Et kirurgisk indgreb for resektion musen Rib: En model for storstilet lang knogle Repair

Abstract

Denne protokol indfører forskere til en ny model for storstilet knoglereparation udnytte musen ribben. Proceduren beskriver følgende: forberedelse af dyret til operation, åbning af thorax krop væg, og udsætter den ønskede ribben fra de omkringliggende mellemsiddende muskler, udskære det ønskede udsnit af ribben uden at fremkalde en pneumothorax, og lukke indsnit. Sammenlignet med knoglerne i appendicular skelet, ribbenene er meget tilgængelige. Desuden er det ikke nødvendigt intern eller ekstern fiksator da de tilstødende ribber giver en naturlig fiksering. Operationen bruger kommercielt tilgængelige forsyninger, er ligetil at lære, og veltolereret af dyret. Proceduren kan udføres med eller uden fjernelse af omgivende periosteum, og derfor bidrag periosteum til reparations- kan vurderes. Resultaterne indikerer, at hvis periosteum bevares, forekommer robust reparation i 1 - 2 måneder. Vi forventer, at brugen af ​​denne protokol vilstimulere forskning i rib reparation og at resultaterne vil lette udviklingen af ​​nye måder at stimulere knogle reparation i andre steder i kroppen.

Introduction

Invaliderende skeletal skade, kronisk slidgigt, og de alvorlige problemer, der er forbundet med rekonstruktionskirurgi påvirke den økonomiske produktivitet, familiens trivsel, og livskvalitet. Mens små pauser og læsioner kan helbrede ganske godt, mennesker ikke er i stand til at reparere store fejl, og derfor må stole på rekonstruktive procedurer til at genoprette struktur og funktion. Genopbygning kan involvere allogene eller heterogeneic transplantater, morcellized knogle, implanterede scaffolds eller distraktionsosteogenese. Desværre er det ikke alene er der persistente sygelighed faktorer forbundet med disse behandlinger, men den oprindelige styrke af den reparerede ben sjældent opnås. Således er der behov for nye kliniske tilgange.

En-måde at udvikle innovative metoder til at behandle segmentdefekter er at studere situationer, hvor store reparation forekommer naturligt. Padder berømt kan regenerere skelet elementer, mens pattedyr anses begrænset i ther evne. Men da den tidlige del af det 20. ^århundrede, et par rapporter om regenerering i den menneskelige ribben er blevet offentliggjort tyder på, at mennesker ikke kan være så begrænset ^1-4. I øjeblikket dette fænomen er bedst kendt af plastikkirurger, der bruger rib materiale til kæbe, ansigt og øre genopbygning, men det er ikke mere bredt værdsat ^5. For at undersøge denne reparation nærmere, har vi udviklet en kirurgisk model ved hjælp af musen. Ved hjælp af denne protokol, kan forskerne identificere de medfødte faktorer involveret, og bruge disse oplysninger til at lette skelet healing andre steder.

Der er mange fordele ved at bruge ribberne som en model til at studere skeletal reparation. Først de omgivende ribber giver en naturlig fikseringsindretning (sammenlignet med resektion af femur ^6,7). Dette nedsætter sygelighed risikoen for interne og eksterne fikseringsindretninger og forenkler den kirurgiske procedure. Det andet den tynde muskuløse lag af brystet wall give nem adgang og fremragende udsyn, der gør analysen sammenlignes med bekvemmeligheden ved calvariale resektioner ^8. For det tredje, i modsætning til Calvariaene som danner ved intramembranous ossifikation ribberne form ved endochondral ossifikation og vokse i længden via forlængelse ved vækstzoner placeret ved hver ende af en central diafyse. Derfor kan reparation af ribbenene være mere sammenlignelig med reparation af de lange knogler i appendicular skelet. Endvidere har vi fundet, at i forhold til lårbenet, periosteum af ribben er tykkere og lettere kan manipuleres. Således kan forskere, som ønsker at analysere knoglereparation med henblik på at studere periosteum eller testcellen terapier, farmakologiske midler og / eller vævsstilladser finde denne kirurgiske model nyttig. Sammenfattende er dette ribben resektion model giver en sammenhæng, til at studere naturlige store knogle reparation hos pattedyr som sådan model i almindelig brug i dag eksisterer.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer er i overensstemmelse med et dyr protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Southern California.

1. Forberedelse til operation

1. Læg de nødvendige kirurgiske værktøjer og forsyninger (steriliseret, genstande 1 - 18 i Materialer liste) og arrangere et dissektionsmikroskop og en fiber optik trans-lampe i en hætte eller en downdraft bord.
2. Placer en kønsmodne mus (20 - 30 g, 1 - 3 måneder gammel) i en induktion kammer med 4% isofluran at inducere anæstesi.
3. Bekræft anæstesi med en pote og / eller hale knivspids test.
4. Påfør salve til musens øjne til at undgå øjet tørhed under operationen.
5. Flyt musen til mikroskopbordet. Placer musen ind i næsen kegle af vedligeholdelsen slange og placere sideværts. Giv en opvarmning pose ved siden af ​​dyret for at hjælpe med at opretholde kroppens temperatur.
   IKKEE:. Placering af musen er afhængig af personlige præferencer og / eller håndethed af kirurgen, enten venstre eller højre side er fint.
6. Juster isofluran til 2 - 3% for vedligeholdelse, og se vejrtrækning.
7. Injicer buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutant (lateral flanke af benet) til post-kirurgi smerter med en 25 G nål. Benet kan spjæt, som er en normal reaktion.

2. Åbning Incision

1. Detect den ønskede ribben ved palpation, og rydde området af hår med en barbermaskine.
   BEMÆRK: Ribs 8-10 anbefales, da ribberne 1-7 er tættere på lungerne og 11-13 er betydeligt kortere. Optælling ribbenene skal begynde med det mest rostrale rib som nummer 1.
2. Forbered området med skiftevis povidon-iod og isopropanol (70%) pensling (3x er ofte anbefalet af anvendelsen af ​​dyr protokoller).
3. Skær en 2 cm incision gennem huden direkte over og parallelt med den ønskede ribbe med mellemstore mikrokirurgi saks. Incise gennem de underliggende muskel og fedt lag.
4. Anbring alle 3 lag (hud, muskel, fedt) i en retraktor for at blotlægge det kirurgiske område, og samtidig minimere størrelsen af ​​snittet.

3. udtagelse af Rib

1. Skær gennem mellemsiddende muskler overliggende det ønskede udsnit af ribben med et 5,0 mm skalpel. Anbring dette indsnit omkring 5 mm proximalt til chondrocostal fælles som dette er hvor ribben er ikke så stærkt buet. Adskil forsigtigt muskel fra knoglen med fin spids pincet.
2. For at oprette en resektion samtidig bevare periosteum i dyret, skære gennem periosteum, langs længden af ​​ribben med en 5,0 mm skalpel. Adskil forsigtigt periosteum fra den underliggende knogle sideværts med fin spids pincet. Udvis forsigtighed, da periost er meget sart og har en geléagtige konsistens.
3. Næste gøre et tværsnit gennem knoglen ved den ene ende med fine mikrosakse. Hvis det er nødvendigt, måle resektion meden reticle i mikroskop eller en lineal typen gauge. Løft derefter forsigtigt knoglen ud af periosteum og skær den anden ende.
   BEMÆRK: Udvis forsigtighed. Dette er den mest delikate skridt, som trækker op uden udtagelse af ribben nedenfor vil rive pleural membran og resultere i en pneumothorax. Hvis pleural membran rives dette vil være umiddelbart indlysende som det indre af brysthulen bliver synlige.
4. Hvis blødning opstår som et resultat af at skære benet, lægge pres på den afskårne ende med en vatpind for 4. - 5. sek for at stoppe blødningen.
   BEMÆRK: I de sjældne tilfælde, at blødningen fortsætter, kan det være nødvendigt at stoppe op og aflive dyret så betydelige blodtab vil kompromittere genvinding (uden væske udskiftning, den maksimale blodvolumen der kan sikkert være tabt, er 10% af den samlede blodvolumen eller 7.7 -. 8 pl / g For en 25 g mus, svarer dette til omkring 180-200 pi ^9).
5. Umiddelbart placere fjernet ribben ind4% PFA til fremtidig analyse.
   BEMÆRK: Hvis resektion af både knogle og periosteum skal udføres udelade periosteum indsnit og separation (trin 3.2). Da periosteum er meget tæt knyttet til pleural membran gå forsigtigt, drille ribben væk fra pleura membran med pincet for at undgå at rive.

4. Lukning Snittet

1. Suturere mellemsiddende muskler over toppen af ​​den resterende periosteal ærme med 9-0 suturer (2 suturer er normalt tilstrækkeligt). Placer suturerne direkte over de afskårne ender af ribben, for at fungere som indikatorer for kirurgi placering.
2. Fjern retraktoren. Suturere overliggende muskler og fedt med 9-0 suturer (3 - 4 suturer er normalt tilstrækkeligt). I mus med særligt tykke lag af muskler og / eller fedt, sutur hvert lag separat (f.eks 1 lag suturer for muskulære lag og 1 lag suturer for fedtlaget).
3. Lukhuden med 7-0 suturer (4 - 5 suturer er normalt tilstrækkeligt).
4. Fastgør snittet med sutur lim, klemme kanterne sammen med store pincet.
5. Langsomt afvænne musen off isofluran ved først at justere til 1% for få minutter og derefter slukke.
6. Placer musen under en varmelampe og forlade indtil bevidstheden genvindes, 5 - 10 min. Efter bevidsthed er genvundet og i hele helingsperioden, skal musen flytte og ambulate normalt og viser ingen tegn på lidelse.

5. Inddrivelse og Analyse

1. Giv postoperativ smertebehandling, herunder administration af buprenorphin i en oral gelatine form ved 0,5 mg / kg hver 12. time i 48 timer. Oral administration kræver ikke fastholdende dyret, der kan forårsage smerte thorax region.
2. Bevar musen i et bur med fri adgang til foder og vand i helingsperioden. Efter indsnit er tør, hundyr kan co opstaldet mens mandliges skal forblive isoleret til at forhindre slagsmål.
3. Efter helingsperioden Følg den godkendte procedure for eutanasi. Fjern brystkassen til fiksering og analyse.

Representative Results

Dyr komme sig typisk hurtigt fra denne procedure, snittet heler godt, og dyrene udviser normal adfærd. Proceduren anvender kommercielt tilgængelige forsyninger, og efter praksis, kan være afsluttet i under 1 time. Før denne procedure til at generere eksperimentelle data er det vigtigt at analysere resektion på dag 0 tidspunkt at bestemme, om nogen store knoglefragmenter kan forblive inden for resektion zone. En måde at vurdere en ordentlig procedure er at vurdere dyrene ved røntgenundersøgelse eller microCT imaging postoperativt, selv om dette vil typisk kræve særlige stråling sikkerhedsgodkendelser. I stedet kan en anden simpel vurdering være afsluttet ved at udføre en skelet farvning præparat som illustreret i figur 1A. Dette indebærer indsamling af brystkassen, fastsættelse det i EtOH, og farvning med alizarin rød ved hjælp af en standard-protokol ^11. Det kan være nyttigt at udelade kaliumhydroxid (bruges til at fordøje væk det bløde væv), så that prøven kan stadig anvendes bagefter til histologisk analyse, hvis det ønskes. Prøven kan stadig visualiseres uden kaliumhydroxid trin ved at fjerne i 80% glycerol, fordi den overliggende kropsvæg muskel lag er tyndt. Eller alternativt kan disse muskler fjernes manuelt før fiksering / farvning som det er vist her (figur 1A).

Den del af knoglen fjernet, kan også analyseres. Hvis målet var at fastholde periosteum i dyret, skal knoglen del har en glat overflade, som visualiseret ved lysmikroskopi og histologisk analyse (figur 1B, B '). En knogle portion fjernes med periosteum skal have en udpræget ujævn overflade og ved histologisk undersøgelse har en intakt overliggende periosteal lag, som har karakter af et tæt uregelmæssigt bindevæv (figur 1C, C ').

Afhængigt af formålet med forsøget, kan healing værevurderet på forskellige tidspunkter. Observationer viser, at 3 mm resektioner hvor periosteum tilbageholdes i dyret typisk helbrede fuldstændigt inden for 1 - 2 måneder. Reparation sker via dannelsen af ​​en blød og hård callus, og remodeling. Et eksempel på fuldstændig reparation 2 måneder er vist i figur 2A, A '; reparation kan vurderes ved skeletal fremstilling (figur 2A) og histologisk analyse (figur 2A). Hvis periosteum også fjernes, resektion hul aldrig udfyldt. Figur 2B viser et eksempel, hvor nogle reparation er opstået ved den ene ende, men det er mere typisk at iagttage stumpe ender. Ved histologisk analyse, er resektion zone fyldt med adipose granulationsvæv og musklen (figur 2B).

(A) Illustration af en ribbe resektion (4,5 mm) opsamlet umiddelbart efter operationen. Ingen knoglerester er efterladt. Prøven blev farvet med alizarin rød (ved hjælp af en standard-protokol, men udelade skridt med kaliumhydroxid til at bevare prøven for fremtidig histologisk analyse) og ryddet i 80% glycerol. Pilespidser angiver placeringen af ​​de afskårne ender. (B) fjernede ribbedel fra brystkassen afbildet i (A) uden periosteum fastgjort. (B ') histologisk snit, der viser minimal periosteum fastgjort til knoglen (gule pilespidser venstre) og ingen periosteum til højre (tværsnit farvet med hematoxylin og eosin). Den gule stjerne angiver knoglemarven hulrum. Mus ribben ikke har omfattende trabekler. (C) fjernede ribbedel viser periosteum stadig fastgjort. (C ') histologisk snit shofløj det intakte periosteum overliggende knoglen angivet ved en gul beslag (længdesnit, farvet med hematoxylin og eosin). En gul stjerne angiver knoglemarven hulrum. Scale bars: A, B, C = 1 mm; B ', C' = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2. Rib reparation efter helbredelse i resektion med og uden periosteum. (A) Skeletal præparat efter ~ 2 måneders heling efter resektion, bevarer det intakte periosteum i musen (fremstillet som i figur 1A). Kan observeres Komplet reparation af regionen. (A ') histologisk snit B viser en genoprettelse af den lamellare knogle vægge ogknoglemarv hulrum (hematoxylin og eosin). (B) Skeletal forberedelse (alizarin red) efter ~ 3 måneders heling efter fjernelse både en ribbedel og det omkringliggende periosteum. Der var kun minimal reparation ved den afskårne ende er vist i venstre side af panelet. En gul Arrowhead peger på chondrocostal joint. (B ') Histologisk afsnit af B viser granulationsvæv, fedtvæv, og muskelceller udfylde i stedet for resektion (hematoxylin og eosin). Scale barer: A, B = 1 mm; B '= 500 um; C '= 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Når først lære denne protokol, bestemme hvor den skal finde den oprindelige snit kan være udfordrende. , Hjælper dog praksis på aflivet mus kirurgen lære hvor du skal placere den oprindelige snit og udsætte den ønskede ribben skal resekteres. Arbejde på kadavere forbedrer også de fine-motoriske færdigheder, der kræves for at fjerne ribbedel med eller uden periost. Desuden kan en ny person til denne procedure finde manipulere de fine værktøjer og tynde suturer at være vanskeligt. Mens binde off, overskydende trække suturen kan rive væv. Således kunne nogle praksis suturering også på kadavere være nyttig. Endelig, hvis kirurgen er nye kirurgiske procedurer med gnavere, kan det være nyttigt at have en anden person hjælpe med at overvåge og justere anæstesi i de første få operationer.

Det mest kritiske trin i denne protokol er udtagelse af knoglen uden at fremkalde en pneumothorax (en unormal samling af luft i pleural space), som er vanskelig at behandle i musen eftersom pleural membran er for tynd til at lukke kirurgisk. Laget af muskel- og parietale pleura ringere ribben er meget tynd og delikat; Derfor er præcise bevægelser kræves for at forhindre en punktering i pleural membran, der ligger under resektion område. Dette sker oftest i trin 3.1 og 3.3. I trin 3.1 (adskillelse af knogle fra de omkringliggende mellemsiddende muskler), vil den skarpe skalpel og pincet nemt gennembore pleural lag, hvis det punkt ikke holdes overfladisk. I trin 3.3 (udskære knogle med fine mikrosakse), kan placeringen af ​​saksen beneath knoglen kan overvinde trækstyrke pleural membran eller virkningen af ​​at bryde knogle forårsage enden af ​​knoglefragment at perforere pleural membran. Vi har fundet, at anvendelse af fine mikrosakse, der har en buet spids er gavnligt. Hertil kommer, som ovenfor, kan det også være nyttigt at første praksis protokollen om aflivet mus. Ultiende, men vi har fundet, at dette problem kan overvindes let med tålmodighed og praksis.

Selvom ribben er en endochondral knogle, kan der være nogle potentielt vigtige forskelle mellem skelet ribben og de lange knogler i appendicular skelet. Fra et embryologisk perspektiv skelet ribben afledt fra en anden mesodermal rum (somit) end appendicular skelet (lateral plade mesoderm) ^12. Det er således muligt, at der er egenskaber, der er unikke for ribben skelet forfædre, der afspejler denne forskel i udviklingshistorie. Derfor, i det lange løb, kan det være nødvendigt at afgøre, hvad disse unikke egenskaber er, og derefter bruge disse oplysninger til at tilskynde forfædre i skelet lemmet at mægle reparation med det samme anlæg som det ses i ribben.

Et andet aspekt, der kommer i spil vedrører placeringen af ​​ribberne i forhold til det respiratoriske system. Alselvom de flankerende ribber giver tilstrækkelig stabilitet omkring resektion, således at der er behov for nogen ekstern fiksator, reparation zone er under konstant bevægelse og stamme lunge inflation / deflation. Det er blevet erkendt, at under knoglereparation, kan for meget bevægelse være hæmmende for healing, mens en vis bevægelse synes at være vigtigt til generering af et brusk mellemliggende ^13,14. På dette tidspunkt, er det ikke klart, men det er muligt, at dannelsen af ​​en brusk mellemprodukt kan være et vigtigt skridt for effektiv stor-skala reparation. Således kan bevægelse af ribberne under respiration lette reparation (når periosteum er efterladt i dyret). Da bevægelse kan være særlig vigtigt i denne sammenhæng, at udvikle en metode til at placere en fiksator kan være nyttige for at studere de biomekaniske påvirkninger på reparation i fremtiden.

Ved at udføre en ribbe reparation assay i mus, kan man drage fordel af stærke genetiske værktøjer, der er developed. For eksempel ved hjælp af transgene mærker, oprindelsen af ​​reparation celler kan vurderes. Transgene reportere for knogledannelse (interessante nye værktøjer i udviklingen fra Gazit et al. ^15,16), den endochondral proces, og udlæsningen vigtige signaltransduktionsveje kan udnyttes ^12,17. Derudover kunne mus, der bærer tab-af-funktion alleler anvendes til at bestemme de signalveje, der er nødvendige. I øjeblikket er der ingen andre hvirveldyr model organisme giver en bred vifte af genetiske teknikker til at undersøge den grundlæggende underliggende biologi denne proces.

Desuden, mens andre fremragende modeller for skeletal reparation er blevet udviklet og har været i brug i nogen tid, at en anden sammenhæng teste scaffolds, forbindelser og celleterapi overvejer funktionerne i ribben reparation kan være gavnligt. Etableringen af ​​en standard rib reparation model supplerer eksisterende modeller ribbenene ikke er forpligtet til at støtte kroppen og reparationforekommer uden stabilisering. Desuden kan bidrag periosteum til reparationen let vurderes. Futhermore, fordi ribbe har både brusk og knogle segmenter kan sammenligninger mellem heling af disse forskellige, men beslægtede vævstyper identificere et fælles træk for effektiv reparation ^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'