Summary
감염 에볼라 바이러스에 대한 작업은 바이오 안전성 수준 4 실험실로 제한됩니다. Tetracistronic minigenome 함유 입자와 같은 복제 및 전사 능력있는 바이러스 (trVLPs는) 우리가 안전하게 에볼라 바이러스 구성 요소에 전적으로 의존, 바이오 안전성 수준에서이 조건을 여러 감염주기를 모델링 할 수있는 라이프 사이클 모델링 시스템을 나타냅니다.
Abstract
에볼라 바이러스는 90 %의 높은 치사율과 함께, 인간과 인간이 아닌 영장류에 심각한 출혈열 원인이됩니다. 거기 이들 바이러스에 의한 질환에 대한 승인 된 백신 또는 특정 치료는 없으며, 이러한 유의 바이러스에 대한 연구를 제한 생물 안전성 레벨 4 실험실 제한되어 감염성 바이러스 에볼라 작업. 라이프 사이클 모델링 시스템 모델 바이오 안전성 수준이 조건에서 바이러스 라이프 사이클; 그러나, 최근까지 이러한 시스템은 바이러스 라이프 사이클의 각각의 측면, 또는 하나의주기 감염성 하나에 한정되어왔다. 형태 형성에 관여 Tetracistronic 에볼라 바이러스 비 코딩 영역, 리포터 유전자로 구성 minigenomes, 세 에볼라 바이러스 유전자, 신진 및 엔트리 (VP40, GP 1,2 및 VP24)는, 복제와 전사를 생성하기 위하여 사용될 수있다 이 minigenomes를 포함 -competent 바이러스 입자 (trVLPs). 이 trVLPs는 지속적으로 세포가 에볼라 표현 감염시킬 수 있습니다우리가 안전하게 바이오 안전성 수준이 조건에서 여러 감염주기를 모델링 할 수 있도록 게놈 복제 및 전사에 대한 책임 바이러스 단백질. 중요한 것은,이 시스템의 바이러스 성 성분은 단독으로 (한, 예를 들면, pseudotyped 바이러스를 사용하는 시스템의 경우), 및 VP40, GP 2 및 VP24은이 시스템에서 과발현되지 않은 다른 바이러스로부터 에볼라 바이러스에서 파생되지 , 형태 형성을 공부 같은 게놈 복제 및 전사와 같은 바이러스 라이프 사이클의 다른 측면은이 시스템을 모델링 할 수 있지만, 신진 및 항목이 이상적으로 적합하다. 따라서, tetracistronic trVLP 분석은 에볼라 바이러스에 대한 가장 포괄적 인 라이프 사이클 모델링 시스템을 나타내며, 미래에 에볼라 바이러스의 생물학을 연구에 사용하기위한 엄청난 잠재력을 가지고있다. 여기서, 우리는이 시스템의 사용에 대한 상세한 정보뿐만 아니라,의 기대 결과를 제공한다.
Introduction
에볼라 바이러스는 인간의 발생 일에서 최대 90 %의 치사율을 가진 인간과 인간이 아닌 영장류에 심각한 출혈열의 원인균이다. (2,3 검토) 백신뿐만 아니라 특정 치료법 개발에 최근 몇 년 동안 상당한 진전이 있었다 있지만, 이러한 인간의 사용이 승인되지 않습니다. 에볼라 바이러스 입자는 약 1 μM의 길이와 같은 특성 실 모양 및 96-98 내지 (4)의 직경을 갖는다. 뉴 클레오 캡시드 형태 바이러스 입자의 코어는과 7 ebolavirus 유전자를 인코딩 한) 비 분절 본쇄 네거티브 센스 RNA 게놈 (도 1) 게놈 encapsidates, 2) 핵 단백질 NP, 3 이루어져 ) 폴리머 L 및 보조 인자의 VP35 이루어진 바이러스 중합 효소 복합체, 4) 전사 활성제 VP30. 또한, 최근의 VP24 단백질은 또한 뉴 클레오 캡시드와 관련되는 것으로 나타났다의 사. 뉴 클레오 캡시드는 형태 형성 및 비리 온의 출아 책임이 매트릭스 단백질 VP40은, 위치하는 행렬 공간에 의해 둘러싸여있다. 바이러스 입자는 더 포위하고, 비리 첨부 파일 및 항목에 대한 책임이있는 유일한 표면 단백질 GP 1, 2, 즉 봉투에 포함됩니다.
감염 에볼라 바이러스에 대한 작업은 전 세계적으로 몇 가지 시설이 작업을 제한 바이오 안전성 수준 (BSL) 4 조건에서 최대 봉쇄 실험실에서 수행되어야한다. 이들 바이러스의 생물학을 연구하거나 BSL2 조건에서 신규 한 치료제를 개발하기 위하여 연구자들은 에볼라 바이러스 단백질의 재조합 과발현에 어느 의존, 또는 감염성 에볼라 바이러스의 부재와 함께 작동 할 수있다 둘주기 모델링 시스템에. 에볼라 바이러스 단백질의 재조합 발현 중 하나를 발현하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 얻을 수있다. 이 전략의 특별한 경우이며에볼라 바이러스 이외의 바이러스에 기초한 바이러스 입자 또는 바이러스 입자의 생성은 (가장 일반적으로 레트로 바이러스 또는 소포의 구내염 바이러스) 재조합의 존재는 연구하는데 사용될 수 pseudotyped 입자의 생성을 선도, GP 1,2 표명 항목 억제제 5 필로 바이러스 및 화면의 입력 과정. 또한, 자신의 당 단백질 대신 에볼라 바이러스 GP 1, 2를 인코딩 재조합 바이러스 (예를 들어, 수 포성 구내염 바이러스)가 생성 및 바이오 안전성 수준이 조건 6에서 바이러스 항목을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
주기 모델링 시스템은 초기의 cDNA로부터 제조 한 후 복제 및 트랜스로 제공 에볼라 바이러스 단백질에 의해 전사되는 절단 에볼라 바이러스 게놈 유사체 (minigenomes)의 사용을 특징으로 역 유전학 시스템의 형태이다. 에볼라 바이러스의 첫 번째 minigenome 시스템은 15 년 이상 전 7 개발, 이후 에볼라 바이러스 게놈 복제 및 전사 (8,9 검토)를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 시스템에서 에볼라 바이러스 게놈의 단자 비 코딩 영역에 의해 형벌 하나의 리포터 유전자로 구성된 monocistronic minigenome은 (T7의 RNA 중합 효소를 사용하여 일반적으로 전사에 의해) 포유 동물 세포에서 발현된다 (그림 1) (리더 및 트레일러라고도 함) 함께 바이러스 단백질 L, VP35, VP30과 순이익와. minigenome는 NP에 의해 encapsidated 한 다음 복제 및 바이러스 라이프 사이클 (그림 2)의 두 가지 측면을 반영 기자 활동을 선도, 지도자 및 트레일러 현지화 시스의 연기 신호를 사용하여 다른 뉴 클레오 캡시드 단백질에 의해 전사한다.
고전 minigenome 시스템을 기반으로 바이러스와 유사한 입자 (trVLP) 시스템이 개발되었다 바이러스 라이프 사이클, 전사 및 복제 능력의 추가 단계를 모델링되지만 마련되어 위해서는발현 플라스미드 10,11부터 다른 바이러스 단백질 VP24, VP40 및 GP 1,2 뉴 부가 식. VP40의 존재는 그들의 표면 상에 GP 1,2 곰 trVLPs의 형성에 이르게하고, 내부에 함유 minigenome 뉴 클레오 캡시드를 나른다. 이러한 trVLPs 순진한 표적 세포를 trVLPs 11 내의 표적 세포하게 minigenomes의 복제와 전사를 용이하게하기 위해 하나 L, VP35, VP30 및 NP에 대한 발현 플라스미드와 pretransfected 된 표적 세포를 감염시키는 데 사용, 또는 아르 수 (즉 에볼라 바이러스 단백질의 플라스미드 기반의 표현) 10 않고. 이것은 제조자 세포, 형태 형성 및 trVLPs의 신진, 표적 세포로 그들의 항목 minigenomes의 복제를 반영 표적 세포에서 리포터 활동 결과, 1) pretransfected 표적 세포의 경우에도 복제 및 이차 전사 (게놈 바이러스 단백질의 자극에 의해, 즉 전사uced) 표적 세포의 표적 세포에, 또는 2)과 같은 순 trVLPs 표적 세포 내 표적 세포하게 바이러스 단백질) (도 3)에 의해 차 전사 (즉, 전사의 경우에. 이들 단백질은 게놈 복제의 강한 네거티브 레귤레이터 것으로 도시 되었기 때문에 중요한 것은,이 시스템은, 하나의 감염성 사이클 모델 및 VP24 및 VP40의 경우에 특히 문제가되는 모든 바이러스 단백질의 과발현에 의존하는데 사용되어왔다 및 전사 플라스미드 (12, 13)에서 과발현 때. 또한, 이러한 시스템에서 생산 trVLP 제제는 전염성 trVLPs (14)의 생화학 적 분석을위한 도전을 포즈, 비 감염성 입자의 높은 비율을 포함합니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 최근 리포터 유전자에 더하여, 또한 VP40, GP 및 1,2 인코딩하는 유전자를 포함 tetracistronic minigenome 시스템을 개발VP24 (그림 1). 고전 monocistronic minigenome 시스템과 마찬가지로,이 시스템은 (그림 4) 15 표적 세포를 감염시킬 수 있습니다 trVLPs의 생산 효율을 높일 수있다. 그러나, 고전 minigenome 시스템 달리, VP40, GP 1,2 및 VP24 오히려 플라스미드에서 과발현되는 것이 아니라 바이러스 게놈의 전사 이후에 일어난다. 결과적으로, 이들 단백질의 속도론 및 발현 수준은 훨씬 더 가깝게 바이러스 라이프 사이클 동안 발견들을 모방하고, 따라서 비 감염성 trVLPs 감염성의 비는이 시스템 (15)에 약 500 배 증가된다. 또한,이 시스템을 이용하여 연속적 통로 tetracistronic minigenome 함유 trVLPs을 여러 감염성 사이클을 모델링하는 것이 가능했다. 이와 같이, tetracistronic trVLPs 현재 BSL2 조건에서 에볼라 바이러스 생물학을 연구하는 데 사용할 수있는 가장 포괄적 인 라이프 사이클 모델링 시스템입니다. 여기에, 우리는 사용 O에 대한 자세한 정보를 제공이 시스템 F뿐만 아니라, 예상 결과에.
Protocol
trVLPs의 초기 생산을위한 생산자 세포의 1 분할
- 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의의 L-글루타민, 및 1X 펜 / 패 혈성 높은 글루코스 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 2 주 형틀 (75cm의 293 개의 세포를 배양 한 80 ~ 90 % 합류로부터 DMEM10를 배지를 제거 ). 셀을 제거하지 않도록주의, 10 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻으하고, 셀에 2 ㎖의 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다.
- 현미경 (약 30 초)으로 관찰 할 때 세포가 상당한 라운딩을 표시 할 때까지 실온에서 세포를 배양한다. 플라스크를 눌러 셀을 제거하고, 8 ml의 DMEM10를 추가합니다. 철저히 부드럽게 피펫 팅하여 세포를 재현 탁 및 다운 현미경으로 보았을 때 단일 세포 현탁액이 관찰 될 때까지.
- 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. DMEM10의 ML 당 2 × 10 5 세포에 세포를 희석. 피펫 아니라 당 6 웰 플레이트 (4 × 10에 세포 현탁액 2 ㎖물론 당 5 셀).
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어.
trVLPs의 초기 생산을위한 생산자 세포의 2 형질
- 24 시간 세포를 (실험 타이밍의 개요를 그림 5 참조) 분할 후, 피펫 플라스미드 DNA 15 필터링 된 정보를 사용하여 cryovial 멸균이 ML에 (양에 대한 표 1 참조). DNA에 잘 당 100 μL의 OptiMEM를 추가합니다. 잠시 혼합물 와동 부드럽게 미세 원심 분리를 이용하여 튜브를 스핀 다운. 여러 웰 동일한 플라스미드로 형질 감염 될 경우, 여러 우물 mastermix이 이루어질 수있다.
- 간단히 사용하기 전에 교통 LT1을 유리 병을 소용돌이. 희석 된 DNA에 잘 당 7.5 ㎕의 교통 LT1를 추가합니다. 부드럽게 cryovial의 뚜껑에 액체를 수집 않도록주의하면서, 혼합물을 와동, 실온에서 15 분 동안 배양한다.
- 조심스럽게 형질을 혼합로 pipetting 아래로하여 복잡한. 적하 각 웰에 형질 단지의 100 μl를 추가합니다. 전방 / 후방 플레이트 락 측면에서 형질 단지를 배포하는쪽으로. 이 같은 접시를 소용돌이하지 마십시오 형질 단지의 언밸런스의 원인이됩니다.
- 인큐베이터에 세포를 돌려줍니다.
- 24 시간 후, 세포의 상층 액을 제거합니다. 5 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 세포에 1X 펜 / 연쇄상 구균 (DMEM5)와 4 ML의 DMEM을 추가합니다. 이 단계는, 교차 오염이 문제가 될 수있는 웰 인해이 시스템 trVLPs의 자기 증폭 특성으로, 그렇지 않으면 (동일한 샘플을 포함 가정 웰 건조없이 한번에 최대 3 개의 웰에 대해 수행 될 수 있고, 이 단계) 한 번에 하나의 잘 이루어져야한다.
- 인큐베이터에 세포를 돌려줍니다.
표적 세포의 3 준비
- 잘 당 2 ㎖의 DMEM10에 4 × 10 5 세포를 파종, 1 절에 설명 된대로 293 세포를 분할6 웰 플레이트.
- 표적 세포의 분열 후 24 시간과 24 시간 전에 감염은 DNA를 사용하여 섹션 2에 기재된 바와 같이 형질 표적 세포는 표 1 양 및 웰당 4.5 μL 트랜짓 LT1.
생산자 세포의 표적 세포와 수확의 4 감염
- 15 ml의 튜브에 생산 세포의 상층 액을 전송합니다. 제거하고 진공 호스를 사용하여 남아있는 상층 액을 제거한다. 세포에 250 ㎕의 글로 용해 버퍼를 추가합니다.
- 800 XG와 실내 온도에서 5 분 동안 원심 분리 상층 액은 세포 파편의 샘플을 취소합니다.
- 표적 세포의 한 우물에서 뜨는을 제거합니다. 조심스럽게 느린 피펫 속도를 사용하여 세포를 대상으로 클리어 생산 세포 상층 액 3 ㎖를 추가합니다. 세포 단층을 방해하지 않기 위해 세포에 직접 피펫 팅 피한다. 이 단계는 한번에 하나의 잘 이루어져야한다.
- 모든 샘플은 트랜스 되었으면ferred는 표적 세포의 침강 trVLPs의 감염을 허용하는 인큐베이터에 표적 세포를 반환.
- 글로 용해 완충액에서 실온에서 15 분간 인큐베이션 한 후 150 μL로 설정 마이크로 피펫을 사용하여 용해 완충액에서 생산자 세포를 재현 탁하고, cryovial 2 ㎖ 중에 샘플을 전송. 6 절에 설명 된이 시점에서, 용 해물은 -80 ° C에 냉동, 또는 직접적으로 측정 될 수있다.
- 감염 후 24 시간은 표적 세포에서 뜨는을 제거합니다. 세포에 4 ㎖의 DMEM5 당 잘 추가합니다. 이 단계는 웰 인해이 시스템 trVLPs의 자기 증폭 특성상 달리 동일한 샘플 (함유하는 경우, 교차 오염이 문제가 될 수 있으며, 한 번에 최대 세 개의 웰에 대해 수행 될 수 있으며,이 단계는되어야 한번에 하나의 잘 수행).
단일 사이클 감염에 대한 표적 세포의 5 수확
- 경우에만 하나의 감염 사이클은 감염 제거 t 후 72 시간에서 평가되어야한다고 진공 호스를 이용하여 표적 세포에서 상징액.
- 생산자 세포 4 절에 설명 된대로 250 ㎕의 글로 용해 버퍼에있는 세포를 수확.
(6) 수확 대상의 세포와 trVLPs의 연속과 Passaging
- trVLPs 연속적 계대되어야한다면 그들이 표적 세포 (도 5 참조) 상기 제 1 세트의 감염 감염 후 72 시간에 대한 준비가되어 있도록 섹션 3에 기재된 바와 같이, 표적 세포의 새로운 세트를 준비한다.
- (프로듀서 세포 대신에 표적 세포들의 제 1 세트를 사용하여) 제 4 항에 기재된 바와 같이 표적 세포의 새로운 세트를 감염.
- 다음 단계마다 72 시간을 반복합니다.
리포터 활동의 7 분석
- 세포 용 해물이 고정 된 경우, 그것들을 실온에서 해동. 샘플을 측정하기 전에 실내 온도에 도달했는지 확인하십시오.
- 레 닐라 저런 형광 분석 완충액 (이상적 냉동 내가 필요한 양의 (샘플 당 40 μl를) 해동실온에서 N 분량 씩). 버퍼가 측정 전에 실온에 도달했음을 확인합니다.
- 레 닐라 저런 형광 시약을 얻기 위해 레 닐라 저런 형광 분석 버퍼에 레 닐라 글로 기판의 1/100 번째 볼륨을 추가하고 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 피펫 백색 96 - 웰 플레이트에 레 닐라 글로 시약 40 μL.
- 레 닐라 저런 형광 시약에 시료 40 μl를 추가합니다. 이어서, 10 분을 기다린 1 초의 적분 시간을 사용 루미에 샘플을 측정한다.
Representative Results
발현 플라스미드는 에볼라 바이러스 뉴 클레오 캡시드 단백질 NP, VP35, VP30, 그리고 L, 72 시간 (그림 6에서 쉽게 감지 할 수 tetracistronic minigenome 및 minigenome 복제 및 전사 및 기자 활동의 액세서리 T7 폴리머 결과를 인코딩 293 생산 세포의 형질 ). 중요한 관찰 리포터 활성 (10 5.6 상대 발광 단위 (RLU))는 초과하는 발현 플라스미드 부호화 L 이상이 로그에 의해 형질 감염 (103 RLU)에서 생략 된 음성 대조군의. 심지어 L의 부재에서 관찰 활동의 낮은 수준으로 인해 minigenome 플라스미드의 암호 같은 프로모터 가능성이 높습니다. 생산자 세포에 비해 생산 세포의 상등액으로부터 trVLPs 감염된 표적 세포는 실제로 다소 리포터 활성의 증가 된 수준을 보여주고, 숫자가 통로에 따라, 10 6 및 10 7 RLUs 사이에 도달한다. 한편, w-L 제어 프로듀서 세포의 상등액은 표적 세포 상에 계대된다 암탉 (L 포함한 모든 뉴 클레오 캡시드 단백질을 발현)는, 리포터 활성을 루미 노 (약 10 미터 RLU)의 배경 잡음을 초과하지 않는다.
tetracistronic trVLP 분석은 에볼라 바이러스의 라이프 사이클을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, trVLPs와 293 세포의 감염은 이러한 세포에 트랜스로 제공해야하는 등 1 팀-16 등 부착 인자의 존재에 의존한다. 따라서 tetracistronic trVLP 분석에서 약 100 배의 표적 세포에서 리포터 활성의 저하는 팀-1 (도 7A)의 부재하에 관찰된다. 바이러스 라이프 사이클에서 특정 (바이러스 또는 세포) 단백질의 역할은 또한 이러한 접근 방식과 함께의 RNAi 기술을 사용하여 평가할 수있다. 예로서, L의 중심 역할을 반영하는, 약 100 배의 리포터 활성의 드롭 다운 - 레귤레이션 L 결과는 RNAi를 매개복제와 전사 (그림 7B) 7. 또한, 직접 바이러스 라이프 사이클에서 돌연변이의 영향을 평가하기 minigenome를 조작하는 것이 가능하다. minigenome부터 VP24-발현 개시 코돈의 바로 하류 3 정지 코돈을 도입함으로써 폐지 될 때 예를 들어, 프로듀서 세포에서 리포터 활성이 크게 변경되지 않는다; 그러나, 표적 세포에서 리포터 활성은 감염성 trVLPs (도 7c) (15)의 생산에 VP24의 역할을 나타내는 하나의 통로 및이 통로 후 400 배 후 약 20 배만큼 감소된다.
에볼라 바이러스 게놈뿐만 아니라 monocistronic 및 tetracistronic minigenomes의 그림 1 구조. 에볼라 바이러스 단백질에 대한 영역을 코딩은 NP (빨간색으로 표시됩니다VP35, VP30, 그리고 L), 노란색 (VP40과 VP24) 또는 파란색 (GP 1,2) 상자. 비 코딩 영역 (의 NCR)은 표시된 리더 및 트레일러 지역으로, 녹색으로 표시됩니다. 첨자는 바이러스 NCR은 코딩 영역의 시청에 사용 된 나타냅니다. 기자 (담당자)에 대한 코딩 영역은 보라색으로 표시됩니다.
그림 2 Monocistronic의 minigenome 분석. 세포 에볼라 바이러스 뉴 클레오 캡시드 단백질을 발현하는 플라스미드 (NP, VP35, VP30, L), monocistronic minigenome (MG)와 T7 폴리머로 형질 있습니다. minigenome는 처음에 다음 NP (b)에 의해 encapsidated되는 바이러스 게놈 (vRNA와)과 동일한 방향 unencapsidated minigenome의 RNA로 T7 폴리머 (a)에 의해 전사된다. 이 vRNA와는 보완 minigenome의 RNA를 통해 복제 encapsidated (cRNA를) 중간체ediate (c) 다음 리포터 단백질 (E)로 번역되는 mRNA를 리포터 (D)로 전사.
monocistronic minigenome와도 3 trVLP 분석은. 세포 minigenome 분석 성분에 대한 발현 플라스미드 (에볼라 바이러스 뉴 클레오 캡시드 단백질 NP, VP35, VP30, L, monocistronic minigenome 및 T7 중합 효소)뿐 아니라 VP40, GP 1로 형질 , 2 및 VP24. 이것은 minigenome 함유 뉴 클레오 캡시드 (F)를 포함 trVLPs의 형성을 이끈다. 어느 기자의 표현 (E) 또는 순진 선도 복제 및 보조 전사 (D)의 결과로, NP, VP35, VP30, 그리고 L (위)에 대한 발현 플라스미드로 pretransfected 아르 다음 표적 세포를 감염시킬 수 이러한 trVLPs (g) 최소의 차 전사 결과 표적 세포 (하단)igenomes (H)는, 또한 기자의 표현 (전자)로 이어지는.
그림 tetracistronic minigenome와 4 trVLP 분석. 세포 에볼라 바이러스 뉴 클레오 캡시드 단백질을 발현하는 플라스미드 (NP, VP35, VP30, L), tetracistronic minigenome (MG)와 T7 폴리머로 형질 있습니다. 초기 전사 (a), 이입 (b), 게놈 복제 (c) 및 전사 (D)뿐만 아니라, 변환 (E) monocistronic minigenome 분석에서와 같이 발생한다. 그러나 리포터 mRNA를 이외에,이 mRNA를 VP40 들면 1,2 GP 및 VP24도 trVLPs의 형성의 결과로, tetracistronic minigenome로부터 전사된다 (F). 이러한 trVLPs은 뉴 클레오 캡시드 단백질 NP, VP35, VP30 및 L뿐만 아니라 셀룰러 에볼라 바이러스 발현 플라스미드로 pretransfected 된 표적 세포를 감염부착 계수 팀-1, 신선한 표적 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 trVLPs 게놈의 복제 및 전사, 및 생산의 결과.
3 연속 구절 tetracistronic trVLP 분석의 그림 5 타이밍. 세포에게 세포와 trVLPs (H)의 (I), 중간 변경 (c) 및 수확, (들) 세포를 파종 형질 세포 (t), 감염의 일입니다 세 개의 연속 통로 적응증 (화살표로 표시).
tetracistronic trVLP 분석에서 관찰 기자 활동의 그림 6 일반적인 수준. tetracistronic trVLP 분석은 protoc 다음과 같은 다섯 구절을 통해 수행되었다올이 논문에서 설명했다. 네거티브 대조군으로서 발현 플라스미드 부호화 L은 P0 프로듀서 세포의 형질 감염으로부터 (- L)을 생략 하였다. P5는 루미의 배경 잡음이 점선으로 표시되어 L. 포함한 모든 뉴 클레오 캡시드 단백질에 대한 발현 플라스미드로 형질 감염시켰다에 통로의 표적 세포 (P1). 수단 및 3 독립적 인 실험에서 네 생물은 복제의 표준 편차가 표시됩니다.
tetracistronic trVLPs를 사용하여 바이러스 라이프 사이클에 대한 다양한 바이러스 및 세포 인자의 영향을 평가도 7. 팀-1과 같은 부착 요소 (A). TET에 감염되었다 뉴 클레오 캡시드 단백질과 함께 또는 (15에 기재되어 있음) 팀-1 플라스미드 인코딩없이 인코딩 발현 플라스미드로 pretransfected 된 표적 세포racistronic trVLPs. P1 표적 세포에 72 시간 후 감염 리포터 활성을 측정 하였다. 수단 및 4 독립적 인 실험에서 네 생물은 복제의 표준 편차는. (B) 효과 게놈 복제 및 전사에 L의의 RNAi 최저로 표시됩니다. 향한 뉴 클레오 캡시드 구성 요소에 대한 발현 플라스미드로 pretransfected 된 표적 세포, 팀-1과의 miRNA를 L (항-L) 또는 (15에 기재되어 있음) 비 관련 단백질 (항-GFP)을 tetracistronic trVLPs 감염시켰다. P1 표적 세포에 72 시간 후 감염 리포터 활성을 측정 하였다. 수단 및이 독립적 인 실험에서 5 생물은 복제의 표준 편차가 표시됩니다. (C) 효과 돌연변이의 trVLP의 감염에 minigenome에. tetracistronic trVLP 분석이 야생형 minigenome (4cis-WT) 또는 minigenome에서를 사용하여 수행 하였다 3 정지 코돈은 표현 (을)를 폐지, VP24의 시작 코돈 직후에 소개 되었었던F 단백질이 있지만, P0, P1과 P2의 길이 등, 핵산 조성물, 이차 리포터 구조 활동에 관해서 minigenome에 최소한의 변화를 도입하는 형질 감염 / 감염 후 72 시간을 측정 하였다. 수단 및 3 독립적 인 실험에서 3 생물은 복제의 표준 편차가 표시됩니다.
| 생산자 세포 (P0) | 표적 세포 (P1 이상) | |
| 는 pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| 는 pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| 는 pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1000 | 1000 | |
| p4cis-vRNA와-RLuc | 250 | - |
| 는 pCAGGS-T7 | 250 | - |
| 는 pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
표 1은 DNA 형질 금액. 제조자 및 표적 세포의 형질 전환에 필요한 각 플라스미드의 양을 6 - 웰 플레이트의 웰당 NG에 도시된다. 모든 플라스미드는 와트 등 15에 설명되어 있습니다.
Discussion
이 논문에 기술 된 tetracistronic trVLP 분석은 여러 감염 사이클을 통해 에볼라 바이러스 라이프 사이클의 모델링을 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 시스템에서 생산 trVLPs 함께 에볼라 바이러스 게놈의 약 60 %를 구성하고 바이러스 복제에 필수적인 뉴 클레오 캡시드 단백질 NP, VP35, VP30, 그리고 L에 대한 유전 정보를 포함하지 않습니다. 오히려, 이들 단백질은 발현 플라스미드로부터 트랜스에 표적 세포에 제공 될 수 있고,되지 않은 단백질의 모든 4를 발현하는 세포의 임의의 감염은 불완전하다. 중요한 것은, 필로 바이러스에 대한 유전자 재조합의 증거가없고, tetracistronic minigenome 및 뉴 클레오 캡시드 단백질에 대한 발현 플라스미드간에 공유 더 상동 영역은 없다. 따라서, 실질적인 증거도 다음 잠재적으로 발생할 수 있습니다 생성 전체 길이 에볼라 바이러스 게놈의 가능성을 제공 할 수있는 이론적 근거도있다BSL2 조건에서 사용하기위한 시스템이 안전하게 사용할 감염성 에볼라 바이러스의 생산.
두 가지 중요한 trVLPs의 생산 즉, 실험 조건에 의해 영향을 받는다 tetracistronic trVLP 분석의 단계,이 trVLPs와 표적 세포의 감염이 있습니다. trVLPs의 생산은 다시 높은 형질 전환 효율에 의존 minigenome 복제 및 전사, 높은 수준에 따라 달라집니다. 형질 감염 효능에 대한 용이 L 발현 플라스미드가 eGFP는를 코딩하는 발현 플라스미드로 교환되는 -L 제어를 포함하여 평가할 수있다. 이러한 조건 하에서 형질 전환 비율은 형광 현미경 24 시간 후 형질 감염으로 검사하여 50 %를 초과한다. 또한, 세포는 크게 minigenome 복제와 전사 (게시되지 않은 데이터)를 손상 우리의 경험의 마이코 플라즈마 오염에 있기 때문에, 마이코 플라스마가 없어야합니다. 때문에 높은 transfectability 293 CE에LLS는 trVLP 분석에 대한 선택의 세포주이다; 그러나, 이러한 세포는 에볼라 바이러스 16 감염에 (완전히 굴절되지이기는하지만) 상대적으로 저조한 취약하다. 이러한 팀-1과 같은 부착 인자의 발현 trVLPs와 293 세포는 약 100 배의 감염을 강화하고, 여러 통로를 통해이 시스템의 성공에 중요하다.
tetracistronic trVLPs가 스스로 자기 복제 아니지만, 그들은 뉴 클레오 캡시드 단백질을 발현하는 세포의 자기 복제이다. 이와 같이,주의 사항 (minigenome 다른 돌연변이 등) 다른 trVLPs을 포함 우물 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 만든해야합니다. 기술적 인 관점에서 사정이 분석 (약 4 로그)의 양극과 음극 사이의 신호에 큰 차이가, 샘플 사이의 크로스 토크 문제가 될 수 루시퍼 라제 활성을 측정 할 때; 그러나이 용이 각 샘플간에 하나의 빈을 떠나는 잘 회피 될 수있다루시퍼 라제 활성을 측정하기 위해 사용되는 96 - 웰 플레이트.
tetracistronic trVLPs 가능한 응용 프로그램의 다수가 있습니다. 감염성 trVLPs 필로 바이러스 감염성 (14)의 전형적인 스레드 형 구조를 가지며, filovirus 입자와 같은 바이러스 성 성분을 함유 때문에 분명히, 그들은 filovirus 입자의 침입을 연구에 매우 적합하다. 경우처럼 pseudotyped 비리 또는 예컨대 GP 1,2를 발현하는 재조합 수 포성 구내염 바이러스 등의 레트로 바이러스 GP 1,2 담지 입자, 또는 재조합 바이러스와 같은 바이러스 입자를 사용할 때 중요한 것은, 다른 바이러스의 성분을 포함하지 않는다 . 부착 인자에 대한 요구 사항이 시스템에서 표적 세포로서 293 세포를 사용하여,위한 스크린으로 이용하고 부착 인자의 역할을 조사 할 수 있지만, 이러한 게놈 복제와 전사에 관여하는 것과 같은 다른 세포 인자의 역할뿐만 아니라 형태 형성 및 봉오리딩은 RNAi의 기술을 사용하여 조사 할 수있다. 하나는 VP40, GP 1, 2, 및 VP24 동안 바이러스의 전사 후 발현 것을 명심해야하지만 바이러스 라이프 사이클에 바이러스 단백질의 돌연변이의 효과도 연구 할 수있다, 다른 바이러스 성 단백질의 발현은 발현에서 달성 플라스미드가되도록 의한 이들 단백질의 과발현에 대한 영향이 고려되어야한다. 또한, 치료는 리포터 활성을 직접 minigenome 길이 (15)에 의해 영향을받지 않기 때문에 minigenome 돌연변이가 크게 minigenome의 길이를 변경하지 않도록주의해야한다. tetracistronic minigenomes 바이러스 성 유전자를 운반하고, 바이러스 성 중합 효소 복합체에 의해 복제 된 바이러스 게놈 유사체이기 때문에 마지막으로, 또한 BSL2 조건 하에서 돌연변이에 응답하여 이들 유전자의 진화를 연구 할 수 있어야한다. 추가적인 연구가 여전히 필요하다 방향하면서 따라서, 그것이 가능해야한다, 예를 들어, 차선의 소개minigenome 다음 통로 trVLPs 내에서 유전자의 돌연변이는 무료 돌연변이가 나타날 때까지.
명심해야 tetracistronic trVLP 분석의 한 가지 제한은 모델 바이러스 라이프 사이클의 대부분, 표적 세포의 일차 전사는 표적 세포가 트랜스의 뉴 클레오 캡시드 단백질을 발현 할 필요가 있기 때문에,이 시스템에 의해 모델링되지 않은 상태라는 사실이다 trVLPs 복제하기 위해서는. 일차 전사는 평가되어야하는 경우, 순 표적 세포 (10)를 사용하는 것이 가능하다; 그러나,이 경우에는 게놈 복제는 표적 세포에서 발생하지 않으며, 더 감염성 trVLPs는 감염을 중단, 생성되지 않는다. 이것은 사실상의 감염성 재조합 에볼라 바이러스로 만들어 놓을 것이다 minigenome에 뉴 클레오 캡시드 단백질 유전자를 포함하여 완전히 자기 복제를 trVLPs 렌더링없이 극복 할 수없는 주요 문제입니다. 사실, Ebol루시퍼 라제 리포터 등이 생성되었고 평가하고 게놈 복제 및 전사 (17, 18)을 연구하기 위해 이용 될 수있는 바이러스 발현; 그러나, 자신의 사용은 BSL4 실험실로 제한됩니다. 또한,이 VP40, GP 1, 2, 및 VP24 동안, 바이러스 게놈 아날로그에서 minigenome에서의 위치를 표현하는 것을 염두에 두어야한다 (2 차, 3 차, 4 차 전사 단위)와 동일하지 않습니다 서로에 대해 절대 발현 수준뿐만 아니라 상대적인 발현 수준에 영향을 줄 수있는 바이러스 게놈에서의 위치 (3 차, 4 차, 6 차 전사 부).
전반적으로, tetracistronic trVLP 분석은 날짜에 사용할 수 에볼라 바이러스에 대한 가장 포괄적 인 라이프 사이클 모델링 시스템을 나타내고, 첨부 파일 및 EN뿐만 아니라, 게놈 복제 및 전사, 입자 형태 형성 및 신진의 모델링을 할 수 있습니다여러 감염 사이클을 통해 표적 세포에보십시오. 따라서, 그것은 BSL2 조건 에볼라 바이러스의 생물학을 연구에 사용하기 위해 상당한 잠재력을 가지고있다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 밥 피셔 (LV, DIR, NIAID, NIH), 해설자로 활동뿐만 아니라 오스틴 Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH)와 메간 모건 (DOHS, ORS, OD, NIH)에 대해 매우 감사하고 있습니다 이 원고를 함께 제공되는 영화를 만드는 그들의 도움. 또한, 우리는 원고의 중요한 읽기 앨리슨 Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH)에 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH, NIAID의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
