Abstract
Este protocolo introduce investigadores a un nuevo modelo para la reparación ósea a gran escala utilizando el nervio de ratón. El procedimiento se detalla lo siguiente: preparación del animal para la cirugía, la apertura de la pared del cuerpo torácica, exponiendo la costilla deseado de los músculos intercostales circundantes, la escisión de la sección deseada de la costilla sin inducir un neumotórax, y el cierre de las incisiones. En comparación con los huesos del esqueleto apendicular, las costillas son muy accesibles. Además, no fijador interno o externo es necesario ya que las costillas adyacentes proporcionan una fijación natural. La cirugía utiliza comercialmente la oferta disponible, es fácil de aprender, y bien tolerado por el animal. El procedimiento puede llevarse a cabo con o sin retirar el periostio, y por lo tanto la contribución del periostio a la reparación se puede evaluar. Los resultados indican que si se mantiene el periostio, la reparación robusta se produce en 1 - 2 meses. Esperamos que el uso de este protocoloestimular la investigación en la reparación de costilla y que los hallazgos facilitarán el desarrollo de nuevas formas de estimular la reparación ósea en otros lugares del cuerpo.
Introduction
Debilitante lesión esquelética, la osteoartritis crónica y los problemas graves asociados con la cirugía reconstructiva impactar la productividad económica, el bienestar de la familia, y la calidad de vida. Mientras que las pequeñas roturas y lesiones pueden sanar bastante bien, los seres humanos no son capaces de reparar defectos grandes y por lo tanto deben confiar en los procedimientos de reconstrucción para restaurar la estructura y función. Reconstrucción puede implicar injertos alogénicos o heterogeneic, hueso morcelado, andamios implantados, o osteogénesis de distracción. Desafortunadamente, no sólo hay factores de morbilidad persistentes asociados con estos tratamientos, pero la resistencia original del hueso reparado raramente se alcanza. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques clínicos.
De una vía para desarrollar métodos innovadores para el tratamiento de defectos segmentarios es estudiar situaciones en las que la reparación a gran escala se produce de forma natural. Anfibios famoso puede regenerar elementos esqueléticos, mientras que los mamíferos se consideran limitadas en ºes la capacidad. Sin embargo, desde principios del siglo 20, algunos informes de la regeneración de la costilla humana se han publicado lo que sugiere que los seres humanos no pueden ser tan limitados 1-4. Actualmente este fenómeno es el más conocido por los cirujanos plásticos que utilizan material de la costilla de la mandíbula, la cara y la oreja de reconstrucción, pero no es más ampliamente apreciado 5. Para estudiar esta reparación con más detalle, hemos desarrollado un modelo quirúrgico con el ratón. El uso de este protocolo, los investigadores pueden identificar los factores innatos involucrados y utilizar esta información para facilitar la curación esquelético en otros lugares.
Hay muchas ventajas de utilizar las nervaduras como un modelo para estudiar la reparación esquelética. En primer lugar, las costillas que rodean proporcionan un fijador natural (en comparación con la resección del fémur 6,7). Esto disminuye el riesgo de morbilidad de fijadores internos y externos y simplifica el procedimiento quirúrgico. En segundo lugar, las capas musculares delgadas de los wa pecholl proporcionar un fácil acceso y una excelente visibilidad que hacen que el ensayo comparables a la comodidad de las resecciones de calota 8. En tercer lugar, en contraste con la calotas que forman por la osificación intramembranosa, la forma de las costillas por la osificación endocondral y crecer en longitud a través de la extensión en placas de crecimiento situados en cualquier extremo de una diáfisis central. Por lo tanto, la reparación de los nervios puede ser más comparable a la reparación de los huesos largos del esqueleto apendicular. Además, hemos encontrado que en comparación con el fémur, el periostio de la costilla es más gruesa y puede ser más fácilmente manipulada. Por lo tanto, los investigadores que desean ensayar la reparación del hueso con el propósito de estudiar el periostio o probar terapias celulares, agentes farmacológicos, y / o andamios de tejido pueden encontrar este modelo quirúrgica útil. En resumen, este modelo de resección de costilla proporciona un contexto en el que para estudiar la reparación ósea a gran escala natural en mamíferos como tal modelo de uso general en la actualidad existe.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos se ajustan con un animal protocolo aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad del Sur de California.
1. Preparación para la Cirugía
- Coloque los instrumentos quirúrgicos y suministros necesarios (esterilizada, artículos 1 a 18 en la lista de materiales) y organizar un microscopio de disección y una fibra óptica de trans-iluminador en una campana o en una mesa de aspiración.
- Coloque un ratón sexualmente maduros (20 - 30 g, 1 - 3 meses de edad) en una cámara de inducción con 4% de isoflurano para inducir la anestesia.
- Confirme la anestesia con una pata y / o prueba del pellizco cola.
- Aplique una pomada para los ojos del ratón para evitar la sequedad del ojo durante la cirugía.
- Mueve el ratón a la platina del microscopio. Coloque el ratón en el cono de la nariz de la manguera de mantenimiento y posicionar lateralmente. Proporcionar una bolsa de calentamiento adyacente al animal para ayudar a mantener la temperatura corporal.
NOE:. Posición del ratón depende de la preferencia y / o uso de las manos del cirujano personal, lateral izquierda o derecha está muy bien. - Ajuste isoflurano al 2-3% para el mantenimiento, y ver la frecuencia respiratoria.
- Inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea (flanco lateral de la pierna) para el dolor después de la cirugía con una aguja 25 G. La pierna puede contracción que es una respuesta normal.
Incisión 2. Apertura
- Detectar la costilla deseada por palpación, y limpiar la zona de pelo con una maquinilla de afeitar.
NOTA: Costillas 8-10 se recomiendan desde las costillas 1-7 están más cerca de los pulmones y 11-13 son considerablemente más cortos. Contando las costillas debe comenzar con la costilla más rostral como número 1. - Prepare el área con la alternancia de povidona yodada y el isopropanol (70%) hisopado (3x se recomienda a menudo por los protocolos de uso animal).
- Cortar una incisión de 2 cm a través de la piel, directamente arriba y paralela a la costilla deseado con tijeras de microcirugía de tamaño medio. Inc¿Estee a través de las capas de músculo y grasa subyacentes.
- Coloque todos los 3 capas (piel, músculo, grasa) en un retractor para exponer el área quirúrgica, y reducir al mínimo el tamaño de la incisión.
3. Ablación la costilla
- Corte a través de los músculos intercostales suprayacentes la sección deseada de la costilla con un bisturí 5,0 mm. Posición de esta incisión alrededor de 5 mm proximal a la articulación condrocostal ya que es donde la costilla no es tan altamente curvada. Separar cuidadosamente el músculo del hueso con unas pinzas de punta fina.
- Para crear una resección al tiempo que conserva el periostio en el animal, cortar a través del periostio, a lo largo de la longitud de la costilla con un bisturí 5,0 mm. Separar cuidadosamente el periostio del hueso subyacente lateralmente con unas pinzas de punta fina. Proceda con precaución, ya que el periostio es muy delicada y tiene una consistencia gelatinosa.
- Siguiente hacer una sección transversal a través del hueso en un extremo con finas micro-tijeras. Si es necesario, medir la resección conuna retícula en el microscopio o un medidor de tipo regla. A continuación, levante con cuidado el hueso del periostio y cortar el otro extremo.
NOTA: Proceda con precaución. Este es el paso más delicado, ya que tirando hacia arriba sin extirpar el nervio continuación se rompa la membrana pleural y dar lugar a un neumotórax. Si se rompe la membrana pleural este será fácilmente evidente como el interior de la cavidad torácica se hará visible. - Si el sangrado se produce como resultado de cortar el hueso, aplicar presión en el extremo de corte con un hisopo de algodón con punta de 4 - 5 segundos para detener el sangrado.
NOTA: En las raras ocasiones en que el sangrado continúa, puede que sea necesario para detener y practicar la eutanasia del animal pérdida de sangre tan significativo comprometerá recuperación (sin reposición de líquidos, el volumen máximo de sangre que puede ser con seguridad se pierde es el 10% del volumen total de sangre o 7.7 -. 8 l / g Para un 25 g de ratón, esto es equivalente a alrededor de 180 a 200 l 9). - Coloque inmediatamente la costilla eliminado en4% PFA para el análisis futuro.
NOTA: Si la resección de tanto el hueso y el periostio se llevará a cabo, omita la incisión periostio y la separación (paso 3.2). Desde el periostio está muy estrechamente unida a la membrana pleural proceder con cautela, las burlas la nervadura de distancia de la membrana pleural con pinzas para evitar que se rompa.
4. Cierre de la incisión
- Suturar los músculos intercostales sobre la parte superior de la manga perióstica restante con 9-0 suturas (2 suturas suelen ser suficientes). Coloque las suturas directamente sobre los extremos cortados de la costilla, para actuar como indicadores para la ubicación de la cirugía.
- Retire el retractor. Suturar el músculo y la grasa que recubre con 9-0 suturas (3-4 suturas suelen ser suficientes). En ratones con capas particularmente gruesas de músculo y / o grasa, suturar cada capa por separado (por ejemplo, 1 capa de suturas para la capa muscular y 1 capa de suturas para la capa de grasa).
- Cierre lapiel con 7-0 suturas (4-5 suturas suelen ser suficientes).
- Asegure la incisión con pegamento de sutura, pellizcar los bordes juntos con grandes pinzas.
- Lentamente destetar el ratón fuera isoflurano ajustando primero al 1% durante unos minutos y luego se apagará.
- Coloque el ratón bajo una lámpara de calor y dejar hasta que se recupere la conciencia, 5-10 min. Después de la conciencia se recuperó y en todo el período de cicatrización, el ratón debe moverse y deambular normalmente y no muestran signos de sufrimiento.
5. Recuperación y análisis
- Proporcionar el manejo del dolor postoperatorio incluyendo la administración de buprenorfina en forma de gelatina oral a 0,5 mg / kg cada 12 horas durante 48 horas. La administración oral no requiere restringir el animal que puede provocar dolor a la región torácica.
- Mantener el ratón en una jaula con libre acceso al alimento y agua durante el período de cicatrización. Después de la incisión es seco, las hembras pueden co-alojados mientras que el varóns debe permanecer aislado para evitar enfrentamientos.
- Tras el período de cicatrización, siga el procedimiento aprobado por la eutanasia. Retire la caja torácica para la fijación y el análisis.
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Representative Results
Animales suelen recuperarse rápidamente de este procedimiento, la incisión cicatriza bien, y los animales presentan un comportamiento normal. El procedimiento utiliza los suministros disponibles comercialmente y después de la práctica, se puede completar en menos de 1 hr. Antes de utilizar este procedimiento para generar los datos experimentales, es importante analizar la resección en el punto de tiempo del día 0 para determinar si los fragmentos óseos grandes pueden permanecer dentro de la zona de resección. Una forma de evaluar el procedimiento adecuado es evaluar los animales por rayos X o imágenes microCT después de la operación, aunque esto normalmente requieren aprobaciones especiales de seguridad radiológica. En cambio, otra evaluación simple puede ser completado mediante la realización de una preparación de tinción esquelético como se ilustra en la Figura 1A. Esto implica la recogida de la caja torácica, que se fijan en EtOH, y la tinción con rojo de alizarina utilizando un protocolo estándar 11. Puede ser útil para omitir el hidróxido de potasio (utilizado para digerir los tejidos blandos de distancia), de modo That la muestra todavía se puede utilizar posteriormente para el análisis histológico si así se desea. La muestra todavía se puede visualizar sin los pasos de hidróxido de potasio en la limpieza en el 80% de glicerol, porque la capa muscular de la pared del cuerpo recubre es fina. O, alternativamente, estos músculos pueden eliminarse manualmente antes de la fijación / tinción como se muestra aquí (Figura 1A).
La porción de hueso eliminado también puede ser analizado. Si el objetivo era mantener el periostio en el animal, la porción de hueso debe tener una superficie lisa como se visualizaron por microscopía de luz y análisis histológico (Figura 1B, B '). Una porción de hueso eliminado con el periostio debe tener una superficie claramente desigual y en el examen histológico tiene una capa de periostio suprayacente intacta, que tiene las características de un tejido conectivo denso irregular (Figura 1C, C ').
Dependiendo del objetivo del experimento, la curación puede serevaluado en diferentes puntos temporales. Las observaciones indican que las resecciones 3 mm en la que el periostio se retiene en el animal normalmente se curan completamente dentro de 1 - 2 meses. Reparación produce a través de la formación de un callo blando y duro, y remodelación. Un ejemplo de reparación completa a los 2 meses se muestra en la Figura 2A, A '; reparación puede ser evaluada por la preparación esquelético (Figura 2A) y el análisis histológico (Figura 2A '). Si se elimina también el periostio, la brecha de la resección nunca se llena. La Figura 2B muestra un ejemplo en el que se ha producido cierta reparación en un extremo, sin embargo, es más típico observar extremos romos. Tras el análisis histológico, la zona de la resección se llena con adiposo, tejido de granulación, y el músculo (Figura 2B ').
Figura 2. reparación costilla posterior a la curación en las resecciones con y sin el periostio. (A) la preparación esquelético siguiente ~ 2 meses de curación después de la resección, conservando el periostio intacto dentro del ratón (preparado como en la Figura 1A). La reparación completa de la región se puede observar. (A ') Corte histológico de B muestra una restauración de las murallas hueso laminar y lacavidad de la médula ósea (hematoxilina y eosina). (B) preparación esquelético (rojo alizarina) después de ~ 3 meses de curación después de eliminar tanto una porción de costilla y el periostio. Sólo había una mínima reparación en el extremo cortado se muestra en la parte izquierda del panel. Un amarillo punta de flecha en la articulación condrocostal. (B ') sección histológica de B que muestra tejido de granulación, adiposo, y las células musculares de llenado en el sitio de la resección (hematoxilina y eosina). Las barras de escala: A, B = 1 mm; B '= 500 m; C '= 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La primera vez que el aprendizaje de este protocolo, determinar dónde ubicar la incisión inicial puede ser un reto. Sin embargo, la práctica en los ratones sacrificados ayuda al cirujano a aprender dónde colocar la incisión inicial y exponer el nervio deseado para ser resecado. Trabajando en cadáveres también mejora las habilidades motoras finas requeridas para eliminar la porción de la costilla con o sin el periostio. Además, alguien nuevo en este procedimiento podría encontrar la manipulación de las herramientas y finas suturas finas a ser difícil. Mientras atando, el exceso de tirar de la sutura puede desgarrar los tejidos. Así, algunos de sutura práctica también en cadáveres podría ser útil. Por último, si el cirujano es nuevo para procedimientos quirúrgicos con roedores, puede ser útil tener otra persona ayudar con la monitorización y el ajuste de la anestesia durante los primeros cirugías.
El paso más crítico de este protocolo es extirpar el hueso sin inducir un neumotórax (una acumulación anormal de aire en el spa pleuralce), que es difícil de tratar en el ratón desde la membrana pleural es demasiado delgada para cerrar quirúrgicamente. La capa de pleura musculares y parietal inferior a la costilla es muy fina y delicada; por lo tanto, se requieren movimientos precisos para evitar una punción en la membrana pleural que se encuentra debajo de la zona de resección. Esto ocurre más comúnmente en los pasos 3.1 y 3.3. En el paso 3.1 (que separa el hueso de los músculos intercostales circundantes), el fuerte bisturí y pinzas serán fácilmente perforar la capa pleural si el punto no se mantiene superficial. En el paso 3.3 (extracción, los huesos con finas micro-tijeras), la colocación de las tijeras debajo del hueso puede superar la resistencia a la tracción de la membrana pleural, o la acción de romper el hueso puede provocar que el extremo del fragmento de hueso para perforar el membrana pleural. Hemos encontrado que el uso de micro-tijeras finas que tienen una punta curvada es beneficioso. Además, como el anterior, también puede ser útil para la primera práctica el protocolo de los ratones sacrificados. Ultiinstancia, sin embargo, hemos encontrado que este problema se puede superar fácilmente con paciencia y práctica.
Aunque la costilla es un hueso endocondral, puede haber algunas diferencias potencialmente importantes entre el esqueleto costilla y los huesos largos del esqueleto apendicular. Desde una perspectiva embriológico, el esqueleto costilla se deriva de un compartimiento mesodérmico diferente (somite) que el esqueleto apendicular (mesodermo de la placa lateral) 12. Así, es posible que hay propiedades que son únicas para los progenitores de las costillas del esqueleto que reflejan esta diferencia en la historia del desarrollo. Por lo tanto, en el largo plazo, puede ser necesario determinar qué estas propiedades únicas son y luego utilizar esta información para alentar a los progenitores en el esqueleto extremidad para mediar en la reparación con la misma facilidad como se ve en la costilla.
Otro aspecto que entra en juego se refiere a la ubicación de las costillas en relación con el sistema respiratorio. Alaunque las nervaduras que flanquean proporcionan estabilidad suficiente alrededor de la resección de tal manera que no se necesita ningún fijador externo, la zona de reparación está bajo el constante movimiento y la tensión de pulmón de inflación / deflación. Se ha reconocido que durante la reparación del hueso, demasiado movimiento puede ser inhibitoria a la curación mientras que algunos movimiento parece ser importante para la generación de un 13,14 intermedio cartílago. En este punto, no está claro, sin embargo es posible que la formación de un cartílago intermedio puede ser un paso clave para la reparación eficaz a gran escala. Por lo tanto, el movimiento de las costillas durante la respiración podría facilitar la reparación (cuando el periostio se deja detrás en el animal). Ya que el movimiento puede ser particularmente importante en este contexto, el desarrollo de un método para colocar un fijador podría ser útil para el estudio de las influencias biomecánicas en la reparación en el futuro.
Al llevar a cabo un ensayo de reparación de costilla en el ratón, se puede tomar ventaja de las herramientas genéticas potentes que han sido devellado. Por ejemplo, el uso de marcas de transgénicos, el origen de las células de reparación se puede evaluar. Reporteros transgénicos para la formación de hueso (interesantes nuevas herramientas en el desarrollo de Gazit et al. 15,16), el proceso endocondral, y la lectura de importantes vías de transducción de señal pueden utilizarse 12,17. Además, los ratones portadores de alelos de pérdida de función podría utilizarse para determinar las vías de señalización requeridos. Actualmente, ningún otro modelo de organismo vertebrado permite una amplia variedad de técnicas genéticas como para investigar la biología básica subyacente de este proceso.
Además, aunque se han desarrollado otros modelos excelentes para la reparación del esqueleto y han estado en uso durante algún tiempo, otro contexto para probar andamios, compuestos y terapias celulares teniendo en cuenta las características de la reparación de costilla puede ser beneficioso. El establecimiento de un modelo de reparación costilla norma complementa los modelos existentes, no se requieren las costillas para apoyar el cuerpo y reparaciónse produce sin estabilización. Además, la contribución del periostio a la reparación se puede evaluar fácilmente. Masoveros, porque la costilla tiene tanto cartílago y segmentos de hueso, las comparaciones entre la curación de estos diferentes pero relacionadas tipos de tejidos pueden identificar una característica común de la reparación efectiva 18.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm) | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge) | Fine Science Tools | 15000-04 | curved tip is beneficial |
| Micro-scalpel 5.0 mm | Fine Science Tools | 10315-12 | other fine scalpels can be substituted |
| Dumont 55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | adjustability is convenient |
| Micro-needle holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best | Ethicon | 2819G or similar | taper point best but reverse cutting is also good |
| 7.0 prolene sutures (Prolene) | Ethicon | 8700H or similar | 6-0 can be used too, needle point can vary |
| Large forceps (Adson Forceps) | Fine Science Tools | 11006-12 | other brands are fine |
| Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears) | Akorn | 17478-062-35 | |
| Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive) | Abbot | 32046-01 | has excellent working time |
| Shaver | Wahl | 9918-6171 or similar | |
| Clamp lamp | Zoo Med | LF-5 | |
| Infrared Bulb, 75W | Zoo Med | RS-75 | |
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbot | 05260-05 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Betadine | Purdue Frederick | 67618015017 | |
| Flavored Gelatin, raspberry | Jell-O | B000E1FYL0 | made up firm, to the consistency of 'jigglers' |
References
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