Abstract
Этот протокол вводит исследователей к новой модели для широкомасштабного восстановления костей с использованием ребро мыши. Процедура подробно следующий: Получение животного к операции, открывая грудной стенки тела, подвергая желаемого ребро от окружающих межреберные мышцы, вырезая нужную часть ребра, не вызывая пневмоторакс, и закрытие разрезы. По сравнению с костями аппендикулярного скелета, ребра очень доступным. Кроме того, ни один внутренний или внешний фиксатор не является необходимым, так как соседние ребра обеспечивают естественную фиксацию. Хирургия использует имеющиеся в запасы, является простым учиться и хорошо переносится животным. Эта процедура может быть осуществлена с или без удаления окружающих надкостницу, и, следовательно, вклад надкостницы к ремонту могут быть оценены. Результаты показывают, что если надкостница сохраняется, надежный ремонт происходит в 1 - 2 месяца. Мы ожидаем, что использование этого протокола будетстимулировать исследования в грудной ремонта и что результаты будут способствовать развитию новых путей стимулирования восстановления костей и в других местах по всему телу.
Introduction
Debilitating скелетных травм, хронических остеоартрит, и серьезные проблемы, связанные с реконструктивной хирургии влияние на экономические производительности, семейного благополучия и качества жизни. Хотя небольшие перерывы и поражения может исцелить довольно хорошо, люди не могут восстановить большие дефекты и, следовательно, должны полагаться на восстановительные процедуры для восстановления структуры и функции. Реконструкция может включать аллогенных или heterogeneic трансплантатов, morcellized кости, имплантированные лесов, или отвлечение остеогенез. К сожалению, не только там Устойчивые факторы заболеваемости, связанной с этими препаратами, но оригинальный прочность отремонтированного кости редко достигается. Таким образом, новые клинические подходы.
Один способ развивать инновационные способы лечения сегментарных дефектов является изучение ситуации, в которых крупномасштабное ремонт происходит естественно. Амфибии лихо могут регенерировать скелетных элементов, в то время как млекопитающие считаются ограниченными в гоэто способность. Тем не менее, начиная с начала 20-го века, несколько сообщений о регенерации в организме человека ребра были опубликованы предполагая, что люди не могут быть ограничены 1-4 так. В настоящее время это явление является самым известным пластических хирургов, которые используют ребра материал для челюсти, лица и уха реконструкции, но это не более широко оценили 5. Для того, чтобы изучить этот ремонт более подробно, мы разработали хирургического модель с помощью мыши. Используя этот протокол, исследователи могут определить врожденные факторы, влияющие и использовать эту информацию, чтобы облегчить скелетных исцеление в других местах.
Есть много преимуществ в использовании ребра в качестве модели для изучения скелета ремонт. Во-первых, окружающие ребра обеспечивают естественное фиксатор (по сравнению с резекцией бедренной кости 6,7). Это уменьшает заболеваемость риск внутренних и внешних фиксаторов и упрощает хирургическую процедуру. Во-вторых, тонкие мышечные слои грудной клетки вабудете обеспечивать легкий доступ и отличную видимость, которые делают анализ сопоставимы с удобством свода черепа резекции 8. В-третьих, в отличие от calvariae, которые образуются вследствие Intramembranous окостенения, форма ребер по эндохондральной окостенения и расти в длину с помощью расширения при росте пластин, расположенных на обоих концах центрального диафиза. Таким образом, ремонт ребер могут быть более сравнима с ремонта длинных костей скелета аппендикулярной. Кроме того, мы обнаружили, что по сравнению с бедренной кости, надкостницы ребра толще и может быть более легко манипулировать. Таким образом, исследователи, которые хотят для анализа ремонт кости с целью изучения надкостницы или тестирования клеточной терапии, фармакологические препараты и / или тканей лесов могут найти это хирургический шаблон полезным. В целом, это ребро резекция модель обеспечивает контекст, в котором для изучения природных масштабную ремонт кости у млекопитающих, поскольку таких модель общего пользования в настоящее время не существует.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в соответствии с протоколом животных утвержденным уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) при Университете Южной Калифорнии.
1. Подготовка к операции
- Выложите необходимые хирургические инструменты и расходные материалы (стерилизованы, предметы 1 - 18 в списке материалов) и организовать рассекает микроскоп и волоконной оптики транс-осветителя при капюшоном или на столе нисходящего.
- Поставьте половозрелых мышь (20 - 30 г, 1 - 3 месяца) в индукции камеры с 4% изофлуран для индукции анестезии.
- Подтвердите анестезии с лапой и / или испытания хвост щепотку.
- Применять мазь для глаз мыши, чтобы избежать сухость глаза во время операции.
- Наведите указатель мыши на столике микроскопа. Наведите в носовом конусе шланга обслуживания и позиционировать в сторону. Обеспечить потепления пакета, примыкающего к животному, чтобы помочь сохранить температуру тела.
НЕE:. Должность мыши зависит от личных предпочтений и / или беспристрастности хирурга, либо слева или справа от нормально. - Отрегулируйте изофлурана до 2 - 3% для обслуживания, и посмотреть частоту дыхания.
- Вводят бупренорфин (0,05 мг / кг) подкожно (боковое фланг ноги) для послеоперационной боли с иглой 25 G. Нога может дергаться, который нормальная реакция.
Разрез 2. Открытие
- Обнаружить нужную ребро при пальпации, и очистить площадь волос с бритвой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ребра 8-10 рекомендуются, так как ребра 1-7 ближе к легким и 11-13 значительно короче. Подсчет ребра следует начинать с наиболее ростральной ребра как номер 1. - Подготовьте область с чередующимися повидон-йод и изопропанол (70%), моечные (3x часто рекомендуется используют протоколы животных).
- Вырезать 2 см разрез через кожу, непосредственно выше и параллельно желаемой ребра с средних ножницами микрохирургии. Incisе через жиром мышц и жировых отложений.
- Поместите все три слоя (кожи, мышц, жира) в втягивающего подвергать хирургическую область, при сведении к минимуму размер разреза.
3. Акцизирование ребра
- Разрезать межреберных мышц, покрывающих нужный раздел ребра с 5,0 мм скальпелем. Позиция Этот разрез вокруг 5 мм проксимальнее chondrocostal сустава, так как это, где ребра не так сильно искривлено. Аккуратно отделите мышцу от кости с помощью тоненького кончика пинцета.
- Чтобы создать резекции с сохранением надкостницы у животного, прорезать надкостницы, по длине ребра с 5,0 мм скальпелем. Аккуратно отделите надкостницу от основной кости по бокам с помощью тоненького кончика пинцета. Соблюдайте осторожность, так как надкостница очень тонкая и имеет гелеобразную консистенцию.
- Затем сделать поперечное сечение кости на одном конце с мелкими микро-ножниц. При необходимости, измерить резекция ссетка в микроскоп или типа правитель колеи. Затем осторожно поднимите кости из надкостницы и сократить другой конец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность. Это самый деликатный шаг, так как подтягивание без вырезания ребро ниже порвет Мембрана и в результате пневмоторакса. Если Мембрана разрывается, это будет легко видно, как внутренняя часть грудной полости станут видимыми. - Если кровотечение происходит в результате разрезания кости, оказывать давление на обрезанный конец с ватным тампоном в течение 4 - 5 сек, чтобы остановить кровотечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях, что кровотечение продолжается, это может быть необходимо остановить и эвтаназии животных, а значительную потерю крови, снижают восстановление (без замены жидкости, максимальный объем крови, который может быть безопасно быть потеряны составляет 10% от общего объема крови или 7,7 -. 8 мкл / г Для 25 г мыши, это эквивалентно примерно 180 - 200 мкл 9). - Сразу же место снятую ребро в4% PFA для последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если резекция как кости и надкостницы должна быть проведена, опустить надкостницы разреза и разделения (шаг 3,2). С надкостница очень плотно прикреплена к Мембрана действовать осторожно, дразнить ребро от Мембрана щипцами, чтобы избежать разрыва.
4. Закрытие разреза
- Шовный межреберные мышцы поверх надкостницы оставшейся втулки с 9-0 швов (2 нити, как правило, достаточно). Поместите швов прямо над обрезанными концами ребра, чтобы выступать в качестве индикаторов для хирургии месте.
- Снимите ретрактор. Шовный лежащего мышцы и жир с 9-0 швов (3 - 4 нити, как правило, достаточно). У мышей с особо толстыми слоями мышц и / или жира, шов каждый слой отдельно (например, 1 слой швов для мышечного слоя и 1 слой швов для жирового слоя).
- Закрытькожа с 7-0 швов (4 - 5 швы, как правило, достаточно).
- Безопасный разрез с шовного клея, зажимая края вместе с большими щипцами.
- Медленно отучить мышь за пределы ИФ сначала приспособиться к 1% в течение нескольких минут, а затем выключите.
- Наведите под инфракрасной лампой и оставить до сознание не восстанавливается, 5 - 10 мин. После сознание восстанавливается и в течение периода заживления, мышь должна двигаться и передвигаться нормально и не проявляют никаких признаков бедствия.
5. Восстановление и Анализ
- Послеоперационного обезболивания в том числе администрации бупренорфина в устной форме желатиновой на 0,5 мг / кг каждые 12 ч в течение 48 ч. Пероральное введение не требует сдерживания животное, которое может вызвать боль в грудной области.
- Поддержание мышь в клетке со свободным доступом к пище и воде в течение периода заживления. После разрез сухой, самки могут быть совместно размещены в то время мужчиныА должен оставаться в изоляции, чтобы предотвратить боевые действия.
- После периода заживления, следуйте утвержденным Порядком эвтаназии. Удалить грудную клетку для фиксации и анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Животные, как правило, быстро оправиться от этой процедуры, разрез заживает хорошо, и животные обладают нормальное поведение. Процедура использует коммерчески доступные материалы и после тренировки, может быть завершена в соответствии с 1 ч. Перед использованием этой процедуры, чтобы генерировать экспериментальные данные, важно, чтобы проанализировать резекции в день 0 момент времени, чтобы определить, есть ли какие-либо крупные костные фрагменты могут оставаться в зоне резекции. Один из способов оценки надлежащей процедуры заключается в оценке животных от рентгена или томографии microCT после операции, хотя это, как правило, требуют специальных разрешений радиационной безопасности. Вместо этого, еще один простой оценки может быть завершена путем проведения скелетную подготовку окрашивания, как показано на рисунке 1А. Это включает в себя сбор грудную клетку, фиксируя его в этиловом спирте, и окрашивание ализарином красный с использованием стандартного протокола 11. Это может быть полезно, чтобы опустить гидроксид калия (используется для переваривания сторону мягких тканей), так Тат образца все еще может быть использован впоследствии для гистологического анализа, если это желательно. Образец может еще быть визуализированы без шагов гидроксида калия, сняв в 80% глицерина, потому что стенка мышцы вышележащих тело тонкое. Или альтернативно, эти мышцы могут быть удалены вручную до фиксации / окрашивания, как показано здесь (1А).
Часть кости удалены также могут быть проанализированы. Если цель в том, чтобы сохранить надкостницу у животного, часть кости должна иметь гладкую поверхность, как визуализировали с помощью световой микроскопии и гистологического анализа (фиг 1B, B '). Кости часть удалена с надкостницей должны иметь четко рваную поверхность и при гистологическом исследовании имеют интактный лежащего периостальное слой, который имеет характеристики плотной соединительной ткани неправильной (рис 1С, С ').
В зависимости от цели эксперимента, исцеление может бытьоценивали в различные моменты времени. Наблюдения показывают, что 3 мм резекции, в котором надкостницы сохраняется в животном, как правило, заживают полностью в течение 1 - 2 месяцев. Ремонт происходит через образование в мягких и твердых каллуса и ремоделирования. Пример полного ремонта в 2 месяца показано на фиг.2А, '; ремонт может быть оценена с помощью скелетной подготовки (фиг.2А) и гистологического анализа (Фигура 2А '). Если надкостницы также удаляется, разрыв резекции никогда не заполнены. Фиг.2В показан пример, в котором некоторые ремонта произошло на одном конце, однако, более типично для наблюдения тупых концов. После гистологического анализа, зона резекции заполнена жировой, грануляционной ткани, мышцы и (фиг.2В ').
Рисунок 2. Ребро ремонт после исцеления в резекции с и без надкостницы. () Каркасные подготовка после ~ 2 месяцев исцеления после резекции, сохраняя нетронутыми надкостницы внутри мыши (полученного, как на рисунке 1А). Полный ремонт регионе можно наблюдать. (') Гистологическое раздел B, показывающий восстановление пластинчатых стен костей иПолость костного мозга (гематоксилином и эозином). (B) Каркасные подготовка (ализарин красный) после ~ 3 месяцев исцеления после удаления как ребро часть и окружающую надкостницы. Был только минимальное ремонта на обрезанный конец, показанной в левой части панели. А желтые Arrowhead указывает на chondrocostal сустава. (В ') Гистологическое сечение B показывает грануляционной ткани, жировой и мышечных клеток, заполняющих в месте резекции (гематоксилином и эозином). Шкала бары: A, B = 1 мм; В '= 500 мкм; C '= 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При первом изучении этого протокола, определения, где найти начальный разрез может быть сложной задачей. Тем не менее, практика по эвтаназии мышей помогает хирург узнать, где разместить начальную разрез и выставить нужный ребро быть Резецированная. Работа на трупах также улучшает навыки тонкой моторные, необходимые для удаления реберную часть с или без надкостницы. Кроме того, кто-то новый с этой процедурой может найти манипуляции мелкие инструменты и тонкие швы, чтобы быть затруднено. В то время как связывание с избыток потянув шва может рвать ткани. Таким образом, некоторые практики наложения швов также на трупах может быть полезным. И, наконец, если хирург является новым для хирургических процедур с грызунами, это может быть полезно иметь другое лицо помочь с мониторингом и регулировки анестезии в течение первых нескольких операций.
Наиболее важным шагом этого протокола вырезания кости, не вызывая пневмоторакс (ненормальное сбора воздуха в плевральной спаCE), который трудно поддается лечению у мышей, так как Мембрана является слишком тонким, чтобы закрыть хирургическое. Слой мышц и теменной плевры уступает ребра очень тонкая и нежная, Следовательно, точные движения необходимо, чтобы предотвратить прокол в плевральной мембраны, лежащей под областью резекции. Это происходит чаще всего с шагом 3,1 и 3,3. На этапе 3.1 (отделяющей кость от окружающих межреберных мышц), острый скальпель и пинцет легко проколоть плевральной слой, если точка не держал на поверхности. На этапе 3,3 (вырезанием кости с мелкими микро-ножницы), размещение ножниц под кости может преодолеть прочность на разрыв плевральной мембраны, или действие поломка кость может вызвать конец костного фрагмента для перфорирования Мембрана. Мы обнаружили, что использование тонких микро-ножницы, которые имеют изогнутые наконечник полезным. Кроме того, как указано выше, он может быть также полезен для первой практике протокол о эвтаназии мышей. Ultiсчете, однако мы обнаружили, что эта проблема может быть легко преодолены с терпением и практикой.
Хотя ребро эндохондральной кости, могут быть некоторые потенциально важных различий между грудной скелета и длинных костей скелета в аппендикулярной. С точки зрения эмбрионального, ребро скелет получен из другого отсека мезодермального (сомитов), чем аппендикулярного скелета (латеральной пластинке мезодермы) 12. Таким образом, вполне возможно, что есть свойства, которые являются уникальными для ребер скелета предшественников, которые отражают эту разницу в истории развития. Таким образом, в долгосрочной перспективе, это может быть необходимо определить, что эти уникальные свойства, а затем использовать эту информацию, чтобы поощрять предшественников в скелете конечностей посредником ремонт с той же легкостью, как показано на ребра.
Другой аспект, который входит в игру, касается расположение ребер по отношению к дыхательной системы. Альхотя фланговые ребра обеспечивают достаточную стабильность во всем резекции, такие, что ни внешний фиксатор не требуется, Ремонтная зона находится под постоянным движением и деформацией легочной инфляции / дефляции. Было признано, что во время ремонта кости, слишком много движения может быть ингибирующее действие на заживление, а некоторое движение по-видимому, важны для формирования хряща промежуточное 13,14. В этот момент, не ясно, однако, возможно, что формирование хряща промежуточное соединение может быть ключевым шагом для эффективного ремонта масштабного. Таким образом, движение ребер во время дыхания может способствовать ремонт (при надкостница остались в животное). Так движение может быть особенно важным в этом контексте, разработав метод, чтобы поместить фиксатор может быть полезным для изучения биомеханических воздействий на ремонт в будущем.
Выполняя ребро ремонта анализа на мышах, можно воспользоваться мощными генетических инструментов, которые были девевприпрыжку. Например, с использованием трансгенных знаки, происхождение репарационные клетки могут быть оценены. Трансгенные журналисты для формирования костей (новых интересных инструментов в развитии от Gazit и др. 15,16), в эндохондральной процесса, и считанного важных путей передачи сигналов могут быть использованы 12,17. Кроме того, мыши, несущие потери из-функции аллели могут быть использованы для определения сигнальных путей, необходимых. В настоящее время нет других позвоночных модельный организм не позволяет такой широкий спектр генетических методов, чтобы исследовать основную базовую биологию этого процесса.
Кроме того, в то время как другие отличные модели для скелетной ремонта были разработаны и были в эксплуатации в течение некоторого времени, другой контекст для проверки строительных лесов, соединения и клеточной терапии с учетом особенностей грудной ремонта может быть полезным. Создание стандартной модели ребро ремонта дополняет существующие модели, как ребра не обязаны поддерживать тело и ремонтпроисходит без стабилизации. Кроме того, вклад надкостницы к ремонту может быть легко оценена. Futhermore, потому что ребро имеет как хрящ и сегменты кости, сравнение между исцеления этих различных, но взаимосвязанных типов тканей могут определить общую функцию эффективного ремонта 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) | Fine Science Tools | 15000-04 | curved tip is beneficial |
| Micro-scalpel 5.0 mm | Fine Science Tools | 10315-12 | other fine scalpels can be substituted |
| Dumont 55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | adjustability is convenient |
| Micro-needle holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best | Ethicon | 2819G or similar | taper point best but reverse cutting is also good |
| 7.0 prolene sutures (Prolene) | Ethicon | 8700H or similar | 6-0 can be used too, needle point can vary |
| Large forceps (Adson Forceps) | Fine Science Tools | 11006-12 | other brands are fine |
| Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) | Akorn | 17478-062-35 | |
| Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) | Abbot | 32046-01 | has excellent working time |
| Shaver | Wahl | 9918-6171 or similar | |
| Clamp lamp | Zoo Med | LF-5 | |
| Infrared Bulb, 75W | Zoo Med | RS-75 | |
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbot | 05260-05 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Betadine | Purdue Frederick | 67618015017 | |
| Flavored Gelatin, raspberry | Jell-O | B000E1FYL0 | made up firm, to the consistency of 'jigglers' |
References
- Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
- Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
- Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
- Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
- Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
- Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
- Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
- Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
- Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
- Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
- Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
- Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
- Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
- Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).
