Summary
Arbejde med smitsomme Ebola-virus er begrænset til biosikkerhed niveau 4 laboratorier. Tetracistronic minigenomplasmiderne-holdige replikation og transkription-kompetent viruslignende partikler (trVLPs) udgør et livscyklus modellering system, der giver os mulighed for sikkert at modellere flere smitsomme cyklusser under biosikkerhed niveau 2 betingelser, bygger udelukkende på Ebola-virus komponenter.
Abstract
Ebola virus forårsage alvorlige blødende feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater, med dødeligheden så højt som 90%. Der er ingen godkendte vacciner eller specifikke behandlinger for sygdom forårsaget af disse vira, og arbejde med smitsomme Ebola-virus er begrænset til biosikkerhed niveau 4 laboratorier, væsentligt begrænser forskningen om disse vira. Lifecycle modelsystemer model virus livscyklus under biosikkerhed niveau 2 forhold; imidlertid indtil for nylig sådanne systemer er begrænset til enten individuelle aspekter af virus livscyklus, eller en enkelt infektiøs cyklus. Tetracistronic minigenomer, der består af Ebola-ikke-kodende regioner, et reportergen, og tre Ebola virus gener involveret i morfogenese, knopskydning, og indtastning (VP40, GP 1,2 og VP24), kan anvendes til at frembringe replikation og transkription -competent viruslignende partikler (trVLPs) indeholder disse minigenomer. Disse trVLPs løbende kan inficere celler, der udtrykker Ebolavirusproteinerne ansvarlige for genom replikation og transkription, hvilket giver os mulighed for sikkert at modellere flere smitsomme cyklusser under biosikkerhed niveau 2 forhold. Vigtigere er de virale komponenter i dette, der alene er afledt af ebola-virus og ikke fra andre virus (som er for eksempel tilfældet i systemer, der anvender pseudotype vira) og VP40, GP 1,2 og VP24 ikke overudtrykt i dette system , hvilket gør det ideelt til at studere morfogenese, spirende og indrejse, selv om andre aspekter af virus livscyklus såsom genom replikation og transkription også kan modelleres med dette system. Derfor tetracistronic trVLP analysen er den mest omfattende livscyklus modellering system til rådighed for Ebola virus, og har et enormt potentiale til brug i efterforskningen af biologi Ebola virus i fremtiden. Her giver vi detaljerede oplysninger om brugen af dette system, samt på forventede resultater.
Introduction
Ebola virus er det agens af en alvorlig hæmorrhagisk feber hos mennesker og ikke-menneskelige primater med dødeligheden på op til 90% i menneskelige udbrud 1. Mens der er sket betydelige fremskridt i de seneste år i udviklingen af vacciner samt specifikke behandlinger (revideret i 2,3), er disse ikke er godkendt til human brug. Ebola viruspartikler har en karakteristisk trådlignende udseende med en længde på omkring 1 um og en diameter på 96 til 98 i nm 4. En nucleocapsid- udgør kernen i de virale partikler og består af 1) det ikke-segmenterede enkeltstrengede negativ-sense RNA-genom, der koder for 7 ebolavirus gener (figur 1), 2) nukleoproteinet NP, som encapsidates genomet, 3 ) den virale polymerase kompleks bestående af polymerase L og dets cofaktor VP35, og 4) den transkriptionelle aktivator VP30. Desuden er det for nylig blevet vist, at proteinet VP24 også er forbundet med nukleocapsidets 4. Nukleocapsidet er omgivet af matrixen rum, i hvilket matrixprotein VP40, som er ansvarlig for morfogenese og knopskydning af virioner, er beliggende. Viruspartikler yderligere indhyllet, og indlejret i denne kuvert er den eneste overfladeprotein GP 1,2, som er ansvarlig for virion udlæg og indrejse.
Arbejde med smitsomme Ebola-virus skal udføres i en maksimal indeslutning laboratorium under biosikkerhed niveau (BSL) 4 betingelser, der begrænser dette arbejde til et par faciliteter på verdensplan. For at studere biologi disse vira eller til at udvikle nye lægemidler under BSL2 betingelser, forskere stole enten på rekombinant overekspression af ebola-virus-proteiner, eller om livscyklus modelsystemer, som begge kan arbejdes med i fravær af infektiøs Ebola-virus. Rekombinant ekspression af Ebola virus proteiner enten er opnået fra ekspressionsplasmider eller virale vektorer. Et særligt tilfælde af denne strategi er dengenerering af virioner eller viruslignende partikler baseret på andre vira end Ebola virus (mest almindeligt retrovira eller vesikulært stomatitis-virus) i nærværelse af rekombinant udtrykte GP 1,2, hvilket fører til dannelsen af pseudotype-partikler, som kan anvendes til at studere indrejse proces filovira og skærm til entryhæmmere 5. Alternativt kan rekombinante vira (fx vesikulær stomatitis-virus), som koder for ebola-virus GP 1,2 i stedet for deres egen glycoprotein genereres og anvendes til at undersøge virus post under biosikkerhed niveau 2 vilkår 6.
Lifecycle modelsystemer er former for omvendt genetik systemer med anvendelse af trunkerede Ebola-virus genom analoger (minigenomer), som oprindelig er fremstillet af cDNA og derefter replikeret og transskriberet af Ebola-virus-proteiner, der er fastsat i trans. Den første minigenom for ebola-virus blev udviklet for mere end 15 år siden 7, Og er siden blevet brugt til at studere ebola-virus genom replikation og transkription (revideret i 8,9). I dette system en monocistronisk minigenom bestående af en enkelt reporter gen flankeret af de terminale ikke-kodende regioner af Ebola-virus-genomet (kaldet leder og trailer) (figur 1) er udtrykt i mammale celler (sædvanligvis ved transkription under anvendelse af T7-RNA-polymerase) sammen med de virale proteiner L, VP35, VP30 og NP. Minigenomplasmidet er indkapslet af NP, og derefter replikeres og transskriberes af de andre nukleocapsidproteiner hjælp cis-virkende signaler lokaliseret i leder og trailer, hvilket fører til reporter aktivitet, der afspejler disse to aspekter af virus livscyklus (figur 2).
For at modellere yderligere trin i den virale livscyklus, transskription og replikation-kompetente virus-lignende partikel (trVLP) er blevet udviklet, som er baseret på klassiske minigenomplasmiderne systemer, men har den enYDERLIGERE udtryk for de andre virale proteiner VP24, VP40 og GP 1,2 fra ekspressionsplasmider 10,11. Tilstedeværelsen af VP40 fører til dannelsen af trVLPs, som bærer GP 1,2 på deres overflade, og bære et minigenom indeholdende nukleocapsid på indersiden. Disse trVLPs kan anvendes til at inficere målceller, der enten er pretransfected med ekspressionsplasmider for L, VP35, VP30 og NP, for at lette replikation og transkription af minigenomer bragt ind i målceller inden trVLPs 11 eller er naive målceller (dvs. uden plasmid-drevet ekspression af Ebola virusproteiner) 10. Dette resulterer i reporter aktivitet i målceller, hvilket afspejler replikation af minigenomer i Producentcelleme, morfogenese og spirende af trVLPs, deres indtræden i målceller, og 1) i tilfælde af pretransfected målceller også genomreplikation og sekundær transkription ( dvs. transkription af virale proteiner produced i målceller) i målceller, eller 2) i tilfælde af naive målceller også primær transkription (dvs. transkription af virale proteiner bragt i målceller inden trVLPs) (Figur 3). Det er vigtigt, har disse systemer kun blevet anvendt til at modellere en enkelt infektiøs cyklus, og stole på overekspression af alle virale proteiner, som i tilfælde af VP24 og VP40 er særlig problematisk, eftersom disse proteiner har vist sig at være stærke negative regulatorer af genomreplikation og transkription når overudtrykt fra plasmider 12,13. Endvidere trVLP, der er fremstillet i disse systemer indeholder en høj andel af ikke-infektiøse partikler, udgør udfordringer for biokemisk analyse af smitsomme trVLPs 14.
For at overvinde disse problemer har vi for nylig udviklet en tetracistronic minigenom system, der i tillæg til et reportergen, indeholder også de gener, der koder for VP40, GP 1,2 ogVP24 (figur 1). Svarende til den klassiske monocistronisk minigenom system dette system fører til produktion af trVLPs der kan inficere målceller (figur 4) 15. Men i modsætning til den klassiske minigenom systemet, VP40, GP 1,2, og VP24 er fremstillet efter virale genom transkription snarere end at blive overudtrykt fra plasmider. Som et resultat, kinetik og ekspressionsniveauer af disse proteiner meget mere nøje efterligner dem, der findes i den virale livscyklus, og dermed forholdet mellem smitsomme til ikke-smitsomme trVLPs øges omkring 500 gange i dette system 15. Endvidere, ved hjælp af dette system var det muligt løbende passage tetracistronic minigenomplasmiderne-holdige trVLPs, modellering af flere smitsomme cyklusser. Som sådan er i øjeblikket tetracistronic trVLPs den mest omfattende livscyklus modellering system til rådighed til at studere ebola-virus biologi under BSL2 forhold. Her giver vi detaljerede oplysninger om brugen of dette system, samt på forventede resultater.
Protocol
1. Opdeling af producentceller til Initial Produktion af trVLPs
- Fjern mediet fra 80-90% konfluente 293 celler dyrket i 75 cm2 kolber i høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 1x pen / strep (DMEM10 ). Vask cellerne to gange med 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS), og pas på ikke at løsne cellerne, og der tilsættes 2 ml trypsin-EDTA til cellerne.
- Inkuberes cellerne ved stuetemperatur, indtil celler viser signifikant afrunding når de observeres under et mikroskop (ca. 30 sek). Løsne celler ved at trykke kolbe og tilsæt 8 ml DMEM10. Grundigt resuspender cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned, indtil en enkelt cellesuspension observeres, når den ses under mikroskop.
- Tæl celler under anvendelse af en automatiseret celletæller. Fortyndes cellerne til 2 x 10 5 celler pr ml i DMEM10. Afpipetteres 2 ml cellesuspension pr godt i 6-brønds plader (4 x 105-celler per brønd).
- Pladerne inkuberes i en befugtet vævskultur-inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
2. Transfektion af producentceller til Initial Produktion af trVLPs
- 24 timer efter opdele celler (se figur 5 for en oversigt over forsøget timing), pipette plasmid-DNA 15 (for beløb se tabel 1) i en steril 2 ml cryovialet hjælp af filtrerede tips. Tilsæt 100 pi OptiMEM per brønd til DNA. Vortex blandingen kortvarigt og forsigtigt dreje ned rør ved hjælp af en mikrofuge. Hvis flere brønde skal transficeres med identiske plasmider, kan en Mastermixen flere brønde gøres.
- Kort fortalt Vortex hætteglasset med Transit LT1 før brug. Tilføj 7,5 pi Transit LT1 per brønd til den fortyndede DNA. Forsigtigt vortex blandingen, pas på ikke at samle væske i låget af cryovialet, og der inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Bland forsigtigt transfektionkompleks ved at pipettere op og ned. Tilsæt 100 pi af transfektionskomplekser dråbevis til hver brønd. Rock pladen frem / tilbage og fra side til side for at fordele transfektionskomplekser. Må ikke pladen rundt, da dette vil forårsage ujævn spredning af transfektionskomplekser.
- Retur cellerne til inkubatoren.
- Efter 24 timer, supernatanten fjernes fra cellerne. Tilsæt 4 ml DMEM med 5% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x pen / strep (DMEM5) til cellerne. Dette trin kan udføres i op til 3 brønde i en tid uden tørring af brøndene, forudsat brøndene indeholder identiske prøver (ellers på grund af den selvforstærkende karakter trVLPs i dette system, krydskontaminering kan blive et problem, og dette trin bør gøres en brønd ad gangen).
- Retur cellerne til inkubatoren.
3. Forberedelse af målceller
- Split 293 celler som beskrevet i afsnit 1, såning 4 x 10 5 celler i 2 ml DMEM10 pr brønd i en6-brønds plade.
- 24 timer efter opsplitning af målcellerne og 24 timer før infektion, transficere målceller som beskrevet i afsnit 2 ved hjælp af DNA-beløb i tabel 1, og 4,5 pi Transit LT1 per brønd.
4. Infektion af målceller og høst af producentceller
- Overfør supernatanterne fra de producerende celler til 15 ml rør. Fjern og kassér eventuelle resterende supernatant ved hjælp af et vakuum slange. Tilsæt 250 pi Glo lysepuffer til cellerne.
- Centrifuger supernatant i 5 minutter ved 800 xg og stuetemperatur for at fjerne prøver af celleaffald.
- Fjern supernatanten fra en brønd af målcellerne. Tilsættes forsigtigt 3 ml blokerede producent cellesupernatant til målceller ved hjælp af den langsomste pipette hastighed. Undgå pipettering direkte på cellerne for at undgå at forstyrre cellemonolaget. Dette trin skal gøres en brønd på et tidspunkt.
- Når alle prøver er blevet omladetudskudt returnere målceller til inkubatoren for at tillade sedimentering af trVLPs og infektion af målceller.
- Efter 15 min inkubation ved stuetemperatur i Glo lysisbuffer, resuspenderes de producerende celler i lysepuffer ved hjælp af en mikropipette sat til 150 pl, og overføre prøven i en 2 ml kryoglas. På dette tidspunkt, kan lysater fryses ved -80 ° C eller direkte målt som beskrevet i afsnit 6.
- 24 timer efter infektion, supernatanten fjernes fra målcellerne. Tilsæt 4 ml DMEM5 per brønd til cellerne. Dette trin kan gøres op til tre brønde på en gang, hvis brøndene indeholder identiske prøver (ellers, på grund af selvforstærkende karakter trVLPs i dette system kan krydskontaminering blive et problem, og dette skridt bør være gjort et godt ad gangen).
5. Høst af målceller for en enkelt cyklus Infektion
- Hvis kun en enkelt infektiøs cyklus bør vurderes, ved 72 timer efter infektion fjern than supernatant fra målcellerne ved hjælp af en vakuumslange.
- Høst cellerne i 250 ul Glo lysisbuffer som beskrevet i afsnit 4 for producentceller.
6. Harvest af målceller og Continuous Passage af trVLPs
- Hvis trVLPs skal løbende passage, udarbejde et nyt sæt af målceller som beskrevet i afsnit 3, således at de er klar til infektion 72 timer efter infektion af det første sæt af target-celler (se figur 5).
- Inficere nye sæt målceller, som beskrevet i afsnit 4 (ved hjælp af første sæt målceller i stedet for de producerende celler).
- Gentag disse trin hver 72 timer.
7. Analyse af reporteraktivitet
- Hvis cellelysater blev frosset, optø ved stuetemperatur. Sørg for, at prøverne har nået stuetemperatur inden måling.
- Optø den nødvendige mængde (40 ul pr prøve) af Renilla Glo assaypuffer (ideelt frosset In portioner) ved stuetemperatur. Sørg for, at bufferen har nået stuetemperatur før måling.
- Tilføj 1/100 volumen Renilla Glo substrat til Renilla Glo assaybuffer til opnåelse af Renilla-Glo reagens og vortexes. Afpipetteres 40 ul af Renilla Glo reagens med en hvid plade med 96 brønde.
- Tilsæt 40 ul prøve til Renilla-Glo reagens. Vent 10 minutter, derefter måle prøverne i et luminometer ved hjælp af en integration på 1 sek.
Representative Results
Transfektion af 293 producentceller med ekspressionsplasmider der koder for ebola virus nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, og L, en tetracistronic minigenomplasmiderne og tilbehør T7-polymerase resulterer i minigenom replikation og transkription og reporter aktivitet, der er let påviselige ved 72 timer (figur 6 ). Vigtigere er det observeret reporter aktivitet (10 5.6 relative luminescens enheder (RLU)) overstiger værdien af en negativ kontrol, hvor ekspressionsplasmidet, der koder for L blev udeladt fra transfektionen (10 3 RLU) med mere end 2 log. Det lave niveau af aktivitet, der observeres, selv i fravær af L er mest sandsynligt på grund af en kryptisk promotor i minigenomplasmid. Målceller inficeret med trVLPs fra supernatanten af producentceller faktisk vise noget forhøjede niveauer af reporter aktivitet, når sammenlignet med producentceller, og værdier nå op på mellem 10 6 og 10 7 RLU'er, afhængigt af passagen. I modsætning hertil, whøne supernatanten af -L kontrol producerceller er passeret på målceller (udtrykker alle nucleocapsidprotein, herunder L), er reporteraktivitet ikke overstige baggrundsstøjen luminometeret (ca. 10 2 RLU).
Den tetracistronic trVLP analysen kan bruges til at studere livscyklus Ebola virus. For eksempel infektion af 293 celler med trVLPs er afhængig af tilstedeværelsen af vedhæftede faktorer som Tim-1 16, som skal tilvejebringes i trans i disse celler. Følgelig, i en tetracistronic trVLP assay et fald i reporter aktivitet i målceller på omkring 100 gange observeres i fravær af Tim-1 (figur 7A). Rolle specifikke (virale eller cellulære) proteiner i virus livscyklus kan også vurderes ved hjælp af RNAi-teknologi sammen med denne tilgang. Som et eksempel, RNAi-medieret nedregulering af L resulterer i et fald i reporter aktivitet på omkring 100 gange, hvilket afspejler den centrale rolle, L ireplikation og transkription (figur 7B) 7. Endvidere er det muligt direkte at manipulere Minigenomplasmidet at vurdere virkningen af mutationer på virus livscyklus. Som et eksempel, når VP24-ekspression fra minigenomplasmidet ophæves ved at indføre tre stopkodoner umiddelbart nedstrøms for startkodonen reporteraktivitet producentceller ikke dramatisk ændret; imidlertid reporter aktivitet i målceller reduceret med omkring 20-fold efter en passage, og 400-fold efter to passager, hvilket indikerer en rolle af VP24 i produktionen af infektiøse trVLPs (figur 7C) 15.
Figur 1. Opbygning af Ebola-virus genomet samt monocistroniske og tetracistronic minigenomer. Kodende regioner for Ebola virus-proteinet er vist som rød (NP,VP35, VP30, og L), gul (VP40 og VP24) eller blå (GP 1,2) bokse. Ikke-kodende regioner (NCRs) er vist i grøn, med lederen og trailer regioner. Indekset indikerer, hvilken viral NCR blev anvendt til sammenføjning de kodende områder. Kodningsområdet for journalisten (rep) er vist i lilla.
Figur 2. monocistronisk minigenom-assay. Celler transficeret med ekspressionsplasmider for ebola virus nukleocapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en monocistronisk minigenom (mg) og T7-polymerase. Minigenomplasmidet indledningsvis transkriberet af T7-polymerase (a) til en unencapsidated minigenom RNA i samme retning som det virale genom (vRNA), som derefter indkapslet af NP (b). Dette indkapslet vRNA replikeres via en komplementær minigenom-RNA (cRNA) mellemproduktediate (C) og derefter transskriberet i reporter mRNA (d), som omregnes til reporter protein (e).
Figur 3. trVLP assay med en monocistronisk minigenom. Celler transficeret med ekspressionsplasmider for minigenom assaykomponenterne (ebolavirussen nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30, L, et monocistronisk minigenomplasmiderne og T7-polymerase) samt VP40, GP 1 , 2 og VP24. Dette fører til dannelsen af trVLPs som inkorporerer minigenomplasmiderne-holdige nukleocapsider (F). Disse trVLPs kan derefter inficere målceller (g), som enten pretransfected med ekspressionsplasmider til NP, VP35, VP30, og L (øverst), hvilket resulterer i replikation og sekundær transkription (d), der fører til reporter udtryk (e), eller naiv målceller (nederst), hvilket resulterer i den primære transkription af minigenomes (h), også fører til reporter udtryk (e).
Figur 4. trVLP assay med en tetracistronic minigenom. Celler transficeret med ekspressionsplasmider for ebola virus nukleocapsidproteiner (NP, VP35, VP30, L), en tetracistronic minigenom (mg) og T7-polymerase. Indledende transkription (a) indkapsling (b), genomreplikation (c) og transkription (d) samt oversættelse (e) forekommer som en monocistronisk minigenom assay. Men ud over reporter mRNA mRNA'er for VP40, GP 1,2 og VP24 også transcriberet fra tetracistronic minigenom, hvilket resulterer i dannelsen af trVLPs (f). Disse trVLPs inficere målceller, der er blevet pretransfected med ekspressionsplasmider for nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30 og L, samt den cellulære Ebola-virusvedhæftningsfaktor Tim-1, hvilket resulterer i genom replikation og transkription, og produktion af trVLPs der kan bruges til at inficere friske målceller.
Figur 5. Tidspunktet for en tetracistronic trVLP assay for 3 på hinanden følgende passager. Dagene til podning celler (r), transfektion af celler (t), inficere celler (i) medium ændring (c), og høstning af celler og trVLPs (h), er angivet for tre på hinanden følgende passager (angivet med pile).
Figur 6. Typiske niveauer af reporteraktivitet observeret i en tetracistronic trVLP analyse. Et tetracistronic trVLP assay blev udført over 5 passager efter protokolol skitseret i dette manuskript. Som en negativ kontrol ekspressionsplasmidet, der koder for L udeladt (-L) fra transfektion af p0 producentcellerne. Målceller i passager P1 til P5 blevet transficeret med ekspressionsplasmider for alle nukleocapsidproteiner, herunder L. baggrundsstøj i luminometeret er angivet som en stiplet linie. Midler og standardafvigelser af 4 biologiske replikater fra 3 uafhængige forsøg er vist.
Figur 7. Vurdering af effekten af forskellige virale og cellulære faktorer på den virale livscyklus hjælp tetracistronic trVLPs. (A) Tim-1 som en vedhæftet fil faktor. Målceller, der blev pretransfected med ekspressionsplasmider der koder for nukleocapsidproteiner og med eller uden et plasmid, der koder for Tim-1 (beskrevet i 15) blev inficeret med tetracistronic trVLPs. 72 timer efter infektion reporteraktivitet p1 målceller blev bestemt. Midler og standardafvigelser af 4 biologiske replikater fra 4 uafhængige eksperimenter er vist. (B) Effekt af RNAi knockdown af L på genom replikation og transkription. Målceller der blev pretransfected med ekspressionsplasmider for nucleocapsid- komponenter, Tim-1 og miRNA rettet mod L (anti-L) eller et ikke-beslægtet protein (anti-GFP) (beskrevet i 15) blev inficeret med tetracistronic trVLPs. 72 timer efter infektion reporteraktivitet p1 målceller blev bestemt. Midler og standardafvigelser af 5 biologiske replikater fra 2 uafhængige eksperimenter er vist. (C) Effekt af mutationer i minigenomplasmidet på trVLP infektivitet. Et tetracistronic trVLP assayet blev udført ved hjælp af enten en vildtype minigenom (4cis-WT) eller en minigenom i som 3 stopcodoner var blevet indført umiddelbart efter startkodonen af VP24, afskaffelse udtrykke of dette protein, men indførelse kun minimale ændringer minigenomplasmidet i forhold til længde, nukleinsyre sammensætning, sekundære strukturer mv Reporter aktivitet i P0, P1 og P2 blev målt 72 timer efter transfektion / infektion. Midler og standardafvigelser af 3 biologiske replikater fra 3 uafhængige forsøg er vist.
| Producentceller (P0) | Målceller (P1 og højere) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1.000 | 1.000 | |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
Tabel 1. DNA-mængder til transfektion. Størrelsen af hvert plasmid kræves til transfektion af producent og målceller er vist i ng per brønd af en 6-brønds plade. Alle plasmider er beskrevet i Watt et al 15.
Discussion
Den tetracistronic trVLP analysen er beskrevet i dette manuskript tillader modellering af Ebola-virus livscyklus over flere smitsomme cyklusser. Vigtigere har de trVLPs produceret i dette system ikke indeholder den genetiske information for de nukleocapsidproteiner NP, VP35, VP30 og L, der tilsammen udgør næsten 60% af Ebola virus genom og er afgørende for viral replikation. Snarere disse proteiner skal tilvejebringes i målceller i trans fra ekspressionsplasmider og infektion af celler, der ikke udtrykker alle 4 af disse proteiner er mislykket. Vigtigere er det, er der ingen tegn på genetisk rekombination til filovira, og der er ingen homologe regioner delt mellem tetracistronic minigenom og ekspressionsplasmiderne for nukleocapsidproteiner. Derfor er der hverken nogen praktisk beviser heller ikke nogen teoretisk grundlag, der kunne give mulighed for at skabe fuld længde Ebola virus genomer, der kunne så potentielt resultere iproduktionen af infektiøse Ebola virus, hvilket gør dette system sikkert til brug under BSL2 forhold.
Der er to afgørende skridt i den tetracistronic trVLP assay, der er påvirket af eksperimentelle betingelser, dvs produktion af trVLPs samt infektion af målceller med disse trVLPs. Produktion af trVLPs er afhængig af høje niveauer af minigenom replikation og transkription, som igen er afhængig af en høj transfektion effektivitet. Transfektion effektiviteten kan let vurderes ved at inkludere en -L kontrol, hvor ekspressionsplasmid for L ombyttes med et ekspressionsplasmid, der koder eGFP. Transfektionsmetoder satser under disse betingelser, skal overstige 50% ved inspektion med en fluorescens mikroskop 24 timer efter transfektion. Endvidere celler har til at være fri for mycoplasma, idet vores erfaring forurening med mycoplasma dramatisk svækker minigenomplasmid replikation og transkription (upublicerede data). På grund af deres høje transfectability 293 ceLLS er den cellelinje valg for trVLP analyser; men disse celler er relativt dårligt modtagelige (omend ikke helt brydningsindeks) til infektion med Ebola-virus 16. Ekspression af en vedhæftet faktor, såsom Tim-1 øger infektion af 293 celler med trVLPs omkring 100 gange, og er afgørende for succes i dette system over flere passager.
Mens tetracistronic trVLPs er ikke selvreplikerende på egen hånd, er de selvreplikerende i celler, der udtrykker nukleocapsidproteiner. Som sådan skal gøres for at undgå krydskontaminationer mellem brønde indeholdende forskellige trVLPs (fx med forskellige mutationer i minigenomplasmidet) forholdsregler. Fra en mere teknisk synspunkt, på grund af den store forskel mellem positive og negative signaler i dette assay (ca. 4 log), krydstale mellem prøver ved måling af luciferaseaktivitet kan være et problem; men dette kan let undgås ved at efterlade en tom brønd mellem hver prøve i96-brønds plade, der anvendes til måling af luciferaseaktivitet.
Der er et væld af mulige applikationer til tetracistronic trVLPs. Det er klart, at de er velegnede til at studere optagelse af Filovirus partikler, idet smitsomme trVLPs har den typiske tråd-lignende struktur af infektiøse filovira 14 og indeholder de samme virale komponenter som Filovirus partikler. Vigtigere er det, at de ikke indeholder komponenter af andre vira, som det er tilfældet ved brug af pseudotype-virioner eller viruslignende partikler, såsom retroviruspartikler forsynet GP 1,2, eller rekombinante vira, såsom rekombinant vesikulært stomatitis-virus, der udtrykker GP 1,2 . Kravet om vedhæftningsfaktorer ved brug af 293-celler som målceller i dette system kan udnyttes til at screene for og undersøge den rolle, som sådanne vedhæftningsfaktorer, mens roller andre cellulære faktorer, såsom dem, der er involveret i genom replikation og transkription samt morfogenese og knopding, kan efterforskes ved hjælp RNAi-teknologi. Virkningen af mutationer i virale proteiner på virus livscyklus kan også blive undersøgt, om man har at holde sig for øje, at mens VP40, GP 1,2, og VP24 udtrykkes efter viral transkription, er udtryk for de andre virale proteiner opnås fra ekspression plasmider, således at virkninger, som skyldes overekspression af disse proteiner skal tages i betragtning. Desuden bør det sikres, at mutationer i minigenomplasmidet ikke i væsentlig grad ændrer længden af minigenom, da reporter aktivitet er direkte berørt af minigenom længde 15. Endelig har der siden tetracistronic minigenomer er virale genom-analoger, der bærer virale gener, og replikeres af viruspolymerasekomplekset, bør det også være muligt at studere udviklingen af disse gener som reaktion på mutationer under BSL2 forhold. Således, mens yderligere undersøgelser stadig er behov for i denne retning, bør det være muligt for eksempel at indføre suboptimalmutationer i gener i minigenomplasmiderne og derefter passage trVLPs indtil gratis mutationer opstår.
En begrænsning af den tetracistronic trVLP analyse, der skal holdes for øje, er, at mens det modeller meste af virus livscyklus, primær transkription i målceller er ikke modelleret af dette system, da målceller nødt til at udtrykke de nukleocapsidproteiner i trans For at de trVLPs at replikere. Hvis primær transkription skal vurderes, er det muligt at anvende naive målceller 10; Men i dette tilfælde ikke genomreplikation foregår i målceller, og ingen yderligere infektiøse trVLPs produceres, afbryder infektionen. Dette er et afgørende problem, som ikke kan overvindes uden at gøre de trVLPs helt selvreplikerende, ved at inkludere generne for de nukleocapsidproteiner ind minigenomplasmidet, hvilket ville de facto gøre dem til infektiøse rekombinante Ebola virus. Faktisk Ebolet virus, som udtrykker luciferase eller andre reportere er blevet genereret og kan anvendes til at vurdere og studere genom replikation og transkription 17,18; Men deres brug begrænses til BSL4 laboratorier. Også, skal det erindres, at mens VP40, GP 1,2, og VP24 udtrykkes fra et virusgenom analog, deres position i minigenomplasmidet (2., 3. og 4. transkriptionsenhed) ikke er identisk med deres position i virusgenomet (3., 4. og 6. transkriptionsenhed), som kunne påvirke deres absolutte ekspressionsniveauer, såvel som deres relative ekspressionsniveauer i forhold til hinanden.
Samlet set tetracistronic trVLP analysen er den mest omfattende livscyklus modellering for Ebola virus er tilgængelige til dato, og giver mulighed for modellering af genom replikation og transkription, partikel morfogenese og spirende såvel som vedhæftet fil og enprøve i målceller over flere smitsomme cyklusser. Som sådan, det har et enormt potentiale til brug i efterforskningen af biologi Ebola virus under BSL2 forhold.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er meget taknemmelig for, at Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), der fungerede som fortæller, samt Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) og Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) til deres hjælp med at gøre filmen ledsager dette manuskript. Desuden vil vi gerne takke Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) til kritisk læsning af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af Intramural forskningsprogrammet for NIH, NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
