Abstract
该协议研究人员介绍，为大规模的骨修复利用鼠标肋骨的新模式。该过程详细描述了以下内容：准备动物进行手术的，打开胸体壁，从周围肋间肌曝光所需的肋，切除肋的所需部分，而不诱导气胸，并关闭所述切口。相较于四肢骨骼的骨头，肋骨都非常方便。此外，没有任何的内部或外部固定器是必要的，因为在相邻的肋提供自然的固定。手术采用市售的用品，很简单易学，且耐受性良好的动物。该过程可以进行具有或不具有除去周围骨膜，因此骨膜修复的贡献可以被评估。结果表明，如果被保留的骨膜，鲁棒修复发生在1 - 2个月。我们希望利用这个协议会鼓励研究到肋骨修复，而结果将有利于新的方式来刺激骨修复等身体周围地区的发展。
Introduction
衰弱的骨骼损伤，慢性骨关节炎，以及与重建手术相关的严重问题影响经济生产力，家庭幸福，和生活质量。而小断裂和损伤可以治愈还算不错，人类是不能修复大的缺陷，因此必须依靠重建手术，恢复的结构和功能。重建可能涉及同种异体或heterogeneic移植，骨morcellized，植入支架，或牵张成骨。不幸的是，不仅有与这些处理，但在修复骨骼的原始强度是很少获得持久性相关的发病率的因素。因此，需要新的临床方法。
单向开发创新的方法来治疗节段性缺损的研究中，大型维修时，自然的情况。著名的两栖动物可以再生骨骼元素，而哺乳动物被认为是有限的日是能力。然而，由于20 世纪初期，再生在人肋几个报告已经发表表明人类可能不被如此限制1-4。目前这种现象，最好由整形外科医生谁使用肋材料颚，脸和耳重建已知的，但它不是更广泛地理解5。为了研究这种修复中更详细地说，我们已经开发出使用鼠标的外科模型。使用该协议，研究人员可以识别所涉及的先天因素，并使用该信息，以便在其它地点的骨骼的愈合。
有许多优势，使用肋骨作为模型来研究骨骼修复。首先，将周围的肋提供自然固定器（相对于切除股骨6,7）。这降低了内部和外部固定器的发病风险并简化了外科手术。胸部西澳其次，薄肌层会提供易于访问和良好的能见度使得检测媲美颅骨切除8的便利。第三，在对比其通过膜内骨化，由软骨内骨化肋形式形成，并通过延伸在位于中央骨干的任一端生长板生长长度的颅骨。因此，修复肋可能更媲美修复长骨的阑尾骨架组成。此外，我们已经发现，相对于股骨，肋的骨膜较厚，可以更容易地操纵。因此，调查谁愿意测定骨修复的研究骨膜或测试细胞疗法，药物制剂，和/或组织支架的目的，可能会发现这种手术模式非常有用。总之，这个肋切除模型提供在其内来研究天然大型骨修复哺乳动物中一般使用没有这样的模型当前存在的上下文。
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Protocol
注：所有的程序都是按照批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在南加州大学的动物协议。
1.准备手术
- 奠定了必要的外科手术工具和用品（消毒，项目1 - 18 材料清单），并安排一个解剖显微镜和光纤反式照明在引擎盖上或下沉气流表格。
- 将一个性成熟的小鼠（20 - 30克，1 - 3个月）的感应室4％异氟醚诱导麻醉。
- 确认麻醉用爪子和/或尾掐测试。
- 适用软膏鼠标的眼睛，以避免手术过程中眼睛干涩。
- 将鼠标移动到显微镜阶段。将鼠标进入检修软管的鼻锥和横向定位。提供邻近于动物的暖袋，以帮助维持体温。
不E：鼠标的位置是依赖于个人的喜好和/或外科医生的霸道，无论是左边或右边是好的。 - 调整异氟醚为2 - 3％的维修，看呼吸频率。
- 注入丁丙诺啡（0.05毫克/千克）经皮下（横向腿的侧翼），用于手术后疼痛与地下25针。腿可以抽搐这是一种正常的反应。
2.切口开幕
- 检测所需肋通过触诊，并清除了剃须刀的头发的区域。
注：肋8-10被推荐，因为肋1-7更接近肺和11-13都相当短。计数肋骨应该开始用最喙肋骨为1号。 - 制备具有交替的聚维酮碘和异丙醇（70％）擦拭（3×常被推荐由动物使用的协议）的区域。
- 通过皮肤切成2厘米的切口，正上方，并平行于与中型显微剪刀所需的肋。 Inc这是E到下面的肌肉和脂肪层。
- 将所有3层（皮肤，肌肉，脂肪）到牵开器，以暴露手术区，同时最小切口的大小。
3.切除肋骨
- 通过肋间肌覆盖肋的所需部分与5.0毫米手术刀切割。位置周围5毫米近侧此切口的chondrocostal接头，这是其中的肋并不像高度弯曲。从小心地用细尖镊子骨分离肌肉。
- 创建一个切除，同时保留在动物的骨膜，切断通过骨膜，沿肋的带5.0毫米手术刀的长度。仔细分离的骨膜从底层骨横向用细尖镊子。操作时要小心，因为骨膜十分细腻并有着一种凝胶状的一致性。
- 在下使横截面穿过骨在一端与细微型剪刀。如果需要的话，测量切除掩模版在显微镜或直尺型测量仪。然后小心地将骨出骨膜和切断的另一端。
注：请谨慎操作。这是最微妙的一步，因为拉起不低于切除肋骨撕裂胸膜，造成气胸。如果胸膜膜被撕裂，这将是容易地明显的，因为胸腔的内部将变得可见。 - 如果出血发生切割骨的结果，将压力施加于切割端用棉签4 - 5秒来止血。
注：在罕见场合继续出血，这可能是必要的，以停止和安乐死的动物作为显著失血会危及恢复（无补液，最大血液量可以安全地丢失是总血液体积的10％或7.7 - 8微升/克对于25克鼠标，这相当于约180 - 200微升9）。 - 立即将取出的肋骨成4％PFA供日后分析。
注意：如果切除两个骨和骨膜的是要进行，省略了骨膜切口和分离（ 步骤3.2）。由于骨膜非常紧密附着于胸膜谨慎行事，挑逗肋远离胸膜用钳子以避免撕裂。
4.关闭切口
- 缝合肋间肌在剩余骨膜套筒用9-0缝合线（2缝线通常足够了）的顶部。放置缝线的肋的切断端部的正上方，作为指标，对手术位置。
- 取出牵开。缝合覆肌肉和脂肪用9-0缝线（3 - 4缝线通常就足够了）。小鼠肌肉和/或脂 肪的特别厚的层，分别缝合各层（ 例如，1层的缝合线的肌肉层和1层缝线的脂肪层）。
- 关闭皮肤缝合7-0（4 - 5缝线通常就足够了）。
- 确保切口缝合胶水，用大钳子捏边在一起。
- 慢慢地戒掉鼠标关闭异氟醚，首先需要调节至1％的几分钟，然后熄灭。
- 将鼠标下加热灯，并离开，直到意识恢复，5 - 10分钟。后意识恢复，并在整个愈合期，鼠标应该移动和走动正常并显示苦恼的迹象。
5.恢复和分析
- 提供术后疼痛管理，包括丁丙诺啡在0.5毫克口服明胶的形式管理/ kg，每12小时48小时。口服给药不需要抑制这可能会导致疼痛的胸部区域的动物。
- 保持鼠标与在愈合期间自由获取食物和水的笼子里。后切口是干的，雌性动物可以共同收纳而男性s必须保持隔离，以防止战斗。
- 愈合期后，按照批准的程序进行安乐死。拆下肋骨用于固定和分析。
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Representative Results
动物通常此过程中快速恢复，切口愈合良好，动物表现出正常的行为。该过程使用市售的用品和实践后，可在1小时内完成的。使用此过程来产生的实验数据前，有必要分析切除在第0天时间点，以确定是否有任何大的骨碎片可能会保留在切除区域内是重要的。评估适当的程序的一种方法是，以评估动物用X射线或显微成像术后，尽管这通常需要特别的辐射的安全认证。相反，另一种简单的评估可以通过进行骨骼肌染色制剂， 如图1A中完成。这涉及到收集肋笼，将其固定在EtOH，和染色用茜素红使用标准协议11。它可以是有用的，以省略氢氧化钾（用于消化掉软组织），使得塔吨样品仍然可以事后用于组织学分析，如果需要的话。样品仍可以无氢氧化钾步骤，通过在80％甘油中清除，因为上覆体壁肌肉层较薄可视化。或替代地，这些肌肉可以手动固定之前/染色如这里所示（ 图1A）除去。
骨移除的部分，也可以进行分析。如果目的是要保留在动物的骨膜，骨部分应当具有光滑的表面作为可视光镜和组织学分析（ 图1B，B'）。骨部分与骨膜除去应该具有明显粗糙的表面并且在组织学检查有一个完整的覆盖骨膜层，其具有致密不规则的结缔组织（ 图1C，C'）的特性。
根据实验的目的，治疗可以是评估在不同时间点。观察表明，在其中骨膜被保持在动物3毫米切除通常1内完全愈合 - 2个月。经形成了软，硬痂，并重塑维修发生。完全修复2个月时的例子示于图2A中，A';修复可以通过骨骼制备（ 图2A）和组织学分析（ 图2A'）进行评估。如果骨膜也被除去，该切除间隙从未填充。 图2B示出了其中的一些修复发生在一端的例子，但是，它是更典型的观察平端。经组织学分析，该切除区填充有脂肪，肉芽组织和肌肉（ 图2B'）。
图2.肋修复后愈合切除有和没有骨膜 。 （A）骨骼准备以下切除后〜2个月愈合，保留完整的骨膜鼠标（制备如图1A）内。可以观察到的区域的完整的修复。 （A'）的B示出了恢复的板层骨壁和组织学部分骨髓腔（苏木精和曙红）。 （B）的制备骨骼肌（茜素红）以下〜3个月的愈合除去两者的肋部分和周边骨膜之后。世界上只有极少的维修在面板的左侧所示的切口处。黄色箭头指向chondrocostal联合。 （B'）的乙示出肉芽组织，脂肪和肌肉细胞填充的切除（苏木精和曙红）的部位的组织学部分。比例尺：A，B = 1毫米; B'= 500微米; C'= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
当第一次学习此协议，确定在哪里可以找到最初的切口可以是具有挑战性。然而，在小鼠安乐死的做法可以帮助外科医生学会在哪里放置初始切口，暴露所需的肋骨被切除。工作在尸体也提高到具有或不具有骨膜除去肋部分所需的精细运动技能。此外，新的人到该过程可能会发现操纵细的工具和薄缝线是困难的。而打结，多余的拉动缝线可以撕裂组织。因此，一些实践缝合也对尸体可能是有帮助的。最后，如果外科医生是新与啮齿动物外科手术，它可能是有用的有另一个人在最初数手术协助监测和调节所述麻醉。
这个协议的最关键的步骤是切除骨头而不会诱导气胸（空气的异常收集在胸膜温泉CE），这是困难的，在小鼠的治疗自胸膜膜太薄，关闭手术。肌肉和壁层胸膜层逊色于肋非常薄，细腻;因此，精确的动作都需要防止在胸膜膜位于该切除区下方的穿刺。出现这种情况的最常见于步骤3.1和3.3。在步骤3.1（分离从周围肋间肌骨）中，锋利的手术刀和镊子将轻易刺穿胸膜层，如果点不保持肤浅。在步骤3.3（切细微型剪刀的骨），放置在骨可克服胸膜膜的拉伸强度，或断裂的骨的作用下的剪刀可能导致骨片段的末端，以穿孔胸膜。我们已发现，使用细微型剪刀具有弯曲末端是有益的。此外，如上述，它也可以是有用的，以第一个实践实施安乐死的小鼠的协议。 ULTI三方共同，但是我们已经发现，这个问题可以很容易地克服与耐性和实践。
虽然肋是软骨内骨，可能有肋骨架和长骨的阑尾骨架之间有一些潜在的重要区别。从胚胎的角度看，肋骨架是从一个不同的中胚层隔室（体节），比阑尾骨架（侧板中胚层）12得到的。因此，有可能有特有的肋骨祖细胞，反映在发育历史这种差异性。因此，在长期运行，也可能是必要的，以确定这些独特的性能是，然后使用此信息，以鼓励在肢体骨架的祖细胞如肋看到具有相同的设施，以调解修理。
该进场另一方面涉及相对于呼吸系统的肋的位置。阿尔虽然肋骨两侧附近提供这样没有外固定架需要切除足够的稳定性，修复区域是在肺通胀/通缩的不断运动和应变。人们已经认识到，在骨修复，过多运动，同时一些移动看起来是用于产生软骨中间13,14-重要是抑制愈合。在这一点上，它是不明确的，但它有可能形成软骨的中间体可以是用于有效的大规模修复的关键步骤。因此，肋的呼吸过程中的运动可能促进修复（当骨膜被留在动物）。因为运动可以是在这样的背景下尤其重要，开发一种方法以放置一固定器可能是用于研究生物力学影响上修在未来是有用的。
通过进行一个肋修理测定在小鼠，可以利用对已DEVE强大遗传工具优点的大步。例如，当使用转基因标记，修复细胞的来源可以评估。转基因记者对骨形成（有趣的新工具，可在开发从Gazit 等人 15,16），所述软骨内的过程中，以及读出的重要信号转导途径可以利用12,17。此外，携带功能丧失的等位基因的小鼠可以用于确定所需的信号传导途径。目前，还没有其他脊椎动物模型生物体允许这样的各种遗传技术来探测这个过程的基本潜在生物学。
此外，虽然其它优秀模型骨骼修复已经开发并已经在使用了一段时间，另一种情况下，测试支架，化合物和细胞疗法考虑肋修复的功能可能是有益的。的标准肋修复模型的建立补充现有模型作为肋条不需要支持体和修复没有出现稳定。此外，骨膜修复的贡献可以容易地评估。 Futhermore，因为肋具有两个软骨和骨片段，这些不同的但相关的组织类型的愈合之间的比较可识别的有效修复18的共同特征。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) | Fine Science Tools | 15000-04 | curved tip is beneficial |
| Micro-scalpel 5.0 mm | Fine Science Tools | 10315-12 | other fine scalpels can be substituted |
| Dumont 55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | adjustability is convenient |
| Micro-needle holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best | Ethicon | 2819G or similar | taper point best but reverse cutting is also good |
| 7.0 prolene sutures (Prolene) | Ethicon | 8700H or similar | 6-0 can be used too, needle point can vary |
| Large forceps (Adson Forceps) | Fine Science Tools | 11006-12 | other brands are fine |
| Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) | Akorn | 17478-062-35 | |
| Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) | Abbot | 32046-01 | has excellent working time |
| Shaver | Wahl | 9918-6171 or similar | |
| Clamp lamp | Zoo Med | LF-5 | |
| Infrared Bulb, 75W | Zoo Med | RS-75 | |
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbot | 05260-05 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Betadine | Purdue Frederick | 67618015017 | |
| Flavored Gelatin, raspberry | Jell-O | B000E1FYL0 | made up firm, to the consistency of 'jigglers' |
References
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