Et kirurgisk inngrep for Resecting Mouse Rib: En modell for Large-Scale Long Bone Repair

Abstract

Denne protokollen introduserer forskere til en ny modell for storskala bein reparasjon utnytte musen rib. Fremgangsmåten beskriver følgende: fremstilling av dyret etter kirurgi, åpning av thorax kroppsveggen, utsette den ønskede ribbe fra de omkringliggende interkostalrom muskler, excising den ønskede delen av ribben uten å indusere en pneumothorax, og lukker snittene. Sammenlignet med bein av appendicular skjelett, ribbeina er svært tilgjengelig. I tillegg er det ikke nødvendig med intern eller ekstern fiksaturen siden de tilstøtende ribber gir en naturlig fiksering. Operasjonen bruker kommersielt tilgjengelige forsyninger, er grei å lære, og godt tolerert av dyret. Fremgangsmåten kan utføres med eller uten å fjerne den omgivende periosteum, og således bidrag av periosteum til reparasjon kan vurderes. Resultatene tyder på at hvis periosteum bibeholdes, oppstår robust reparasjon i 1 - 2 måneder. Vi forventer at bruken av denne protokollen vilstimulere forskning på rib reparasjon og at funnene vil lette utviklingen av nye måter å stimulere bein reparasjon i andre steder rundt om i kroppen.

Introduction

Ødeleggende skjelettskader, kronisk slitasjegikt, og de alvorlige problemene forbundet med rekonstruktiv kirurgi påvirke økonomisk produktivitet, familie trivsel og livskvalitet. Mens små pauser og lesjoner kan helbrede ganske godt, mennesker er ikke i stand til å reparere store defekter og derfor må stole på rekonstruktiv prosedyrer for å gjenopprette struktur og funksjon. Rekonstruksjon kan innebære allogene eller heterogeneic grafts, morcellized bein, implanterte stillas, eller distraksjon Osteogensesis. Dessverre, ikke bare er det vedvarende sykelighet faktorer assosiert med disse behandlingene, men den opprinnelige styrken av reparert benet er sjelden oppnådd. Dermed er nye kliniske tilnærminger nødvendig.

En måte å utvikle innovative metoder for å behandle segmentfeil er å studere situasjoner der storskala reparasjon forekommer naturlig. Amfibier famously kan regenerere skjelettelementer, mens pattedyr anses begrenset i ther evne. Men siden begynnelsen av det ^20. århundre, noen få rapporter om gjenfødelse i menneske ribbe har blitt publisert som tyder på at mennesker ikke kan være så begrenset ^1-4. Foreløpig er dette fenomenet er best kjent av plastiske kirurger som bruker rib materiale for kjeve, ansikt og øre gjenoppbygging, men det er ikke mer bredt verdsatt ^fem. For å studere dette reparasjon i mer detalj, har vi utviklet en kirurgisk modell ved hjelp av musen. Ved hjelp av denne protokollen, kan forskere identifisere de medfødte faktorer involvert og bruke denne informasjonen til å legge til rette for skjelett healing i andre steder.

Det er mange fordeler med å bruke ribbeina som en modell for å studere skjelett reparasjon. Først de omkringliggende ribber gir en naturlig fiksatur (sammenlignet med reseksjon av lårbenet ^6,7). Dette reduserer sykelighet risikoen for interne og eksterne fixators og forenkler den kirurgiske prosedyren. Dernest de tynne muskel lag av bryst wall sørge for enkel tilgang og god sikt som gjør analysen sammenlignes med den praktiske calvarial resections ^8. For det tredje, i motsetning til den calvariae som dannes ved intramembranøse ossifikasjon, ribbene form ved endochondral ossifikasjon og vokser i lengde via forlengelse på vekstplater plassert på hver ende av en sentral diaphysis. Derfor kan reparasjon av ribbeina være mer sammenlignbare med reparasjon av de lange bein i appendicular skjelett. Videre har vi funnet at i forhold til femur, er periosteum av ribben tykkere og lettere kan manipuleres. Således kan undersøkere som ønsker å analysere benreparasjon i den hensikt å studere periosteum eller testing av celleterapier, farmakologiske midler, og / eller vev stillasene finner kirurgisk modell anvendelige. Oppsummert gir denne rib reseksjon modellen en sammenheng som å studere naturlige storskala benreparasjon i pattedyr som ingen slik modell i alminnelig bruk for øyeblikket eksisterer.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer er i samsvar med et dyr protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Southern California.

1. Forberedelse til kirurgi

1. Legg ut de nødvendige kirurgiske verktøy og rekvisita (sterilisert, elementer 1 - 18 i Materials liste) og arrangere en disseksjonsmikroskop og en fiberoptikk trans-lyset i en hette eller på en downdraft tabellen.
2. Plasser en kjønnsmoden mus (20 - 30 g, 1 - 3 måneder gammel) i en induksjonskammeret med 4% isofluran å indusere anestesi.
3. Bekreft anestesi med en labb og / eller hale klype test.
4. Påfør salven til musens øyne å unngå øye tørrhet under operasjonen.
5. Flytte musen til mikroskopet scenen. Plasser musen inn i nesen kjegle av vedlikeholdsslangen og plasser sidelengs. Gi en oppvarming pose ved siden av dyret for å opprettholde kroppstemperaturen.
   IKKEE:. Plassering av musen er avhengig av personlige preferanser og / eller håndbruk av kirurgen, er enten venstre eller høyre side fine.
6. Juster isofluran til 2 - 3% for vedlikehold, og se pustefrekvens.
7. Injiser buprenorfin (0,05 mg / kg) subkutant (laterale flanke av benet) for post-kirurgi smerte med en 25 G nål. Benet kan nappe som er en normal reaksjon.

2. Åpning Innsnitt

1. Oppdage den ønskede rib ved palpasjon, og rydde området av håret med en barbermaskin.
   MERK: Ribs 8-10 er anbefalt siden ribbeina 1-7 er nærmere til lungene og 11-13 er betydelig kortere. Telle ribbeina bør begynne med den mest rostralt rib som nummer 1.
2. Forberede området med vekslende povidon-jod og isopropanol (70%) swabbing (3x er ofte anbefalt av dyr bruk protokoller).
3. Skjær en 2 cm snitt gjennom huden, rett over og parallelt med ønsket rib med mellomstore mikrokirurgi saks. Incise gjennom de underliggende muskel og fett lag.
4. Legg alle tre lag (hud, muskel, fett) til en tilbaketrekkings å eksponere det kirurgiske området, samtidig som størrelsen av snittet.

3. excising Rib

1. Skjær gjennom interkostalrom muskler liggende ønsket del av ribben med en 5,0 mm skalpell. Posisjon denne snitt rundt 5 mm proksimalt for chondrocostal felles som det er her rib er ikke like sterkt buet. Skille nøye muskel fra benet med fin spiss tang.
2. Å skape en reseksjon samtidig beholde periosteum i dyret, skjære gjennom periosteum, langs lengden av rib med en 5,0 mm skalpell. Skille nøye periosteum fra den underliggende bein lateralt med fin spiss tang. Fortsett med forsiktighet, som periosteum er svært delikat og har en geléaktig konsistens.
3. Neste lage et tverrsnitt gjennom benet ved en ende med fine mikro saks. Hvis det er nødvendig, måle reseksjon meden reticle i mikroskop eller en linjal typen måler. Deretter forsiktig løfte beinet ut av periosteum og kuttet den andre enden.
   MERK: Fortsett med forsiktighet. Dette er den mest delikate trinn, som trekker opp uten excising ribben nedenfor vil rive pleural membranen og resulterer i en pneumothorax. Dersom pleural membran rives dette vil være lett synlig som det indre av brysthulen vil bli synlige.
4. Hvis blødningen oppstår som et resultat av å kutte beinet, legge press på den avskårne enden med en bomullspinne for 4-5 sek for å stoppe blødningen.
   MERK: På den sjeldne anledningen at blødningen fortsetter, kan det være nødvendig å stoppe opp og avlive dyret som betydelig blodtap vil kompromiss recovery (uten væske erstatning, er den maksimale blodvolum som trygt kan gå tapt 10% av det totale blodvolum eller 7,7 -. 8 pl / g For en 25 g mus, tilsvarer dette rundt 180-200 mL ^9).
5. Plasser øyeblikkelig fjernet ribben inn4% PFA for fremtidig analyse.
   MERK: Hvis reseksjon av både bein og periosteum skal utføres, utelate periosteum snitt og separasjon (trinn 3.2). Siden periosteum er svært tett knyttet til pleural membran gå forsiktig, ertende ribben unna pleural membran med tang for å unngå at det revner.

4. Lukking av snittet

1. Suturer interkostalrom muskler over toppen av den gjenværende periostal ermet med 9-0 sting (2 sting er vanligvis tilstrekkelig). Plasser suturene direkte over de kappede ender av ribben, for å virke som indikatorer for operasjon sted.
2. Ta av retractor. Sutur liggende muskler og fett med 9-0 sting (3 - 4 sting er vanligvis tilstrekkelig). Hos mus med spesielt tykke lag av muskler og / eller fett, sy hvert lag for seg (f.eks 1 lag sting for muskulære laget og ett lag med sting for fettlaget).
3. Lukkhuden med 7-0 sting (4-5 sting er vanligvis tilstrekkelig).
4. Sikre snittet med sutur lim, klemming kantene sammen med store tang.
5. Sakte avvenne musen av isofluran ved først å justere til 1% for noen minutter, og deretter slå av.
6. Plasser musen under en varmelampe og la til bevissthet er gjenvunnet 5 - 10 min. Etter bevisstheten er gjenvunnet og hele healing periode, bør musen flytte og ambulate normalt og viser ingen tegn til stress.

5. Recovery og analyse

1. Gi postoperativ smertebehandling, samt administrering av buprenorfin i en muntlig gelatin skjemaet på 0,5 mg / kg hver 12. time i 48 timer. Oral administrasjon krever ikke besøksforbud dyret som kan forårsake smerte til thorax-regionen.
2. Opprett musen i et bur med fri tilgang til mat og vann under healing perioden. Etter at snittet er tørr, hunndyr kan være co-huset mens mannligs må være isolert for å hindre slåssing.
3. Etter healing periode, følger den godkjente prosedyre for aktiv dødshjelp. Fjerne brystkassen for fiksering og analyse.

Representative Results

Dyr vanligvis gjenopprette raskt fra denne prosedyren, snittet helbreder godt, og dyrene utviser normal atferd. Fremgangsmåten bruker kommersielt tilgjengelige forsyninger og etter trening, kan være ferdig på under 1 time. Før bruk av denne fremgangsmåten for å generere eksperimentelle data, er det viktig å analysere reseksjon på dag 0 tidspunkt for å bestemme om eventuelle store beinfragmenter kan forbli innenfor reseksjon sonen. En måte å vurdere riktig prosedyre er å vurdere dyrene ved X-ray eller microCT bildebehandling postoperativt, selv om dette vil vanligvis krever spesielle stråling sikkerhetsgodkjenninger. I stedet kan en annen enkel vurdering fullføres ved å utføre en skjelett preparat flekker som illustrert i figur 1A. Dette innebærer å samle brystkassen, fikse det i EtOH, og farging med Alizarin rød hjelp av en standard protokoll ^11. Det kan være nyttig å utelate kaliumhydroksid (brukes til å fordøye bort det myke vevet) så that prøven kan fremdeles brukes etterpå for histologisk analyse om så ønskes. Prøven kan fortsatt bli visualisert uten kaliumhydroksid skritt ved å tømme i 80% glyserol fordi den overliggende kroppsveggen muskellaget er tynt. Eller alternativt kan disse muskler fjernes manuelt før fiksering / farging som er vist her (figur 1A).

Den del av benet fjernes kan også bli analysert. Hvis målet har vært å beholde periosteum i dyret, bør benet parti har en glatt overflate som visualisert ved lysmikroskopi og histologisk analyse (figur 1 B, B '). En beinparti fjernes med periosteum bør ha en utpreget ujevn overflate, og ved histologisk undersøkelse har et intakt periosteal liggende lag, som har egenskapene til en tett uregelmessig bindevev (figur 1C, C ').

Avhengig av målet med eksperimentet, kan healing værevurderes på ulike tidspunkter. Observasjoner tyder på at 3 mm resections der periosteum beholdes i dyret vanligvis leges helt innen 1 - 2 måneder. Reparasjon skjer via dannelsen av et mykt og hardt callus, og ombygging. Et eksempel på en fullstendig reparasjon på 2 måneder er vist i figur 2A, A '; reparasjon kan vurderes ved skjelett preparat (figur 2A) og histologisk analyse (figur 2A). Hvis periosteum blir også fjernet, er reseksjon gapet aldri fylles i. Figur 2B viser et eksempel hvor noen reparasjon har oppstått i den ene ende, men det er mer vanlig å observere butte ender. Ved histologisk analyse, er reseksjon sonen fylt med adipose, granulasjonsvev og muskler (figur 2B).

(A) Illustrasjon av en rib reseksjon (4,5 mm) samles umiddelbart etter operasjonen. Ingen beinrester blir liggende igjen. Prøven ble farget med Alizarin rød (ved hjelp av en standard protokoll, men å utelate noen skritt med kaliumhydroksid å bevare prøven for fremtiden histologisk analyse) og ryddet i 80% glyserol. Pilspisser indikerer plasseringen av de kuttet endene. (B) Fjernet ribbeparti fra brystkassen vist i (A) uten periosteum festet. (B ') Histologisk seksjon som viser minimal periosteum festet til benet (gule pilspisser, venstre) og ingen periosteum til høyre (tverrsnitt, farget med hematoxylin og eosin). Den gule stjernen indikerer benmargshulen. Muse ribbeina ikke har omfattende trabeculae. (C) Fjernet .ribbeparti viser periosteum fortsatt festet. (C ') Histologisk seksjon shovinge intakt periosteum overliggende benet indikeres av en gul brakett (lengdesnitt, farget med hematoxylin og eosin). En gul stjerne indikerer benmargen hulrom. Skala barer: A, B, C = 1 mm; B ', C' = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Rib reparasjon post-healing i resections med og uten periosteum. (A) Skeletal preparat følgende ~ 2 måneder helbredelse etter reseksjon, beholdt intakt periosteum inne i mus (fremstilt som i figur 1A). Fullstendig reparasjon av regionen kan observeres. (A ') Histologisk delen av B viser en restaurering av de lamellære bein vegger ogbenmarg hulrom (hematoxylin og eosin). (B) Skeletal forberedelse (Alizarin rød) etter ~ 3 måneder med healing etter fjerning både en rib del og den omkringliggende periosteum. Det var kun minimal reparasjon på den kappede enden vises til venstre på panelet. En gul pilspiss peker på chondrocostal joint. (B ') Histologisk delen av B viser granulasjonsvev, adipose, og muskelceller fylling i stedet for reseksjon (hematoxylin og eosin). Skala barer: A, B = 1 mm; B '= 500 mikrometer; C '= 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Når først lære denne protokollen, bestemme hvor du skal finne den første innsnitt kan være utfordrende. Men praksis på avlives mus hjelper kirurgen lære hvor du skal plassere den første innsnitt og utsette den ønskede ribben skal resected. Arbeider på kadavre forbedrer også fin-motoriske ferdigheter som kreves for å fjerne rib del med eller uten periosteum. I tillegg kan noen nye til denne prosedyren finne manipulere de fine verktøy og tynne sting for å være vanskelig. Mens binde av, overskudd trekke i suturen kan rive vev. Dermed kan noen praksis suturering også på kadavre være nyttig. Til slutt hvis kirurgen er nytt for kirurgiske prosedyrer med gnagere, kan det være nyttig å ha en annen person bistå med å overvåke og justere anestesi under de første operasjoner.

Den mest kritiske trinn i denne protokollen er excising benet uten å indusere en pneumothorax (en unormal samling av luft i pleural space), som er vanskelig å behandle i mus siden pleural membran er for tynn til å lukke kirurgisk. Laget av muskel og parietal pleura dårligere til ribben er veldig tynn og delikat; dermed er nøyaktige bevegelser som kreves for å hindre punktering i pleural membran som ligger under reseksjon området. Dette skjer oftest i trinn 3.1 og 3.3. I trinn 3.1 (skille bein fra de omkringliggende interkostalrom muskler), vil den skarpe skalpell og pinsett lett pierce pleural lag hvis poenget ikke er holdt overfladisk. I trinn 3.3 (excising benet med fine mikro saks), kan plassering av saksen under benet kan overvinne den strekkfastheten til pleural membran, eller virkningen av å bryte benet føre enden av benfragmentet å perforere pleural membran. Vi har funnet at ved å bruke fine mikro saks som har en buet spiss er fordelaktig. I tillegg, som angitt ovenfor, kan det også være nyttig å først praksis protokollen på avlives musene. Ultilag, men vi har funnet ut at dette problemet kan lett overvinnes med tålmodighet og praksis.

Selv om ribben er en endochondral bein, kan det være noen potensielt viktige forskjeller mellom ribben skjelettet og de lange bein i appendicular skjelett. Fra et embryological perspektiv, er det ribbe skjelettet stammer fra et annet mesodermal rommet (somitt) enn appendicular skjelett (lateral plate mesoderm) ^12. Dermed er det mulig at det er egenskaper som er unike for de rib skjelettstamfedre som gjenspeiler denne forskjellen i utviklingshistorie. Derfor, i det lange løp, kan det være nødvendig å finne ut hva disse unike egenskapene er og deretter bruke denne informasjonen til å oppmuntre forfedrene i lem skjelett å megle reparasjon med samme anlegget som sett i ribben.

Et annet aspekt som kommer inn i bildet gjelder plasseringen av ribbene i forhold til luftveiene. Alskjønt de flankerende ribber gir tilstrekkelig stabilitet rundt reseksjon, slik at ingen ekstern fiksaturen er nødvendig, er reparasjon sone under konstant bevegelse og belastning på lunge oppblåsing / tømming. Det har blitt erkjent at under benreparasjon, kan for mye bevegelse være hemmende for helbredelse mens noen bevegelse synes å være viktig for å generere et mellomliggende brusk ^13,14. Ved dette punktet, er det ikke klart, men det er mulig at dannelsen av en bruskmellomprodukt kan være et viktig skritt for effektiv storskala reparasjon. Dermed kan bevegelsen av ribbeina under respirasjonen rette for reparasjon (når periosteum blir liggende igjen i dyret). Siden bevegelsen kan være særlig viktig i denne sammenheng, å utvikle en fremgangsmåte for å plassere en fiksatur kan være nyttige for å studere de biomekaniske påvirkninger på reparasjon i fremtiden.

Ved å gjennomføre en rib reparasjon analysen i mus, kan man dra nytte av kraftige genetiske verktøy som har vært developed. For eksempel bruker transgene merkene, opprinnelsen til reparasjonscellene kan vurderes. Transgene reportere for beindannelse (interessante nye verktøy i utviklingen fra Gazit et al. ^15,16), den endochondral prosess, og avlesing av viktige signaltransduksjonsveiene kan utnyttes ^12,17. I tillegg kunne mus som bærer tap-av-funksjon lene benyttes for å bestemme de nødvendige signalveier. For tiden, gjør ingen andre virveldyr modellorganisme for eksempel en rekke genetiske teknikker for å undersøke de grunnleggende underliggende biologi av denne prosessen.

I tillegg, mens andre gode modeller for skjelett reparasjon har blitt utviklet og har vært i bruk på en stund, til en annen kontekst teste stillasene, forbindelser, og cellen terapi vurderer funksjonene i rib reparasjon kan være fordelaktig. Etableringen av en standard rib reparasjon modell utfyller eksisterende modeller som ribbeina ikke er pålagt å støtte kroppen og reparasjonskjer uten stabilisering. I tillegg, kan bidraget av periosteum til reparasjon lett kan vurderes. Videre ber fordi ribben har både brusk og bein segmenter, sammenligninger mellom helbredelse av disse ulike men relaterte vevstyper kan identifisere et felles trekk ved effektive reparasjons ^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'