mergulhe a janela para microtubos com D-PBS duas vezes e, em seguida, colocá-lo em um novo recipiente de cultura com soluções fixadoras de 20 minutos, seguido de dois tempos de lavagem PBS para remover os fixadores residuais. Se este for escolhido, ir dirrectamente para o passo 3.5.
  3. Lavar o prato gentilmente com D-PBS e substituir o líquido retirado imediatamente por adição suavemente a fresco 4% PFA / PBS, mantendo o prato a um ângulo de 45 °, de pipetagem para o lado do prato, e relaxa-se lentamente o ângulo de inclinação para permitir a solução fixadora para cobrir as janelas. Manter as células cobertas com o fixador durante 20 min à temperatura ambiente.
  4. Retirar o líquido por aspiração suave, mais uma vez, como acima, inclinando o prato um pouco e aspirando à mão.
  5. Substituir o líquido removido, adicionando suavemente algumas das PIPES / solução de sacarose, utilizando o método de inclinação e de pipetagem descrito no Passo 3.3.
  6. Repita os passos 3.4 e 3.5.
  7. Prepare os materiais para a secagem.
    1. Reúna toalhas que não soltem fiapos, como Kimwipes, e puxar para fora da caixa, por isso é útil muito rapidamente e facilmente.
    2. Prepare um lugar limpo e não-nível para definir a janela para secar. Definir uma esteira grade de borracha do tipo utilizado em microscopia eletrônica, que tem sulcos assima janela pode ser apoiado em uma das extremidades, enquanto que seque. Isto irá manter a janela de ficar presa à superfície de secagem medida que seca, e drenar todo o tampão restante para o bordo da amostra.
  8. Tweeze cuidadosamente a fita anexada à janela para manter a janela para fora do líquido. Recuperar janelas que saem da fita através da aplicação de uma pequena quantidade de tubos / sacarose para levá-los a flutuar e, em seguida, pegando-os com a pinça reversos.
  9. Cuidadosamente (sem tocar na própria janela) e completamente rebocam qualquer excesso PIPES / sacarose a partir da borda da janela com um Kimwipe. Também a rebocam de volta a área de recuado usando uma dobra arredondada de uma Kimwipe.
    NOTA: A meta é ter tão pouco cristalização de sais ou tampões sobre a superfície da janela que for possível.
  10. Coloque a janela sobre o tapete grid. Certifique-se de que a janela não está deitado no tapete grid, mas apoiado em uma borda (usando os cumes do tapete grid) e tocar tão pouco da gradeesteira possível. Deixe a janela seco.

4. Montagem Sample and Imaging

  1. Uma vez que a amostra tenha secado, verificar a presença de células sobre as janelas usando um microscópio de luz. Execute esta verificação, antes de preparar as amostras para o transporte para um síncrotron.
  2. Embale as janelas para o transporte para o beamline síncrotron hospedar seu experimento. Suavemente apor as janelas com fita de dois lados para uma lâmina de vidro, em seguida, fixar a lâmina de vidro com fita para o fundo de uma placa de Petri de plástico. Tape o prato Petri fechada.
    NOTA: Antes deste ponto, estes passos podem ser realizados em qualquer laboratório típico. Os passos seguintes seriam o melhor feito em uma linha de luz síncrotron.
  3. Retire a fita da janela delicadamente com uma pinça. Use unha polonês, em uma camada fina e uniforme ao longo da borda da janela, para proteger as janelas para um suporte de alumínio fornecido pelos colaboradores beamline no síncrotron.
  4. Insira o suporte de alumínio emuma cinemática de montagem, em seguida, coloque-a na posição no microscópio de raios-X. Monte a amostra num suporte de conectá-lo a estágios motorizados, no interior da câmara de amostra na linha de luz.
  5. Depois de sair de raios-X da área de amostra instrumento microscópio (a gaiola feita de paredes cheias de chumbo), a configuração da digitalização. Usando um software específico de linha de luz, escolher a área apropriada da amostra para fazer a varredura, enquanto visualiza a posição do feixe de raios X sobre a amostra usando uma câmera equipada com um cross-cabelo vídeo e pré-alinhados com uma câmera cintilador downstream.
  6. Escolha a resolução apropriada para a amostra, com base na estimativa do tamanho da menor característica de interesse. For Imaging células de mamíferos de solteiro (~ 20-40 mm de tamanho), use uma resolução de 0,25-0,5 um. Para as áreas de tecidos de imagem, e distinguir camadas de células do outro, use uma resolução de 2-20 mm.
  7. Escolha o tempo de permanência adequado para a amostra, com base na estimativa da quantidade de metal de interesse presente. Para uma verificação rápida visão geral, ou se grandes quantidades de metais estão presentes, use scans voar com tempos de permanência de 30-300 ms por pixel. Se pouco material está presente, ou para medir metais de baixa abundância relativa, use scans passo com tempo de espera de 1-2 segundos por pixel.
  8. Programar as digitalizações em software específico do beamline. Adquirir uma imagem raster-scan. Trabalhar em conjunto com os colaboradores beamline para analisar os dados com o software que irá identificar os picos de energia característicos para cada elemento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A capacidade de imagiologia por fluorescência de raios-X para fornecer informações sobre amostras biológicas depende destas amostras a ser preparada de tal maneira que eles são robustos para os danos da radiação na escala temporal da experiência, e mesmo assim a sua características químicas e estruturais são bem preservada. Ao observar o resultado de uma amostra que tenha sido preparado tal como descrito acima e fotografada, é possível ver que existe uma variação nos elementos presentes - indicando que a fixação preservada estes aspectos da célula (Figura 1).

Por outro lado, procura em vez de uma amostra em que este processo não vão bem, e o tampão permanece presente durante a secagem, extensa formação de cristais a partir das moléculas presentes cria danos estruturais nas células e também interfere com a recolha de espectros de fluorescência de raios-X ( Figura 2).

Estas imagens são geradas por encaixe per-pixel o espectro de fluorescência de raios-X em cada ponto da imagem. Isto significa que cada espectro, recolhidos em cada pixel, foi analisado individualmente. Ao visualizar os painéis nestas imagens geradas a partir dos dados ajustados, o valor atribuído a cada ponto da imagem é a soma integrada de uma curva de Gauss e a característica de emissão de um dado elemento (por exemplo, ferro), como melhor se adapta a fluorescência de raios-X espectro coletadas naquele ponto. Por exemplo, um único pixel na imagem tem um valor (número) de ferro, que é a soma da área sob uma curva de Gauss na característica de emissão de energia para o ferro, que se encaixa e os modelos de dados para o espectro de emissão do referido ponto na amostra. Os dados são exibidos com valores limiares acima de cada imagem (máximo e mínimo) que atribuem a alta e baixa extremidades de-tabela de cores (na parte inferior de cada imagem) para valores específicos dentro da imagem.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figura 1. fluorescência de raios X Imagem de uma célula humana SH-SY5Y. Cada painel nesta imagem mostra informações diferentes sobre as mesmas células. O primeiro painel, marcado DIC, é a interferência diferencial contraste micrografia óptica das células. Os seguintes painéis, esquerda para a direita, são o fósforo (P), enxofre (S), ferro (Fe), e as imagens de zinco (Zn) das mesmas células, mostrando sua distribuição sobre a área da célula. A barra de escala apresentada é de 20 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Figura 2
Figura 2. Fluorescência de raios-X de Imagem de um celular de rato B103, preparado com remoção deficiente ou insuficiente de buffers. Duas células são visíveis no painel de fósforo (P),e são ligeiramente visível no ferro (Fe) e zinco (Zn), os painéis. No entanto, a presença de tampão cristalizada, como uma mancha visível de partículas através do centro da imagem, obscurece a maior parte da informação. A barra de escala apresentada é de 20 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorescência de raios X de imagem é útil em muitos campos, incluindo geociências, ciência dos materiais e biologia química 26-34. Avanços no síncrotron de raios-X, e sua focalização, têm produzido muito feixes de alta intensidade. Raio-X Focused vigas suficiente para excitar os metais endógenos em células já existentes, produzindo sinal que pode ser medido com a tecnologia atualmente disponível silício detector drift. E estudar a biologia química de metais na célula é uma aplicação em particular, que faz uso de muitos dos recentes desenvolvimentos nesta área.

No entanto, o estudo de materiais biológicos por meio de microscopia de fluorescência de raios-X também apresenta desafios especiais, em relação a outros materiais, porque eles são hidratados. Para evitar danos causados ​​pela radiação, idealmente as amostras seriam congelados em gelo vítreo durante a medição. No entanto, a fixação química e secagem do ar são muito mais acessível para os novatos, e pode ser apropriado se os metaisde interesse são ligados a macromoléculas inerte fixável, e a resolução na qual a amostra vai ser trabalhada é maior do que o dano para o ultra-microestrutura que podem ocorrer durante a secagem.

Ao considerar substratos para estudos XFM de células aderentes, um substrato ideal tem de cumprir os seguintes requisitos básicos: 1) apoiar o crescimento celular robusto, sem alternância de crescimento celular proliferativa e fenotípica normal, 2) não deve ter fluorescência de raios-X que se sobrepõe com os dos elementos de interesse, 3) ser opticamente transparente para avaliação do crescimento de células em microscópio de luz antes XFM, e 4) ser capaz de resistir a qualquer manipulação química e física durante a cultura e fixação posterior. Historicamente, diferentes substratos, que variam de finos floretes de policarbonato / filmes 35-37, Formvar microscopia eletrônica de transmissão de ouro revestido (TEM) grades 38-42 e nitreto de silício janelas 5,17,43-46, têm sido utilizados para crescer células de mamíferose s utilizados para a fluorescência de raios X de imagem. Na comparação entre os substratos existentes e potenciais para geração de imagens células de mamíferos aderentes pela XFM, membrana de nitreto de silício (Si 3 N 4) As janelas são os mais adequados, devido à sua baixa fluorescência de fundo e relativamente simples composição elementar 4-6,47,48. Além Si 3 N 4 janelas apoiar a fixação das células robusto e proliferação. Em comparação com outros substratos normalmente utilizados, tais como grades de MET, Si 3 N 4 janelas também têm uma área de imagem muito maior ininterrupta que é uma vantagem especial, quando estas janelas são utilizadas para tomografia de raios-X.

Si 3 N 4, as janelas encontram-se comercialmente disponíveis a partir de um número limitado de fornecedores. Trabalhando com janelas de nitreto de silício é uma habilidade adquirida. As janelas são muito frágeis, e requerem muito cuidado para não criar quaisquer forças de torção, enquanto a sua manipulação que pode quebrar-los ou deixá-los. Handl-as pelas bordas usando uma pinça reversa é uma abordagem popular. A maioria das janelas têm espessuras variando de 30 nm a 500 nm e uma largura de 1 x 1 mm a 5 x 5 mm. Em geral, quanto mais espessa a membrana, o mais robusto que são para todos os tipos de lidar com stress. No entanto, com o aumento da espessura e transparência óptica inferior, que irá aumentar a emissão de fundo a partir do espécime. As membranas com uma espessura de 200 nm são bastante ideal. Eles têm um impacto mínimo sobre a medição, são ainda suficientemente robusta para ser manuseada sem muito ruptura.

Embora muitos tipos de células testados inicialmente pode anexar e robustamente crescer nas estéreis Si 3 N 4 janelas, as células cultivadas em janelas de nitreto de silício são, em geral, muito mais facilmente do que as células agitadas em placas de cultura celular tradicional. Eles se tornam facilmente retirado, agregada ou arredondado, mesmo durante as mudanças de mídia de rotina. Encontramos janelas pré-lavadas muitas vezes tornou-se mais hidrofílico; células anexar melhor e tinha menos chance para agregar juntos. Os passos descritos no protocolo acima delinear uma abordagem suave de lavagem para manter as células na janela. Algumas outras medidas que podem ser tomadas incluem revestimento as janelas com poli-lisina, ou laminina, assim como um poder revestir uma lamela.

Outro aspecto do presente método que pode ser o sucesso ou a falha de uma determinada experiência é agitação das amostras. Ao observar o crescimento de células em vasos de cultura de plástico, a faixa normal de agitação resultante da pipetagem e placa de transporte não parece causar muito dano. No entanto, para as células cultivadas nas janelas de nitreto de silício, é necessário cuidado extra durante a mudança de mídia e placa de transporte. Para algumas células facilmente agitado, tais como células de fibroblastos de rato NIH / 3T3, as placas de cultura contendo janelas precisam ser manuseados com cuidado. Eles têm de ser cuidadosamente retirado da incubadora e suavemente definido no palco microscópio ou superfície gabinete. Não necessariamente todos os pequenos pchoque hysical vai perturbar as células, mas o risco de desprendimento de células aumenta sem cuidados extra. Além disso, diferentes lotes de soro e de nitreto de silício janelas de fetos bovinos pode ter certos efeitos sobre a ligação das células na janela. Algumas fontes de soro ou lotes de janelas parecem mais fáceis de trabalhar, ou seja, sem ver muito incomodo pelo cuidado similar. Então, alguma tentativa e erro para a linha celular de interesse podem ser aconselhadas.

Com a evolução em estágios criogênicos para raios-X microprobes de fluorescência, bem como novas pesquisas na preparação de amostras biológicas hidratados congelados, é provável que a preparação da amostra, no futuro, muito mais cada vez mais inclui congelados espécimes hidratados. Muitos dos mesmos desafios em trabalhar com as janelas de nitreto de silício, e retenção de adesão celular existem lá também. No entanto, o domínio dessa técnica continua a ser um lugar muito bom para começar no desenvolvimento de habilidades antes de tentar a criopreservação, umnd muitas vezes, é uma forma perfeitamente adequada para amostras de imagem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm. Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
Acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. Science of Biological Specimen. , SEM, Inc. 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven's Hair. 17, José State University San José, CA. Naperville, Illinois, Beethoven Center, San. (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques--subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O'Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell's endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

Química Edição 97 raio-X fluorescência imaging metais biologia química microscopia síncrotron
Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing… More

Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter