Ett kirurgiskt ingrepp för resektion musen Rib: En modell för storskaliga Lång Bone Repair

Abstract

Detta protokoll introducerar forskare till en ny modell för storskalig benreparation utnyttjar musen revbenet. Proceduren detaljer följande: förberedelse av djuret för operation, öppna bröstkroppsväggen, utsätta den önskade revbenet från de omgivande interkostal muskler, skära den önskade delen av ribban utan att inducera en pneumothorax, och stänga snitten. Jämfört med benen i appendicular skelettet, revbenen är hög tillgänglighet. Dessutom behövs ingen intern eller extern fixa eftersom närliggande ribbor ger en naturlig fixering. Operationen använder kommersiellt tillgängliga leveranser, är enkel att lära sig, och väl tolererad av djuret. Förfarandet kan genomföras med eller utan att ta bort den omgivande benhinnan, och kan därför bedömas bidrag benhinnan till reparation. Resultaten tyder på att om benhinnan behålls, sker robust reparation i 1 - 2 månader. Vi förväntar oss att användning av detta protokoll kommerstimulera forskning om ribb reparation och att resultaten kommer att underlätta utvecklingen av nya sätt att stimulera benreparation på andra platser runt om i kroppen.

Introduction

Försvagande skelettskador, kronisk osteoartrit, och de allvarliga problem som är förknippade med rekonstruktiv kirurgi påverkar ekonomisk produktivitet, familjens välbefinnande och livskvalitet. Medan små pauser och lesioner kan läka ganska bra, människor är inte kapabla att reparera stora defekter och därför måste förlita sig på rekonstruktiv förfaranden för att återställa struktur och funktion. Rekonstruktion kan innebära allogena eller heterogeneic transplantat, morcellized ben, implanterade ställningar, eller distraktion osteogenesis. Tyvärr, inte bara är det långlivade sjuklighet faktorer som är förknippade med dessa behandlingar men den ursprungliga styrkan av den reparerade benet sällan uppnås. Således behövs nya kliniska metoder.

Enkelriktad att utveckla innovativa metoder för att behandla segmentdefekter är att studera situationer där storskaliga reparation förekommer naturligt. Groddjur ökänt kan regenerera skelettelement, medan däggdjur anses vara begränsade i thär förmågan. Men sedan början av ^20-talet, några rapporter om förnyelse i den mänskliga revben har publicerats tyder på att människor inte kan vara så begränsad ^1-4. För närvarande detta fenomen är mest känd av plastikkirurger som använder rib material för käken, ansikte och öron återuppbyggnad, men det är inte mer allmänt uppskattat ^5. För att studera denna reparation mer i detalj, har vi utvecklat en kirurgisk modell med hjälp av musen. Med hjälp av detta protokoll, kan forskarna identifiera de medfödda faktorer inblandade och använda denna information för att underlätta skelett läkning på andra platser.

Det finns många fördelar med att använda revbenen som modell för att studera skelett reparation. Först, de omgivande ribborna ger en naturlig fixa (jämfört med resektion av lårbenet ^6,7). Detta minskar sjuklighet risken för interna och externa fixators och förenklar det kirurgiska ingreppet. För det andra, de tunna muskelskikt bröst wall ge enkel åtkomst och utmärkt sikt vilket gör analysen jämförbar med bekvämligheten med calvarial resektioner ^8. För det tredje, i motsats till kalvarier som bildas genom intramembranös benbildning, revbenen formen av endokondral benbildning och växa i längd via förlängning på tillväxtplattor placerade i vardera änden av en central diafys. Därför kan reparation av revbenen vara mer jämförbar med reparation av de långa benen i appendicular skelettet. Vidare har vi funnit att jämfört med lårbenet, är periostet av ribban tjockare och lättare kan manipuleras. Således kan utredare som vill analysera benreparation i syfte att studera benhinnan eller testa cellterapi, farmakologiska medel, och / eller vävnads byggnadsställningar hitta denna kirurgiska modell användbar. Sammanfattningsvis ger denna ribba resektion modell ett sammanhang där för att studera naturliga storskaliga benreparation hos däggdjur som ingen sådan modell används allmänt för närvarande finns.

Protocol

OBS: Alla förfaranden är förenliga med en djurprotokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Southern California.

1. Förberedelse för kirurgi

1. Lägg ut de nödvändiga kirurgiska verktyg och förnödenheter (steriliserad, artiklar 1-18 i materiallista) och ordna en dissekera mikroskop och en fiberoptiken transbelysningen i en huva eller på ett utsugsbord.
2. Placera en könsmogen mus (20-30 g, 1 - 3 månader gammal) i en induktionskammare med 4% isofluran för att inducera anestesi.
3. Bekräfta anestesi med en tass och / eller svans nypa test.
4. Applicera salva till musens ögon att undvika ögon torrhet under operationen.
5. Flytta musen till mikroskop scenen. Placera musen i noskonen av underhållsslangen och placera i sidled. Ge en värmande påse intill djuret för att upprätthålla kroppstemperaturen.
   INTEE:. Placering av musen är beroende på personliga preferenser och / eller hänthet av kirurgen, är antingen vänster eller höger sida fint.
6. Justera isofluran till 2 - 3% för underhåll, och titta andning.
7. Injicera buprenorfin (0,05 mg / kg) subkutant (lateral flanken av benet) för post-kirurgi smärta med en 25 G nål. Benet kan rycka vilket är en normal reaktion.

2. Öppnande Incision

1. Identifiera önskat revben genom palpation, och rensa området av hår med en rakapparat.
   OBS: Ribs 8-10 rekommenderas eftersom revbenen 1-7 är närmare till lungorna och 11-13 är betydligt kortare. Räkna revbenen bör börja med den mest rostralt resår som nummer 1.
2. Förbered området med omväxlande povidon-jod och isopropanol (70%) badda (3x ofta rekommenderas av djuranvändningsprotokoll).
3. Skär en 2 cm snitt genom huden, direkt ovanför och parallellt med den önskade resår med medelstora mikrokirurgi sax. Incise genom de underliggande muskel- och fettskikt.
4. Placera alla 3 lager (hud, muskler, fett) i en upprullare att exponera det kirurgiska området, och samtidigt minimera storleken på snittet.

3. excising resåren

1. Skär igenom interkostal musklerna liggande önskat avsnitt av revben med en 5,0 mm skalpell. Placera detta snitt runt 5 mm proximalt till chondrocostal leden eftersom det är där resåren är inte lika starkt krökt. Försiktigt separera muskler från benet med fin spets pincett.
2. För att skapa en resektion bibehållen periosteum i djuret, skär genom benhinnan, utmed längden av ribban med en 5,0 mm skalpell. Försiktigt separera benhinnan från det underliggande benet i sidled med fin spets pincett. Fortsätt med försiktighet, eftersom benhinnan är mycket känslig och har en geléartad konsistens.
3. Nästa göra ett tvärsnitt genom benet vid en ände med fina mikro-sax. Om det behövs, mät resektion medett hårkors i mikroskop eller en linjal typ mätare. Sedan försiktigt lyfta benet ur benhinnan och skär den andra änden.
   OBS: Var försiktig. Detta är den mest känsliga steget, som drar upp utan excising ribban nedan kommer att riva den pleura membran och resultera i en pneumothorax. Om pleural membranet rivs detta kommer att vara lätt uppenbara eftersom det inre av brösthålan kommer att bli synliga.
4. Om blödning uppstår som en följd av att skära benet, utöva påtryckningar på den kapade änden med en bomullspinne för 4-5 sek för att stoppa blödningen.
   OBS: På sällsynt tillfälle att blödningen fortsätter, kan det vara nödvändigt att stoppa och avliva djuret som betydande blodförlust äventyrar återhämtningen (utan vätskeersättning, är den maximala volymen blod som säkert kan gå förlorade 10% av den totala blodvolymen eller 7.7 -. 8 pl / g För en 25 g mus, motsvarar detta cirka 180-200 pl ^9).
5. Placera omedelbart bort ribban in4% PFA för framtida analys.
   OBS: Om resektion av både benet och benhinnan är som skall utföras, utelämna benhinnan snitt och separation (steg 3.2). Eftersom benhinnan är väldigt tätt knuten till pleura membran gå försiktigt, retas ribban ifrån pleural membran med pincett för att undvika bristningar.

4. Stänga Incision

1. Sutur interkostal musklerna över toppen av den återstående periosteal ärm med 9-0 suturer (2 suturer räcker vanligtvis). Placera suturerna direkt ovanför de skurna ändarna av ribban, för att fungera som indikatorer för kirurgi läge.
2. Ta upprullningsdonet. Sutur liggande muskler och fett med 9-0 suturer (3-4 suturer räcker vanligtvis). Hos möss med särskilt tjocka lager av muskler och / eller fett, sutur varje skikt separat (t.ex., ett skikt av suturer för muskellager och ett lager av suturer för fettlagret).
3. Stänghuden med 7-0 suturer (4-5 suturer räcker vanligtvis).
4. Säkra snittet med sutur lim, nyper ihop kanterna med stora pincett.
5. Långsamt avvänja musen utanför isofluran genom att först justera till 1% för några minuter och sedan stänga.
6. Placera musen under en värmelampa och lämna tills medvetandet återfås, 5-10 min. Efter medvetandet återfås och under hela läkningsperioden, bör musen flytta och pendla normalt och visar inga tecken på ångest.

5. Återvinning och Analys

1. Ge postoperativ smärtbehandling inklusive administration av buprenorfin i en oral gelatinform vid 0,5 mg / kg var 12 h under 48 timmar. Oral administrering kräver inte hålla tillbaka det djur som kan orsaka smärta till bröstregionen.
2. Behåll musen i en bur med fri tillgång till mat och vatten under läkningsperioden. Efter snittet är torr, honor kan samverka inrymt medan manligas måste förbli isolerat för att förhindra striderna.
3. Efter läkningsperioden, följ den godkända proceduren för dödshjälp. Ta bröstkorgen för fixering och analys.

Representative Results

Djur återhämtar vanligtvis snabbt från detta förfarande, snittet läker väl, och djuren uppvisar normalt beteende. Proceduren använder kommersiellt tillgängliga leveranser och efter praktiken, kan fyllas på under 1 timme. Innan du använder den här proceduren för att generera experimentella data är det viktigt att analysera resektion vid dag 0 tidpunkten för att avgöra om några stora benfragment kan förbli inom resektion zonen. Ett sätt att bedöma korrekt förfarande är att bedöma djuren genom röntgen eller microCT avbildning postoperativt, även om detta skulle dock innebära särskilda strålningssäkerhetsgodkännanden. Istället kan en annan enkel bedömning kompletteras genom att utföra en skelett färgning beredning som visas i figur 1A. Detta innebär att samla bröstkorgen, fixera den i EtOH, och färgning med alizarin red med hjälp av ett standardprotokoll ^11. Det kan vara användbart att utelämna kaliumhydroxid (används för att smälta bort den mjuka vävnader) så that provet fortfarande efteråt kan användas för histologisk analys, om så önskas. Provet kan fortfarande visualiseras utan kaliumhydroxiden steg genom att rensa i 80% glycerol, eftersom det överliggande kroppsväggen muskelskiktet är tunt. Eller alternativt, kan dessa muskler tas bort manuellt före fixering / färgning som visas här (Figur 1A).

Den del av ben avlägsnas kan också analyseras. Om målet var att bibehålla periostet i djuret borde bendelen har en slät yta som visualiserades genom Ijusmikroskopi och histologisk analys (Figur 1B, B '). En skelettdelen avlägsnas med benhinnan bör ha en distinkt trasig yta och vid histologisk undersökning har en intakt liggande periostal skikt, som har karaktären av en tät oregelbunden bindväv (Figur 1C, C ').

Beroende på målet med experimentet, kan healing varautvärderas vid olika tidpunkter. Observationer tyder på att 3 mm resektioner där periostet ligger kvar i djuret läker vanligen fullständigt inom 1-2 månader. Reparation sker via bildning av en mjuk och hård kallus, och remodellering. Ett exempel på fullständig reparation på 2 månader visas i figur 2A, A '; kan bedömas reparation av skelett preparatet (Figur 2A) och histologisk analys (Figur 2A). Om periosteum avlägsnas också, är den resektion gapet aldrig fyllas i. Figur 2B visar ett exempel i vilket vissa reparation har inträffat vid en ände, är det emellertid mer typiskt att observera trubbiga ändar. Vid histologisk analys är resektion zonen fylld med fett, granulationsvävnad, och muskler (Figur 2B).

(A) Illustration av ett revben resektion (4,5 mm) samlas direkt efter operationen. Inga benfragment är kvar. Prov färgades med alizarin red (med hjälp av en standardprotokoll, men utelämna några åtgärder med kaliumhydroxid för att bevara prov för framtida histologisk analys) och rensas i 80% glycerol. Pilspetsar ange läget för de skurna ändarna. (B) Bort ribbdel från bröstkorgen avbildad i (A) utan periosteum fastsatt. (B ') Histologisk avsnitt visar minimal benhinnan fäst vid benet (gula pilspetsar, vänster) och ingen benhinnan till höger (tvärsnitt, färgades med hematoxylin och eosin). Den gula Risken indikerar benmärgen hålighet. Mus revben inte har omfattande trabekelantal. (C) Bortribbparti visar benhinnan fortfarande sitter. (C ') Histologisk avsnitt shovinge den intakta periostet liggande benet indikeras av en gul konsol (längdsnitt, färgades med hematoxylin och eosin). En gul asterisk indikerar benmärgen hålighet. Skalstrecken: A, B, C = 1 mm; B ', C' = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Rib reparation efter läkning i resektioner med och utan benhinnan. (A) Skelett preparat efter ~ 2 månaders läkning efter resektion, behålla intakta benhinnan inuti musen (framställd som i Figur 1A). Kan observeras Komplett reparation av regionen. (A ') Histologisk avsnitt B visar en restaurering av de lamellära ben väggar ochbenmärgshålighet (hematoxylin och eosin). (B) Skelett förberedelser (alizarin red) efter ~ 3 månaders läkning efter borttagning både en ribbparti och den omgivande benhinnan. Det fanns bara en minimal reparation vid den kapade änden visas till vänster på panelen. En gul pilspets pekar på chondrocostal leden. (B ') Histologisk avsnitt B visar granulationsvävnad, fett och muskelceller fylla i platsen för resektion (hematoxylin och eosin). Skala barer: A, B = 1 mm; B '= 500 pm; C '= 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

När de först detta protokoll, bestämma var att lokalisera den initiala snittet kan vara utmanande. Men praxis på euthanized möss hjälper kirurgen lära sig var att placera den initiala snittet och exponera den önskade revben som ska resekeras. Att arbeta på kadaver också förbättrar fina motoriska färdigheter som krävs för att ta bort ribbdel med eller utan benhinnan. Dessutom kan någon ny till detta förfarande hitta manipulera de fina verktyg och tunna suturer vara svårt. Medan knyta av, överflödigt dra suturen kan riva vävnaderna. Således kunde lite övning suturering också på kadaver vara till hjälp. Slutligen om kirurgen är nytt för kirurgiska procedurer med gnagare, kan det vara användbart att ha en annan person hjälpa till med övervakning och justering av anestesi under de första få operationer.

Det mest kritiska steget i detta protokoll är excising benet utan att inducera en pneumothorax (en onormal samling av luft i lungsäcken space), som är svår att behandla i musen eftersom pleura membranet är för tunn för att stänga kirurgiskt. Lagret av muskel- och parietala pleura underlägsen den revbenet är mycket tunn och känslig; därmed är precisa rörelser krävs för att förhindra en punktering i pleura membran som ligger under resektion området. Detta sker oftast i steg 3.1 och 3.3. I steg 3.1 (separera ben från de omgivande interkostalmuskulaturen), kommer den skarpa skalpell och pincett lätt tränga igenom pleura lagret om punkten inte hålls ytlig. I steg 3.3 (excising benet med fina mikro-sax), kan placeringen av saxen nedanför benet kan övervinna draghållfasthet av pleural membran, eller verkan av bryta benet bringa änden av benfragmentet att perforera pleural membran. Vi har funnit att genom att använda fina mikro-sax som har en böjd spets är fördelaktigt. Dessutom, enligt ovan, kan det också vara bra att först praxis protokollet om euthanized möss. Ultiändan, men vi har funnit att detta problem kan lätt övervinnas med tålamod och praxis.

Trots att revbenet är en endokondral ben, kan det finnas vissa potentiellt viktiga skillnader mellan ribb skelettet och de långa benen i appendicular skelettet. Ur en embryologisk perspektiv är ribb skelettet härrör från en annan mesodermal fack (somit) än appendicular skelettet (lateral platta mesoderm) ^12. Således är det möjligt att det finns egenskaper som är unika för ribbskelett stamceller som speglar denna skillnad i utvecklingshistoria. Därför, i det långa loppet kan det vara nödvändigt att bestämma vad dessa unika egenskaper är och sedan använda denna information för att uppmuntra stamfäder i extremiteten skelettet förmedla reparation med samma anläggning som sett i revbenet.

En annan aspekt som kommer in i bilden rör placeringen av ribborna i förhållande till andningssystemet. Aläven om de flankerande revben ger tillräcklig stabilitet runt resektion så att ingen extern fixa behövs, är reparationsområdet under ständig rörelse och stam av lung inflation / deflation. Det har konstaterats att under benreparation, kan för mycket rörelse vara hämmande för läkning medan vissa rörelser verkar vara viktigt för att generera en broskmellan ^13,14. Vid denna punkt, är det inte klart, men det är möjligt att bildning av en brosk intermediär kan vara ett viktigt steg för effektiv storskalig reparation. Således kan förflyttning av revbenen under andning lätta reparation (när benhinnan är kvar i djuret). Eftersom rörelsen kan vara särskilt viktigt i detta sammanhang, att utveckla en metod för att placera en fixering kan vara användbar för att studera de biomekaniska influenser på reparation i framtiden.

Genom att utföra en assay ribba reparation i mus, kan man dra fördel av kraftfulla genetiska verktyg som har developed. Till exempel använder transgena märken, kan bedömas ursprung reparationscellerna. Transgena reportrar för benbildning (intressanta nya verktyg i utvecklingen från Gazit et al. ^15,16), den endokondral processen, och avläsning av viktiga signaltransduktionsvägar kan utnyttjas ^12,17. Dessutom kunde möss som bär förlust-av-funktion alleler användas för att bestämma de signalvägar som behövs. För närvarande tillåter ingen annan vertebrat modellorganism ett så brett spektrum av genetiska tekniker för att sondera den grundläggande underliggande biologi av denna process.

Dessutom medan andra utmärkta modeller för skelett reparationer har utvecklats och har varit i bruk under en längre tid, till ett annat sammanhang testa byggnadsställningar, föreningar och cellterapier väger funktionerna i ribb reparation kan vara fördelaktigt. Inrättandet av ett standardribbreparationsmodell kompletterar befintliga modeller som revbenen inte är skyldiga att stödja kroppen och reparationsker utan stabilisering. Dessutom kan bidrag benhinnan till reparationen lätt bedömas. Futhermore, eftersom resåren har både brosk och ben segment, jämförelser mellan läkning av dessa olika men besläktade vävnadstyper kan identifiera ett vanligt inslag i en effektiv reparation ^18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'