Abstract
Ce protocole introduit chercheurs à un nouveau modèle de grande échelle réparation osseuse en utilisant la nervure de la souris. La procédure indications suivantes: préparation de l'animal pour la chirurgie, l'ouverture de la paroi thoracique du corps, l'exposition de la nervure souhaitée dans les muscles intercostaux environnantes, excision de la section de nervure souhaitée sans provoquer un pneumothorax, et la fermeture des incisions. Par rapport aux os du squelette appendiculaire, les nervures sont très accessibles. En outre, aucun fixateur interne ou externe ne est nécessaire étant donné que les nervures adjacentes fournissent une fixation naturelle. La chirurgie utilise commercialement fournitures disponibles, est simple à apprendre, et bien toléré par l'animal. La procédure peut être réalisée avec ou sans enlever le périoste environnant et donc la contribution du périoste de réparation peut être évaluée. Les résultats indiquent que si le périoste est retenu, la réparation robuste se produit dans 1-2 mois. Nous nous attendons à ce que l'utilisation de ce protocolestimuler la recherche sur la réparation des côtes et que les conclusions faciliteront le développement de nouveaux moyens de stimuler la réparation osseuse dans d'autres endroits à travers le corps.
Introduction
Débilitante blessures squelettiques, l'arthrose chronique et les problèmes graves associés à la chirurgie reconstructive impact sur la productivité économique, bien-être familial, et la qualité de vie. Bien que de petites pauses et des lésions peuvent guérir assez bien, les humains ne sont pas capables de réparer des défauts importants et doivent donc compter sur les procédures de reconstruction pour restaurer la structure et la fonction. Reconstruction greffes allogéniques peut impliquer ou heterogeneic, os morcellized, échafaudages implantés, ou de distraction ostéogenèse. Malheureusement, non seulement il ya des facteurs persistants de morbidité associés à ces traitements, mais la force originale de l'os réparé est rarement atteint. Ainsi, de nouvelles approches cliniques sont nécessaires.
Un moyen de développer des méthodes innovantes pour traiter les défauts segmentaires est d'étudier les situations dans lesquelles la réparation à grande échelle se produit naturellement. Amphibiens célèbre peut régénérer éléments squelettiques, tandis que les mammifères sont considérées comme limitées dans eest la capacité. Cependant, depuis le début du 20 e siècle, quelques rapports de la régénération de la nervure humaine ont été publiées suggérant que les humains ne peuvent pas être limitées 1-4. Actuellement ce phénomène est mieux connu par les chirurgiens plasticiens qui utilisent des matériaux de nervure pour la reconstruction mâchoire, le visage et l'oreille, mais il ne est pas plus largement appréciée 5. Afin d'étudier cette réparation plus en détail, nous avons développé un modèle chirurgicale en utilisant la souris. En utilisant ce protocole, les chercheurs peuvent identifier les facteurs innés impliqués et utiliser cette information pour faciliter la cicatrisation osseuse dans d'autres endroits.
Il ya plusieurs avantages à utiliser les nervures comme un modèle pour l'étude de la réparation du squelette. Tout d'abord, les nervures entourant fournissent un fixateur naturel (par rapport à la résection du fémur 6,7). Cela diminue le risque de morbidité des fixateurs internes et externes et simplifie la procédure chirurgicale. Deuxièmement, les couches musculaires minces des wa poitrinell prévoir un accès facile et une excellente visibilité qui font le test comparable à la commodité de la voûte du crâne résections 8. Troisièmement, contrairement à la calottes qui forment par ossification dermique, la forme de nervures par ossification endochondrale et croître en longueur via l'extension à plaques de croissance situés à chaque extrémité d'une diaphyse central. Par conséquent, la réparation des nervures peut être plus comparable à la réparation des os longs du squelette appendiculaire. En outre, nous avons trouvé que, par rapport au fémur, le périoste de la nervure est plus épais et peut être plus facilement manipulé. Ainsi, les enquêteurs qui souhaitent doser la réparation osseuse dans le but d'étudier le périoste ou de tester des thérapies cellulaires, des agents pharmacologiques, et / ou échafaudages tissulaires peuvent trouver ce modèle chirurgicale utile. En résumé, ce modèle de résection costale fournit un contexte dans lequel l'étude à grande échelle de réparation naturelle de l'os chez les mammifères comme aucun tel modèle d'usage général qui existe actuellement.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures sont conformes à un protocole animale approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Californie du Sud.
1. Préparation pour l'intervention
- Disposez les outils chirurgicaux et les fournitures nécessaires (stérilisée, articles 1 à 18 dans la liste des matériaux) et d'organiser un microscope à dissection et un fibre optique trans-illuminateur dans une hotte ou sur une table aspirante.
- Placez une souris sexuellement matures (20-30 g, 1 - 3 mois) dans une chambre d'induction avec 4% d'isoflurane pour induire une anesthésie.
- Confirmez l'anesthésie avec une patte et / ou un test queue de pincement.
- Appliquer une pommade pour les yeux de la souris pour éviter la sécheresse des yeux pendant la chirurgie.
- Déplacez la souris pour la platine du microscope. Placer la souris dans le cône de nez du tuyau d'entretien et de positionner latéralement. Fournir une poche chauffante adjacente à l'animal pour aider à maintenir la température du corps.
PASE:. Position de la souris dépend de vos préférences personnelles et / ou l'impartialité du chirurgien, côté gauche ou à droite est très bien. - Réglez l'isoflurane à 2-3% pour l'entretien, et de regarder le taux de respiration.
- Injecter la buprénorphine (0,05 mg / kg) sous-cutanée (de flanc latéral de la jambe) pour la douleur post-opératoire avec une aiguille 25 G. La jambe peut secousse qui est une réaction normale.
2. incision d'ouverture
- Détecter la nervure souhaitée par palpation, et nettoyer la zone des cheveux avec un rasoir.
REMARQUE: Ribs 8-10 sont recommandés depuis nervures 1-7 sont plus proches des poumons et 11-13 sont considérablement plus courte. Compter les côtes devrait commencer par la nervure plus rostrale numéro 1. - Préparer la zone avec une alternance de povidone-iode et de l'isopropanol (70%) pistonnage (3x est souvent recommandé par les protocoles d'utilisation des animaux).
- Couper une incision de 2 cm à travers la peau, directement au-dessus et parallèlement à la nervure désirée avec des ciseaux de microchirurgie de taille moyenne. INCISe à travers les couches musculaires et adipeuses sous-jacents.
- Placez tous les trois couches (peau, les muscles, la graisse) dans un enrouleur pour exposer la zone chirurgicale, tout en minimisant la taille de l'incision.
3. excision du Rib
- Couper à travers les muscles intercostaux recouvrant la section désirée de la nervure avec un 5,0 mm scalpel. Position de cette incision autour de 5 mm à proximité de la commune chondrocostale car ce est là la nervure ne est pas aussi forte courbure. Séparez délicatement le muscle de l'os avec pince fine de pointe.
- Pour créer une résection, tout en conservant le périoste chez l'animal, couper à travers le périoste, le long de la longueur de la nervure avec un scalpel 5,0 mm. Soigneusement séparer le périoste de l'os sous-jacent latéralement par pince fine de pointe. Procédez avec prudence, car le périoste est très délicate et a une consistance gélatineuse.
- Suivant faire une coupe transversale à travers l'os à une extrémité avec micro-ciseaux fins. Si nécessaire, mesurer la résectionun réticule dans le microscope ou une jauge de type de règle. Puis soulevez délicatement l'os sur le périoste et couper l'autre extrémité.
REMARQUE: Procédez avec prudence. Ce est l'étape la plus délicate, car tirant sans exciser la nervure ci-dessous va déchirer la membrane pleural et provoquer un pneumothorax. Si la membrane est déchirée pleural ce sera facilement évident que l'intérieur de la cavité thoracique devient visible. - Si le saignement se produit à la suite de la coupe de l'os, appliquer une pression à la fin de coupe avec un tampon de coton-tige pour 4-5 sec pour arrêter le saignement.
NOTE: A l'occasion rare qui saignement persiste, il peut être nécessaire de se arrêter et euthanasier l'animal perte de sang importante et compromettront sa reconstitution (sans remplacement des liquides, le volume de sang maximum qui peut être sans risque être perdu est de 10% du volume total de sang ou 7.7 -. 8 ul / g pour une souris de 25 g, ce qui équivaut à environ 180 à 200 pi 9). - Placer immédiatement la nervure enlevé dans4% PFA pour une analyse ultérieure.
REMARQUE: si la résection à la fois de l'os et le périoste doit être effectuée, omettre l'incision du périoste et de la séparation (étape 3.2). Depuis le périoste est très étroitement attaché à la membrane pleurale procéder avec prudence, taquiner la nervure loin de la membrane pleurale avec des pinces pour éviter les déchirures.
4. Fermeture de l'incision
- Suturer les muscles intercostaux sur le dessus de la douille périoste restant avec sutures 9-0 (2 sutures sont généralement suffisants). Passer les sutures directement au-dessus des extrémités de la nervure de coupe, pour agir comme indicateurs de l'emplacement de chirurgie.
- Retirer l'écarteur. Suturer le muscle sus-jacente et de la graisse avec 9-0 sutures (3-4 sutures sont généralement suffisants). Chez la souris, en particulier avec des couches épaisses de muscle et / ou de la graisse, suturer chaque couche séparément (par exemple, une couche de fils de suture pour la couche musculaire et une couche de fils de suture pour la couche de gras).
- Fermez lepeau avec des sutures 7-0 (4-5 sutures sont généralement suffisants).
- Fixez l'incision avec une suture de la colle, de pincer les bords avec de grandes pinces.
- Sevrer lentement la souris hors isoflurane d'abord se adapter à 1% pendant quelques minutes, puis se éteint.
- Placez la souris sous une lampe de feu et laisser jusqu'à ce que la conscience est retrouvé, 5-10 min. Après reprend connaissance et tout au long de la période de guérison, la souris doit se déplacer et déambuler normalement et ne montrent aucun signe de détresse.
5. Récupération et analyse
- Assurer la gestion de la douleur post-opératoire, y compris l'administration de la buprénorphine sous une forme orale de gélatine à 0,5 mg / kg toutes les 12 heures pendant 48 heures. L'administration orale ne nécessite pas de maîtriser l'animal qui pourrait causer de la douleur à la région thoracique.
- Maintenir la souris dans une cage avec un accès libre à la nourriture et de l'eau pendant la période de guérison. Après l'incision est sec, les animaux femelles peuvent être co-logés tandis que le mâles doit rester isolé pour éviter les combats.
- Après la période de cicatrisation, suivez la procédure approuvée pour l'euthanasie. Retirer la cage thoracique pour la fixation et l'analyse.
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Representative Results
Les animaux sont habituellement récupérer rapidement de cette procédure, l'incision guérit bien, et les animaux présentent un comportement normal. La procédure utilise les fournitures disponibles dans le commerce et après la pratique, peut être complété en moins de 1 h. Avant d'utiliser cette procédure pour générer des données expérimentales, il est important d'analyser la résection au point de temps 0 jour pour déterminer si des grands fragments d'os peuvent rester dans la zone de résection. Une façon d'évaluer la procédure appropriée est d'évaluer les animaux par rayons X ou l'imagerie par microCT postopératoire, même si cela nécessite généralement une autorisation spéciale de radioprotection. Au lieu de cela, un autre simple évaluation peut être complétée par la réalisation d'une préparation de coloration du squelette comme illustré sur la Figure 1A. Cela implique la collecte de la cage thoracique, le fixant dans de l'EtOH, et coloration au rouge d'alizarine utilisant un protocole standard 11. Il peut être utile d'omettre l'hydroxyde de potassium (utilisé pour digérer loin les tissus mous) afin that l'échantillon peut encore être utilisé ensuite pour l'analyse histologique si désiré. L'échantillon peut encore être visualisé sans les étapes d'hydroxyde de potassium en effaçant dans 80% de glycérol parce que la couche paroi musculaire du corps de recouvrement est mince. Ou en variante, ces muscles peuvent être retirés manuellement avant de fixation / coloration comme cela est représenté ici (figure 1A).
La partie de l'os retiré peut également être analysé. Si le but est de conserver le périoste dans l'animal, la partie d'os doit avoir une surface lisse telle que visualisée par microscopie optique et l'analyse histologique (figure 1B, B '). Une partie de l'os enlevé avec le périoste doit avoir une surface nettement en lambeaux et à l'examen histologique ont une couche périostée sus-jacente intacte, ce qui a les caractéristiques d'un tissu conjonctif dense irrégulier (figure 1C, C ').
Selon le but de l'expérience, la guérison peut êtreévaluée à différents moments. Les observations indiquent que les résections 3 mm dans le périoste qui est retenu dans l'animal guérissent généralement complètement à l'intérieur de 1 à 2 mois. Réparation se produit par la formation d'un cal mou et dur, et le remodelage. Un exemple de réparation complète à 2 mois est représentée sur la figure 2A, A '; la réparation peut être évaluée par la préparation du squelette (figure 2A) et l'analyse histologique (figure 2A). Si le périoste est également supprimé, l'écart de résection ne est jamais remplie. La figure 2B montre un exemple dans lequel une certaine réparation est produite à une extrémité, cependant, il est plus typique d'observer des extrémités franches. Lors de l'analyse histologique, la zone de résection est rempli avec adipeux, le tissu de granulation, et le muscle (figure 2B).
Figure 2. Rib réparation post-guérison dans résections avec et sans le périoste. (A) de préparation du squelette qui suit ~ 2 mois de cicatrisation après la résection, en conservant le périoste intact à l'intérieur de la souris (préparé comme dans la figure 1A). Réfection complète de la région peut être observée. (A ') Coupe histologique de B montrant une restauration des murs et l'os lamellairesla cavité de la moelle osseuse (de l'hématoxyline et de l'éosine). (B) la préparation squelettique (alizarine) après ~ 3 mois de la guérison après avoir enlevé la fois une partie de nervure et le périoste environnant. Il y avait seulement des réparations minimes à la fin de coupe montré à la gauche du panneau. A jaune flèche pointe à l'articulation chondrocostale. (B ') de la section B montrant histologique de tissu de granulation, adipeux et les cellules musculaires de remplissage dans le site de la résection (hématoxyline et l'éosine). Barres d'échelle: A, B = 1 mm; B '= 500 um; C '= 200 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Lors de la première apprendre ce protocole, déterminer où trouver l'incision initiale peut être difficile. Cependant, la pratique sur des souris euthanasiés aide le chirurgien apprendre où placer l'incision initiale et exposer la nervure souhaitée à réséquer. Travailler sur des cadavres améliore également les motricité fine requises pour supprimer la partie thoracique avec ou sans le périoste. En outre, quelqu'un de nouveau à cette procédure pourrait trouver manipuler les outils et fines sutures mince pour être difficile. Alors que nouage, l'excès tirant sur le fil de suture peut déchirer les tissus. Ainsi, une certaine pratique suture également sur des cadavres pourrait être utile. Enfin, si le chirurgien est à nouveau interventions chirurgicales sur des rongeurs, il peut être utile de disposer d'une autre personne faciliter le suivi et l'ajustement de l'anesthésie au cours des premières opérations.
L'étape la plus critique de ce protocole est l'excision de l'os sans provoquer un pneumothorax (une collection anormale de l'air dans le spa pleuralCE), qui est difficile à traiter chez la souris depuis la membrane pleurale est trop mince pour fermer chirurgicalement. La couche de muscle et de la plèvre pariétale inférieure à la nervure est très fine et délicate; par conséquent, des mouvements précis sont nécessaires pour empêcher une perforation dans la membrane pleurale qui se trouve sous la surface de résection. Cela se produit le plus souvent dans les étapes 3.1 et 3.3. Dans l'étape 3.1 (séparation de l'os entourant les muscles intercostaux), le scalpel et pince forte pourront facilement percer la couche pleural si le point ne est pas maintenue superficielle. A l'étape 3.3 (excision de l'os par des micro-ciseaux fins), le placement des ciseaux au-dessous de l'os peut surmonter la résistance à la traction de la membrane pleurale, ou l'action de rupture de l'os peut entraîner l'extrémité du fragment d'os à perforer le membrane pleurale. Nous avons trouvé que l'utilisation de micro-ciseaux fins qui ont une pointe recourbée est bénéfique. En outre, comme ci-dessus, il peut aussi être utile de commencer la pratique du protocole sur la souris euthanasiées. Ultide compte, cependant, nous avons trouvé que ce problème peut être facilement surmonté avec de la patience et de la pratique.
Bien que la nervure est un os endochondral, il peut y avoir quelques différences potentiellement importantes entre le squelette thoracique et les os longs du squelette appendiculaire. Du point de vue embryologique, le squelette thoracique est dérivé d'un compartiment de mésodermique différente (somites) que le squelette appendiculaire (latérale mésoderme) 12. Ainsi, il est possible qu'il y ait des propriétés qui sont uniques à la nervure du squelette progéniteurs qui reflètent cette différence dans l'histoire du développement. Par conséquent, dans le long terme, il peut être nécessaire de déterminer ce que ces propriétés uniques sont et ensuite utiliser cette information pour encourager les progéniteurs dans le squelette du membre de médiation réparation avec la même facilité que vu dans la nervure.
Un autre aspect qui entre en jeu porte sur l'emplacement des nervures par rapport à l'appareil respiratoire. Alsi les côtes d'accompagnement assurent une stabilité suffisante autour de la résection de telle sorte qu'aucune fixateur externe est nécessaire, la zone de réparation est en mouvement constant et souche de poumon de gonflage / dégonflage. Il a été reconnu que, lors de la réparation osseuse, trop de mouvement peut être tout inhibiteur de la guérison certain mouvement semble être important pour la génération d'un 13,14 intermédiaire du cartilage. À ce stade, il ne est pas clair, mais il est possible que la formation d'un cartilage intermédiaire peut être une étape clé pour la réparation effective à grande échelle. Ainsi, le mouvement des côtes lors de la respiration pourrait faciliter la réparation (lorsque le périoste est laissé dans l'animal). Comme le mouvement peut être particulièrement important dans ce contexte, l'élaboration d'une méthode pour placer un fixateur pourrait être utile pour étudier les influences biomécaniques sur la réparation à l'avenir.
En effectuant un test de réparation de nervure dans la souris, on peut profiter de puissants outils génétiques qui ont été DEVEpée. Par exemple, en utilisant des marques transgéniques, l'origine des cellules de réparation peut être évaluée. Journalistes transgéniques pour la formation osseuse (nouveaux outils intéressants dans le développement de Gazit et coll. 15,16), le processus endochondrale, et lecture des importantes voies de transduction du signal peuvent être utilisées 12,17. En outre, des souris portant des alleles perte de fonction pourraient être utilisés pour déterminer les voies de signalisation requises. Actuellement, aucun autre organisme modèle vertébré permet une telle variété de techniques génétiques pour sonder la biologie fondamentale sous-jacente de ce processus.
En outre, tandis que d'autres excellents modèles pour la réparation du squelette ont été développés et ont été en usage pendant un certain temps, un autre contexte pour tester des échafaudages, des composés et thérapies cellulaires Compte tenu des caractéristiques de la réparation de nervure peut être bénéfique. La mise en place d'un modèle de réparation de nervure norme complète les modèles existants que les côtes ne sont pas tenus de soutenir le corps et la réparationse produit sans stabilisation. En outre, la contribution du périoste à la réparation peut être facilement évaluée. En outre, les parce que la nervure a la fois le cartilage et les segments d'os, les comparaisons entre la guérison de ces types de tissus différents, mais connexes peuvent identifier une caractéristique commune de la réparation effective 18.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) | Fine Science Tools | 15000-04 | curved tip is beneficial |
| Micro-scalpel 5.0 mm | Fine Science Tools | 10315-12 | other fine scalpels can be substituted |
| Dumont 55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | adjustability is convenient |
| Micro-needle holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best | Ethicon | 2819G or similar | taper point best but reverse cutting is also good |
| 7.0 prolene sutures (Prolene) | Ethicon | 8700H or similar | 6-0 can be used too, needle point can vary |
| Large forceps (Adson Forceps) | Fine Science Tools | 11006-12 | other brands are fine |
| Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) | Akorn | 17478-062-35 | |
| Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) | Abbot | 32046-01 | has excellent working time |
| Shaver | Wahl | 9918-6171 or similar | |
| Clamp lamp | Zoo Med | LF-5 | |
| Infrared Bulb, 75W | Zoo Med | RS-75 | |
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbot | 05260-05 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Betadine | Purdue Frederick | 67618015017 | |
| Flavored Gelatin, raspberry | Jell-O | B000E1FYL0 | made up firm, to the consistency of 'jigglers' |
References
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